Bu çalışma AB projesi PATROLS (Gerçekçi nanomalzeme tehlike aSsessment için Fizyolojik Bağlantılı Araçlar) ve Hollanda Sağlık, Refah ve Spor Bakanlığı (proje V/050012) tarafından finanse edilmektedir. Dr. Yvonne Staal ve Dr. Jan van Benthem'e makaleyi eleştirel bir şekilde inceledikleri için teşekkür ederiz.

1. Hücre kültürü ortamının hazırlanması (CCM)
<ol><li>Glutamin ile desteklenmiş 500 mL minimum esansiyel ortam (MEM) şişesi hazırlayın.</li>
	<li>5 mL penisilin-streptomisilin ekleyin (yani, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisilin).</li>
	<li>5 mL esansiyel olmayan amino asit (NEAA) çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>10 mL amfoterikin B ekleyin (isteğe bağlı).</li>
	<li>50 mL FBS ekleyin (ısı inaktive, ısı inaktivasyonu için lütfen ATCC protokolünü izleyin; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, sayfa 19)).</li>
</ol>2. Calu-3 hücrelerinin alt kültürü
NOT: Calu-3 hücreleri T75 veya T175 hücre kültürü şişelerinde 37 °C ve% 5 CO2'dekültürlenir. Hücreler her 7 günde bir %60-80 oranında, CCM yenilemesi ile her 2-3 günde bir geçiştirilir. CCM dökülür ve taze CCM (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL ve T175 = 25 mL) şişeye borulanır ve şişe tekrar inkübatöre yerleştirilir. Hücreler çözdükten sonra, deneylerde kullanmadan önce veya donmadan önce en az 2 kat geçmeli ve toplamda en fazla 25x geçilmelidir.
<ol><li>Hafif bir mikroskop altında kontrol ingerek şişenin % 60-80 bir arada olup olmadığını onaylayın.</li>
	<li>CCM'i şişeden dökün.</li>
	<li>Hücreleri 5 mL 1x Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile kalsiyumsuz ve magnezyumsuz 2x yıkayın. Her yıkamadan sonra HBSS'yi atın. HBSS, tripsin inhibe eden serumu çıkarır.</li>
	<li>Bir T75 için 3 mL tripsin-EDTA ekleyin (T175 için 4 mL) ve şişeyi 37 °C'de inkübatöre ve 10-15 dakika boyunca% 5 CO2'ye yerleştirin. 10 dakika sonra kontrol edin, hücrelerin şişe yüzeyinden ayrıldığından emin olun. Hücrelerin %0,05 trypsin kullanılarak ayrılmayacakları ve %0,25 trypsin kullanılabileceği durumlarda hücreler %80 izne çıkar.</li>
	<li>Şişeye 6 mL (yani, başlangıçta eklenen tripsin-EDTA hacminin iki katı) ekleyin ve uygun karıştırmayı sağlamak için şişeleri hafifçe sallayın. Bu, tripinin CCM'deki FBS tarafından nötralize edildiğini ve hücreler üzerindeki aktivitesinin durdurulduğunu sağlamaktır. Tripsin'in hücrelerle çok uzun süre temas halinde kalmasına izin verilirse, yeni bir hücre kültürü şişesine konduğunda yeniden bağlanmazlar.</li>
	<li>Şişenin tüm içeriğini 50 mL santrifüj tüpüne dökün.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 130 x g'dasantrifüjün doğru dengelenmesini sağlayın.</li>
	<li>Hücreleri içeren şişeyi aseptik koşullara geri döndürün ve peleti bozmadan süpernatantı nazikçe çıkarın. Süpernatant dökülebilir ve geri kalanı pipetle kapatılarak peletin bozulmaması sağlanır.</li>
	<li>Tüm hücreler askıya alınana kadar (yani, pelet veya hücre aglomeraları gözlenmedi) yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini 1 mL CCM'de yeniden depolar. Hücre süspansiyonu seyreltmek için ek CCM eklenebilir.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak 1 mL CCM'de hem ölü hem de canlı hücreleri sayın. Doğru sayım için gerekirse, hücreleri 3 veya 4 mL'de seyreltin.</li>
	<li>Hücreleri gerekli CCM hacmine askıya alın ve hücre süspansiyonu her şişeye ekleyin. Bir haftada yaklaşık% 80 izdiah elde etmek için, bir T75'teki tohum 2 x10 6 hücre veya bir T175'teki 6 x10 6 hücre.</li>
	<li>Şişeyi hafifçe sallayın ve ardından 37 °C ve% 5 CO2'deinkübatöre geri yerleştirin.</li>
	<li>Her 2-3 günde bir taze CCM ve hücreler %60-80 izdiah süresine ulaştığında alt kültür ile değiştirin.</li>
</ol>3. Calu-3 hücrelerini kültür kesici uçlarına tohumlama
NOT: Kesici uçlar farklı gözenek boyutlarıyla mevcuttur. Küçük gözenek boyutları (örneğin, 0,4 μm), hücrelerin daha kolay büyümesi ve Trans Epitel Elektrik Direnci (TEER) ile ölçüldüğü gibi, su altında 5 gün kültlemeden sonra zaten iyi bir bariyer elde etme avantajına sahiptir. Bununla birlikte, parçacık translokasyonu ile ilgilendiğinde, bu gözenekler çok küçüktür ve parçacıkları hapsedecektir. Bu nedenle, parçacıkları test etmek için genellikle daha büyük gözenek boyutları (örneğin, 3 μm) seçilir. Daha büyük bir gözenek boyutu kullanırken, hücrelerin iyi bir TEER elde etmek için daha uzun zaman aralıklarına (örneğin, su altında 7-10 gün kültleme) ihtiyacı vardır.
<ol><li>2.1–2.10 adımlarını izleyerek hücre süspansiyonu bilinen konsantrasyonla hazırlayın.</li>
	<li>6 iyi kesici uç için önceden ısıtılan CCM'de hücreleri 5 x10 5 hücre/mL konsantrasyonda seyreltin veya 12 kuyu kesici uç için2,5 x 10 5 hücre/mL.</li>
	<li>Kesici uçlu bir hücre kültürü plakası alın ve aseptik koşullar altında yerleştirin.</li>
	<li>Beşayıl tarafı 6 kuyu kesici uç için 2 mL önceden ısıtılmış CCM veya 12 kuyu ucu için 1 mL ile doldurun. Kültür ortamını eklerken, cımbız kullanarak kesici ucu dışarı alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleme ile dikkatlice karıştırın. 0,4 μm gözenekli hücre kültürü kesici uçtaki zarın üstünde 6 kuyu kesici uç için pipet 1,0 mL ve 12 kuyu kesici ucu için 500 μL (100.000 hücre/cm2'ye eşdeğer). 3.0 μm gözenekler için hücre yoğunluğunu 128.000 hücre/cm2'yeçıkarın.</li>
	<li>Hücre kültürü plakasını örtün ve 37 °C ve% 5 CO 2'de kuluçkayayatırın.</li>
	<li>CCM'i her 2-3 günde bir değiştirin.</li>
	<li>ALI'de kültüre devam etmeden önce hücrelerin su altında 7 gün boyunca bir araya gelmesine izin verin.</li>
	<li>TEER'i ölçün.<ol>
<li>Chopstick Elektrot Seti ile desteklenmiş bir Epitel Voltohmmeter alın ve pil sistemini gece boyunca şarj edin.</li>
		<li>Voltohmmeter'ı şarj cihazından çıkarın ve çubuk elektrot'u bağlayın.</li>
		<li>Elektrot%70 etanol ile temizleyin.</li>
		<li>Elektrodu, yemeğin dibine değene kadar dış kültür ortamına koyarak ve daha kısa elektrodu zara dokunmadan ortama koyarak CCM'ye yerleştirin.</li>
		<li>Hücresiz boş bir kesici uçla başlayın. Ölçüm stabilize olana kadar bekleyin ve Ohms'daki direnci yazın. Bu ölçüm, kesici uç zarının herhangi bir hücresi olmadan (yani boş direnç) direncidir.</li>
		<li>Her kesici uç için ölçümü tekrarlayın ve gerçek direnci elde etmek için boş direnci çıkarın.</li>
		<li>Veri analizi için, direnç değerlerini kesici ucun yüzey alanıyla Ω x cm2'yeçarpın. 6 iyi kesici uç için yüzey alanı 4,67 cm2'dir. Bu nedenle, 600 Ohm'luk bir direnç ölçülürse ve arka plan 120 Ohm ise, direnç 480 Ohm'dir, bu da toplam2.241.6 Ohm xcm2 için 4.67 cm 2 yüzey alanı ile çarpılır. DEVAM ETMEK için TEER >1.000 Ω x cm2 olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCM'yi kesici uçların apikal tarafından çıkarın.</li>
	<li>Kuyunun bazolateral tarafına (yani hücre kültürü kesici ucunun altına) 6 kuyu için 2 mL önceden ısıtilmiş CCM ve 12 kuyu ucu için 1 mL ekleyin. CCM zara alttan dokunmalı, ancak kesici ucun üstüne sızmamalıdır.</li>
	<li>Bu noktada hücreler, ALI'de kültleme olarak adlandırılan havaya aptik olarak maruz kalırlar.</li>
	<li>Maruz kalmadan önce 7 gün boyunca 37 °C ve %5 CO2'de inkübatördeki ALI'deki kültür hücreleri.</li>
	<li>Bazolateral CCM'yi her 2-3 günde bir değiştirin. Hücreler ALİ'de 6 hafta boyunca kullanılabilir.</li>
</ol>4. Pozlama kurulumunu hazırlama
NOT: Bölüm 5-7, otomatik pozlama istasyonu kullanarak partikül maruziyeti için preparatları açıklar (AES, bkz. Malzeme Tablosu). Parçacık nebülizasyonu ve karakterizasyonu kurulumu, diğer üreticilerin diğer ALI maruz kalma sistemleriyle de uyumludur. Örnek olarak, parçacıklara maruz kalma aşağıda açıklanmıştır. Bu tür sistemler, duyarlılaştırıcılar, sigara dumanı ve dizel egzoz gibi diğer pozlamalar için de kullanılabilir. Şekil 1'de AES ve pozlama modülü gösterilir. Şekil 2, diğer tüm araçlar da dahil olmak üzere pozlama kurulumunun şematik bir gösterimini gösterir.
<ol><li>AES'yi kullanarak pozlamayı başlatmadan önce, aerosol özelliklerini ölçmek için sistemi birkaç cihaza bağlayın; bunlar aerosoller kabine girmeden hemen önce bir yan akışta ölçülür. NOT: Yan akışı pozlama karakterizasyon ekipmanına bağlamak için bir akış ayırıcı kullanılır. Genellikle, aşağıdaki ekipman kullanılır: tarama hareketliliği parçacık boyutlandırıcı (SMPS), optik parçacık boyutlandırıcı (OPS), yoğuşma parçacık sayacı (TBM), konik eleman salınımlı mikro denge (TEOM). SMPS ve OPS ölçümleri saatte 1 kat yapılır ve akış ayırıcıdan aynı boruyu kullanır. TBM ve TEOM sürekli ölçüm gerçekleştirir ve her ikisinden de gelen veriler bir Squirrel model 2020 veri kaydedicisinde günlüğe kaydedilir. Ek olarak, gravimetrik kütle konsantrasyonu kontrollü bağıl nemde bir mikro denge kullanılarak belirlenir (%40-70) ve sıcaklık (21–23 °C) koşulları. Teflon filtreler, maruz kalma konsantrasyonu doğrulamak için her pozlamadan önce ve sonra tartılmıştır. Egzozun yakalanması için HEPA filtresi kullanılır. Tasarlanmış nanomalzeme (ENM) süspansiyonlar ve nebülizör de dahil olmak üzere kurulum, insanlara maruz kalmayı önlemek için bir akış kabinine yerleştirilir. AES, metaller ve metal oksitler de dahil olmak üzere birçok farklı ENM türünü test etmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Pozlamadan kısa bir süre önce nanomalzeme süspansiyon hazırlayın. Genellikle% 1 süspansiyon stok çözümü olarak hazırlanır. Örneğin, 10 mL saf suda 100 mg nanomalzeme askıya alın. NOT: DQ12 maruziyeti için, yaklaşık 2 μg /cm2 elde etmek için 300 mg kullanılır. Bu miktar tek bir pozlamada kullanılabilir veya tekrarlanan pozlamalara bölünebilir (örneğin, 300 mg tek bir pozlama için 30 mL'de askıya alınır veya 21,5 mg 3 haftalık tekrarlanan maruz kalma için her gün taze olarak 2,15 mL'de askıya alınır). Süspansiyon her pozlama gününde yeni hazırlanır. Parçacık süspansiyonu, prob sonikasyonu kullanılarak 16 dakika boyunca sonicated edilir. %1 stok çözeltisinin hacmi saf su eklenerek toplam 100 mL hacme ayarlanır.</li>
	<li>Enm süspansiyonu, parçacıkların yerleşmesini önlemek için kapaklı ve manyetik karıştırıcılı küçük bir şişeye koyun. Şişeyi küçük bir tüple peristaltik bir pompaya bağlayın ve akışı 25 mL / s'ye ayarlayın.</li>
	<li>Peristaltik pompayı bir püskürtme nozülüne bağlayın ve sürekli aerosolizasyona izin vermek için ayarları yapın.</li>
	<li>Püskürtme nozülü 60 cm uzunluğunda bir alüminyum boruya monte edilir (karıştırma odası, çapı 15 cm, 60 °C'ye ısıtılır). Kurulum, AES'e 1,5 metre uzunluğunda bakır boru (çapı 15 cm) ile bağlanır. AES'in üstünde bir impactor, 2,5 μm'den büyük tüm aerosolleri kaldırır.</li>
	<li>Süspansiyonların nebulizasyonuna izin vermek için püskürtme nozulunu iki kütle akış kontrolörü (MFC) aracılığıyla 3 çubuk basınçlı havaya bağlayın. Sprey nozul için 14 L/dk'lik bir akış, diğer MFC ise tüpteki havanın karıştırılması için kullanılır.</li>
	<li>Maruz kalmanın başlamasından bir gün önce, kabinin 37 ° C sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için AES'yi açın.</li>
	<li>%85 neme ulaşmak için maruz kalma başlamadan 2 saat önce hava akışını ve kabindeki nemi açın. Hücrelerle kesici uçların yerleştirileceği maruz kalma odalarının ısıtılmasını açın.</li>
	<li>Kuvars mikro dengesini (QCM) açın ve yazılımı kullanarak başlangıç değerini 0 olarak ayarlayın. Günlüğe kaydetmeye başlayın. Her 10 sn'de bir kütle ölçülür ve ng/cm2olarak ifade edilir.</li>
	<li>Bir su banyosunda (~20-30 dk) hücre kültürü ortamını 37 °C'ye ısıtın.</li>
</ol>5. Calu-3 hücrelerini maruz kalmaya hazırlama
NOT: AES kullanarak tipik bir ALI pozlaması için, birleştiği hücre katmanına sahip 15-20 kesici uç gerekir. Bunlar 3 temiz hava kontrolü, AES'de maruz kalmadan diğer kesici uçlara benzer şekilde ele alınacak 3 inkübatör kontrolü, aerosol maruziyeti için 6-8 kesici uç (0, 1 veya 2 mikro denge kullanımına bağlı olarak), kontrol ölçümleri için 1-3 kesici uçtan (maksimum LDH salınımı gibi) ve bazı kesici uçların TEER'inin yeterli olmaması durumunda 3 yedek kesici uçtan oluşur. Hücrelerin devam etmesi için >1.000 Ω x cm2 TEER'i olmalıdır.
<ol><li>Maruz kalmanın ilk gününde, hücreleri CCM ile 1x yıkayın, hücre morfolojisini kontrol edin ve bir Voltohmmetre kullanarak hücre modelinin TEER'ini ölçün. Hücreler boşluksuz sıkı bir monolayer oluşturmalıdır.</li>
	<li>FCS'siz 2 mL/1 mL'lik HEPES tamponlu CCM'yi 6 kuyu/12 kuyu plakasının bazolateral tarafına koyun ve hücreli kültür kesici uçlarını yeni plakalara aktarın. NOT: Maruz kalma sırasında AES'de CO2 yoktur. Bu nedenle, taşıma ve maruz kalma sırasında HEPES tamponlu kültür ortamı (25 mM HEPES) kullanılır. Bu ortam hem AES'deki maruz kalan hücreler hem de inkübatör kontrol hücreleri için kullanılır.</li>
	<li>Hücre kültürlerini AES'ye taşıma süresinin 5 dakikadan fazla olması durumunda, hücreleri taşıma sırasında 37 °C'lik taşınabilir bir inkübatöre koyun.</li>
</ol>6. Pozlama sırasında AES'nin ele alınması
<ol><li>AES'de, fetal baldır serumu (FCS) olmadan maruz kalma modüllerini HEPES tamponlu CCM ile doldurun. CCM miktarı kullanılan birime ve hücre kültürü ekleme türüne bağlıdır. Hücreleri ALI'de tutmak için ortamın zarın dibine ulaşması gerektiğini, ancak zarın üstüne sızmaması gerektiğini unutmayın. 6 iyi kesici uç kullanırken, pozlama modüllerine 6 mL HEPES arabelleğe alınmış CCM ekleyin.</li>
	<li>Hücreli kesici uçları steril cımbız kullanarak plakalardan pozlama modüllerine aktarın. Hücrelerin bazolateral tarafında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin ve kesici uçların apikal tarafındaki herhangi bir CCM'yi çıkarın. Bazolateral tarafta bazı hava kabarcıkları olması durumunda, steril cımbızları kullanarak uçları çıkarılana kadar hafifçe çevirin. CCM içeren plakaları, maruziyetten sonra transfer için bir inkübatörde tutun.</li>
	<li>Pozlama süresini, hava akış hızını ve elektrostatik biriktirme geliştirmeyi seçmek için dokunmatik ekran kullanın. Ekran nem ve sıcaklığı kontrol etmek için de kullanılabilir. Genellikle, 37 ° C'deki kesici uçlarda 50 mL / dk akış hızı ve% 85 nem ile 4 saat maruz kalma süresi seçilir. NOT: Birinci seviyedeki modüller (Şekil 1) temiz hava maruziyeti için kullanılır; bu seviyedeki kesici uçlar temiz hava maruziyeti kontrolleri olarak kullanılır. İkinci ve üçüncü seviyedeki diğer modüller, çevrimiçi biriktirmeyi ölçmek için kuvars kristal mikro dengeleri (QCM) için iki modül de dahil olmak üzere aerosol maruziyeti için kullanılabilir.</li>
	<li>Sızıntı testi maruz kalmaya başlamadan önce yapılmalıdır. Sızıntının 5 mL/dk'dan az olması gerekir. AES ekranındaki yönergeleri izleyin. Sızıntı testi tamamlandığında, pozlama başlatılabilir. Bir sızıntı durumunda, boru kontrol edilmelidir.</li>
	<li>Pozlamanın sonunda, bir AES modülünün kapısını açın, pozlama modüllerini açın, hücre kültürü kesici uçlarını hücre kültürü plakalarına geri yerleştirin ve plakaları taşınabilir inkübatöre aktarın.</li>
	<li>Lactate dehidrogenaz (LDH) ölçümü gibi daha sonraki analizler için ortamları modüllerden (yani maruz kalan örneklerden) ve plakalardan (yani inkübatör kontrollerinden) toplayın.</li>
	<li>Hücre kültürü laboratuvarında, hücre kültürü kesici uçlarını taze standart CCM ile dolu plakalara aktarın. Hücre kültürü plakalarını bir sonraki pozlama veya analize kadar inkübatöre koyun.</li>
	<li>Son pozlama gününden sonra, kesici uçları ertesi güne kadar inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Son pozlamadan sonraki gün, Bir Voltohmmeter kullanarak TEER'i ölçmek için apikal tarafa CCM ekleyin. Sitokinlerin analizi için hem apikal hem de bazolateral CCM'yi ayrı ayrı toplayın.</li>
	<li>Tüm CCM'yi çıkarın ve örneğin apikal tarafa bir çoğalma reaktifi ekleyerek bir hücre canlılığı tahlilini gerçekleştirin.</li>
</ol>7. AES'nin Temizlenmesi
<ol><li>Pozlama modüllerini suyla doldurun, 1 dakika bekleyin ve suyu çıkarın. Daha sonra, modülleri% 70 etanol ile doldurun, 10 dakika bekletin ve etanolleri çıkarın. Maruz kalma trompetlerini de% 70 etanol ile temizleyin.</li>
	<li>% 85 nem kontrolünü durdurun, ancak bir sonraki deney için kabinin sıcaklığını 37 ° C'de bırakın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Adverse+Effects+of+Inhaled+Nanoparticles+by+Realistic+In+Vitro+Technology.">Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49 (2017).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+exposures+to+acute+and+lifetime+concentrations+of+inhaled+silver+nanoparticles+by+two+different+in+vitro+approaches.">Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches.</a> The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-controlled+system+for+air-liquid+interface+cell+exposure+and+application+to+zinc+oxide+nanoparticles.">A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).</li><li>Paur, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+cell+exposure+studies+for+the+assessment+of+nanoparticle+toxicity+in+the+lung-A+dialog+between+aerosol+science+and+biology.">In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology.</a> Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+Vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research:+Consensus+Workshop+and+Recommendations.">Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations.</a> Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Loret, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-liquid+interface+exposure+to+aerosols+of+poorly+soluble+nanomaterials+induces+different+biological+activation+levels+compared+to+exposure+to+suspensions.">Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions.</a> Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58 (2016).</li><li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+airway+epithelial+cells+(calu-3):+a+model+of+human+respiratory+function,+structure,+and+inflammatory+responses.">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).</li><li>Braakhuis, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimised+Human+Cell+Culture+Model+for+Alveolar+Epithelial+Transport.">An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport.</a> PLoS One. 11 (10), 0165225 (2016).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Airway+Epithelial+Models+for+Immunological+Co-Culture+Studies.">Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).</li><li>Jeong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+predicting+acute+inhalation+toxicity+by+using+a+Calu-3+epithelium+cytotoxicity+assay.">In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).</li><li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection.">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).</li><li>. Vitrocell&#174; Automated Exposure Station Available from: <a target="_blank" href="https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1">https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1</a> (2019)</li><li>M&#252;lhopt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+of+combustion+aerosols+at+the+air-liquid+interface+with+a+self-contained+and+easy-to-use+exposure+system.">Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system.</a> Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).</li><li>. VITROCELL&#174; Cloud for the exposure to liquid aerosols Available from: <a target="_blank" href="https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system">https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system</a> (2019)</li><li>Endes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+testing+strategy+towards+mimicking+the+inhalation+of+high+aspect+ratio+nanoparticles.">An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40 (2014).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+bioactive+delivery+of+aerosolized+drugs+to+human+pulmonary+epithelial+cells+cultured+in+air-liquid+interface+conditions.">Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).</li><li>Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carcinogenic+action+of+crystalline+silica:+a+review+of+the+evidence+supporting+secondary+inflammation-driven+genotoxicity+as+a+principal+mechanism.">The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism.</a> Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).</li><li>Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+review+of+the+genotoxicity+of+respirable+crystalline+silica.">An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+review+of+silica-induced+inhalation+toxicity.">A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity.</a> Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).</li><li>Sayes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+the+dose+metric+for+inhalation+toxicity+studies:+short-term+study+in+rats+with+engineered+aerosolized+amorphous+silica+nanoparticles.">Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles.</a> Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).</li><li>Driscoll, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+response+to+inhaled+silica+or+titanium+dioxide.">Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).</li><li>Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+lung+lesions+in+rat+after+chronic+exposure+to+crystalline+silica.">Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica.</a> Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, 27-29 (1995).</li><li>Peeters, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica-induced+NLRP3+inflammasome+activation+in+vitro+and+in+rat+lungs.">Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).</li><li>Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subchronic+inhalation+toxicity+of+amorphous+silicas+and+quartz+dust+in+rats.">Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats.</a> Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).</li><li>Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-day+inhalation+toxicity+study+of+three+types+of+synthetic+amorphous+silicas+in+Wistar+rats+and+post-exposure+evaluations+for+up+to+3+months.">Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months.</a> Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).</li><li>Cho, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+induced+by+intratracheal+instillation+of+ultrafine+amorphous+silica+particles.">Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles.</a> Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+silver-nanoparticles+and+silver-ions+to+lung+cells+in+vitro+at+the+air-liquid+interface.">Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface.</a> Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).</li><li>M&#252;lhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+toxicity+determination+by+in+vitro+exposure+at+the+air+liquid+interface+with+an+integrated+online+dose+measurement.">Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement.</a> Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).</li><li>van Ravenzwaay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+fate+and+effects+of+three+particles+of+different+surface+properties:+nano-TiO(2),+pigmentary+TiO(2)+and+quartz.">Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz.</a> Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).</li><li>Henderson, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+inflammatory+response+of+the+lung+to+inhaled+versus+instilled+particles+in+F344+rats.">A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats.</a> Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede, ALI altında insan bronşiyal epitel hücrelerini kültleme ve bu bronş modelini aerosollere veya gazlara maruz kalma yöntemi açıklanmaktadır. Calu-3 hücrelerini kullanmanın avantajı, sıkı kavşaklar oluşturmaları, monolayer kalmaları, hava akışına dayanabilmeleri ve diğer birçok hücre tipinin (örneğin, 16HBE, H292 ve BEAS-2B) aksine, ALI'de haftalarca kültürlenebilmeleridir. VITROCELL® otomatik pozlama istasyonunun (AES) kullanılması, sürekli bir hava akışı kullanılarak düşük konsantrasyonlar uygulanabildiğinden hücrelerin gerçekçi ve ilgili koşullar altında maruz kalabilmesi avantajına sahiptir.
AES gibi sürekli akış sistemleri, bir süspansiyonun tek bir nebulizasyonunu kullanan bulut sistemleri3,32'yi kullanmaya kıyasla avantajlara sahiptir. Sürekli akış daha gerçekçidir ve akış hızı, nem ve sıcaklık gibi birçok değişken kontrol edilir. Ek olarak, biriktirme bir elektrik alanı kullanılarak geliştirilebilir. Son olarak, boyut, sayı konsantrasyonu ve kütle gibi aerosol özellikleri çevrimiçi olarak izlenir. Bir dezavantaj, devam eden akış sistemlerinin bulut sistemlerine kıyasla daha karmaşık olmasıdır. Bu nedenle, aerosolun parçacık özelliklerine ve kesici uçta teslim edilen doza odaklanan hazırlık deneyleri yapmak önemlidir. Parçacıkların ilk başlangıç konsantrasyonu ve AES ayarları daha sonra hücrelerde istenen dozu elde etmek için ayarlanabilir33. Test edilen parçacıkların türüne bağlı olarak, aerosol oluşturma yöntemi farklılık gösterebilir. Elektrostatik biriktirmenin kullanımı parçacık tipine bağlıdır ve metalik parçacıklar için en iyi şekilde çalışır. Pozitif yüzey yükü olan parçacıklar için negatif bir elektrostatik alan uygulanmalıdır ve bunun tersi de geçerli olmalıdır.
Maruz kalma konsantrasyonlarının seçimi herhangi bir hava-sıvı maruz kalma deneyi için zor olabilir. DQ12 maruziyetleri için amaç, 3 haftalık maruziyetin ardından haftada 5 gün, günde 4 saat olmak üzere toplam 1 μg/cm2 kümülatif doz elde etmekti. Bu doz vivo21 , 25 , 27,32,33bir etki indükleyen dozlara benzer. Pozlamaları gerçekleştirirken, farklı maruz kalma günleri arasında bazı farklılıklar vardı. 1.6 μg/cm2'lik gerçek yatırılmış doz hedeflenen 1 μg/cm2'den daha yüksek olmasına rağmen, doz Calu-3 modelinde etkileri gözlemlemek için çok düşük olabilir. Temiz hava maruziyeti ile DQ12 maruziyeti arasında teer, canlılık ve sitokin yanıtında sadece küçük farklılıklar gözlendi ve bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi. DQ12'nin 3 hafta boyunca maruz kalmasının Calu-3 hücrelerinde önemli etkiler yaratmadığı gözleminin bir açıklaması, makrofajların Calu-3 modelinden yoksun olduğudur. Muhtemelen, DQ12'den sonra makrofajlar Calu-3 hücrelerini etkileyebilecek proinflamatuar sitokinler üretir. Başka bir açıklama, deneyler için kullanılan DQ12 toplu işleminin beklendiği kadar reaktif olmamasıdır. LPS'yi pozitif kontrol maddesi olarak kullanırken Calu-3, LDH salınımındaki artış ve TNF-α salınımındaki artışla ölçülen bir yanıt gösterir. Bu, modelin toksisiteyi algılayabileceğini gösterir.
Calu-3 hücre modelinin sonuçlar bölümünde tartışıldığı gibi birçok avantajı vardır. Ayrıca, ALI'de daha uzun süre kültürlendiğinde, Calu-3 hücreleri cilia / cilia benzeri yapıları13 büyüyebilir ve mukus11 , 12,13üretebilir. Bu avantajlara rağmen, modelin fizyolojik ilgisi ile ilgili sınırlamaları vardır. Calu-3 hücre hatları adenokarsinomdan kaynaklanırken, 16HBE ve BEAS-2B sağlıklı dokudan kaynaklanır. Ne yazık ki, ikinci ikisi zaman içinde istikrarlı bir monolayer olarak kalmadıkları için tekrarlanan ALI maruziyeti için uygun değildir. Calu-3 modelinin bir başka sınırlaması, yalnızca tek bir hücre türünü temsil ediyor olmasıdır. İnsan akciğerinde, maruziyete farklı şekilde etkileşime giren ve yanıt veren birden fazla hücre tipi mevcuttur. Solunan parçacıklar aerodinamik boyutlarına bağlı olarak akciğerlerin farklı bölgelerinde birikecektir. Calu-3 modeli tarafından taklit edildiği gibi, parçacıkların epitel hücre bariyeri ile temas ettiği yer burasıdır. İnsan akciğerinde, alveoler makrofajlar parçacıklara çekilir, onları sarar ve akciğerlerden temizler. Makrofajlar ayrıca partikül maruziyetine enflamasyon yanıtında da önemli bir rol oynar. Bu nedenle akciğer bariyerini daha yakından taklit etmek için birincil makrofajlar eklenerek Calu-3 modelinin genişletilmesi için çalışmalar yapılmaktadır. Makrofajların dezavantajı, ALI'deki Calu-3 hücrelerinin üstünde kültürlendiğinde sadece yaklaşık 7 gün yaşayabilir kalmalarıdır. Bu nedenle, makrofajlar mevcut Calu-3 modelini bir kokültür modeline dönüştürmek için haftalık olarak okunmalıdır. Ortak kültür protokolünün optimizasyonu şu anda devam etmektedir.
Yukarıdakiler göz önüne alındığında, Calu-3 bronş modeli, sigara dumanı ve LPS'den elde edilen kimyasallar gibi kısmen çözünür maddelerin aerosollerine tekrar tekrar maruz kalmak için uygun bir modeldir. Bu çözünür maddeler Calu-3 hücrelerinde sitokin yanıtlarında önemli artışlara neden olan maddeler. Dizel egzoz ve DQ12 gibi çözünmeyen parçacıkları test etmek için bir kokültür modeline ihtiyaç vardır, çünkü makrofajlar parçacık maruziyeti ile etkilerin indüksiyonunda çok önemli bir rol oynar.
Açıklanan maruziyetler için 3.0 μm gözenekli kesici uç membranları kullanılmıştır. Bu tip kesici uçların seçilmesinin ana nedeni, nanomalzemelerin translokasyonunun test edilmesidir. Daha küçük 0,4 μm gözenek boyutu kullanırken, parçacık aglomeraları kesici uç zarını geçemez. Büyük bir gözenek boyutu kullanmanın dezavantajı, hücrelerin bir araya gelmek için daha uzun bir zamana ihtiyaç duyması ve hücrelerin morfolojisini ışık mikroskopisi kullanarak görselleştirmenin daha zor olmasıdır. Hücrelerin bir arada tek katman oluşturarak oluşturmadığını denetlemek için, teer pozlamayı başlatmadan önce >1.000 Ω x cm2 olmalıdır.
Birlikte ele alındığında, burada sunulan Calu-3 bronş modeli, en az 3 haftaya kadar aerosollere tekrar tekrar maruz kalmak için kullanıma uygundur. Model, sürekli bir hava akışı ile kültürlü ve maruz kalınmaya dayanabilir ve bronşiyal epitel toksisiteyi tespit edebilir.

Akciğerler havadaki parçacıklara soluma maruziyetine karşı savunmasızdır. Havadaki parçacıkların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için, hava-sıvı arayüzü (ALI) maruz kalma sistemleri 1 , 2,3,4,5geliştirmek için ilerleme kaydedildi. ALI pozlama sistemleri, parçacıkların özelliklerini ve kinetiğini değiştiren kültür ortamı aracılığıyla geleneksel batık maruz kalma ile karşılaştırıldığında daha alakalı ve gerçekçi pozlama modellerine izin verir6. ALI maruz kalma sistemleri hücre kültürü modellerine özel taleplerde bulunuyor, çünkü modeller apikal tarafta kültür ortamından ve dolayısıyla besinlerden yoksundur. Birçok hücre modeli, kültürlü olmaktan ve havada maruz kalmaktan olumsuz etkilenir (örneğin, kurur) ve sadece birkaç gün yaşayabilir kalır. Bu, bu modellerde kullanılabilecek maruz kalma koşullarını sınırlar: genellikle nispeten yüksek konsantrasyonlar bir bulut olarak kısa bir süre içinde uygulanır (yani, hızla yerleşen parçacıklar içeren damlacıklar). Bu tür deneysel koşullar, düşük parçacık konsantrasyonlarına gerçekçi uzun süreli maruziyeti yansıtmaz; böylece sonuçların ilgisi sorgulanabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, calu-37 insan bronş epitel hücre hattından oluşan bir bronş modeli için kültür ve maruz kalma protokolü optimize edildi.
ALI maruziyeti için kullanılan in vitro akciğer modellerinin çoğu, temel olarak A549, BEAS-2B ve 16HBE14o- (16HBE) veya birincil hücreler gibi diğer hücre çizgileriniiçerir. Bu hücre hatları, ALI'de kültürlendiğinde sadece birkaç gün yaşayabilir kalmaları dezavantajlarına sahiptir. Ek olarak, bu hücre çizgilerinin bazıları 5 günden daha uzun bir süre kültürlendiğinde aşırı büyür. Son olarak, A549 hücreleri fonksiyonel sıkı kavşakları kaçırır ve bu nedenle akciğerleri taklit etmek için gereken sıkı bir bariyer oluşturamaz9,10. Birincil epitel hücreleri, ALI'de haftalarca kültürlenebildiği için ALI maruziyeti için iyi bir seçenek olabilir. Bununla birlikte, birincil hücreler topludan topluya farklılık gösterir, bakımı daha zordur ve hücre hatlarına kıyasla daha pahalıdır, bu da onları toksisite testi ve taraması için daha az uygun hale getirir. Farklı insan bronşiyal epitel hücre hatlarını (16HBE, Calu-3, H292 ve BEAS-2B) karşılaştırırken, sadece Calu-3 hücreleri gerçekçi, tekrarlanan ALI maruziyeti için gereken tüm kriterleri yerine getirmektedir: ALI'de kültürlüyken haftalarca yaşayabilir kalırlar, yüksek bariyer bütünlüğü sağlarlar, aşırı büyümezler ve kültürlenmesi ve sürdürülmesi kolaydır. Calu-3 hücreleri bir adenokarsinomdan kaynaklanır ve mukusüretebilir 11,12. Hücrelerin cilia11,13geliştirip geliştiremeyeceği konusunda tutarsızlıklar vardır. Calu-3 hücreleri ayrıca siliated hava yolu epitel hücrelerini enfekte eden solunum yolu senktiyal virüs (RSV) enfeksiyonlarını incelemek için uygun bir modeldir14.
Hücre modelinin yanı sıra, aerosollere hava-sıvı maruziyeti için otomatik pozlama sistemi (AES) kullanılır15,16. AES, hücre modelini aerosollere maruz bırakmak için sürekli bir hava akışı kullanma avantajına sahiptir. Bu, genellikle bulut olarak kısa bir süre içinde nispeten yüksek konsantrasyonlar kullanan diğer hava-sıvı maruziyet sistemlerinin aksine (yani, hızla yerleşen parçacıklar içeren damlacıklar)17,18,19. Bu bulut sistemleri, düşük parçacık konsantrasyonlarına gerçekçi uzun süreli maruziyeti yansıtmaz. AES kullanılarak sürekli bir hava akışı uygulanarak, hücre modeli daha uzun bir süre boyunca düşük bir parçacık konsantrasyonuna maruz kalabilir ve gerçekçi maruz kalma koşullarını yansıtabilir. Bulut sistemlerine göre bir diğer avantaj, AES'nin parçacık karakterizasyon araçlarını bağlama seçeneğine sahip olması ve zaman içinde parçacık boyutunun, sayı konsantrasyonunun ve kütlenin ölçülemesine izin vermesidir. AES'nin bir sınırlaması, 10 mL / dk ile 100 mL / dk arasında nispeten yüksek hava akışları kullanmasıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01 M NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M (x10) PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;,7&#8217;-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab141525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated exposure station</td>
			<td>Vitrocell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell proliferation reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit LDH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ12</td>
			<td>IOM</td>
			<td></td>
			<td>nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Ready-SET-Go</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>88-8086-86, 88-7399-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td>
			<td>EVOM2-STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow splitter</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>model 3708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate (F-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>14175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>MFC, Bronkhorst, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Sartorius, Goettingen, Germany</td>
			<td>ME-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>41090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray nozzle</td>
			<td>Schlick, Coburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon filters</td>
			<td>Pall</td>
			<td>R2PJ46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEOM</td>
			<td>Rupprecht &#38; Patashnick NY, USA</td>
			<td>series 1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>690175, 658175, 660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460, 3462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an air-liquid interface bronchial epithelial model for realistic, repeated inhalation exposure to airborne particles for toxicity testing

Havadaki parçacıkların toksisite testi için, gerçekçi maruz kalma koşullarını taklit etmek amacıyla in vitro testler için hava-sıvı arayüz (ALI) maruz kalma sistemleri geliştirilmiştir. Bu, hücre kültürü modellerine özel talepler getirir. Birçok hücre tipi havaya maruz kalmaktan olumsuz etkilenir (örneğin, kuruma) ve sadece birkaç gün yaşayabilir. Bu, bu modellerde kullanılabilecek maruz kalma koşullarını sınırlar: genellikle nispeten yüksek konsantrasyonlar kısa bir süre içinde bulut (yani hızla yerleşen parçacıklar içeren damlacıklar) olarak uygulanır. Bu tür deneysel koşullar, düşük parçacık konsantrasyonlarına gerçekçi uzun süreli maruziyeti yansıtmaz. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için insan bronşiyal epitel hücre hattının kullanımı, Calu-3 araştırıldı. Bu hücreler, sağlıklı bir morfoloji ve sıkı kavşaklara sahip istikrarlı bir monolayer korurken birkaç hafta boyunca ALI koşullarında kültürlenebilir. Ek olarak, bu bronş modeli, bir ALI maruziyet sistemi kullanarak havadaki parçacıkların düşük, gerçekçi konsantrasyonlarına tekrarlanan maruziyetlerin etkilerini test etmek için uygundur. Bu sistem, bir bulut üreten tek bir nebulizasyon kullanan diğer ALI maruz kalma sistemlerinin aksine sürekli bir hava akışı kullanır. Bu nedenle, sürekli akış sistemi, partikül özelliklerini, maruz kalma konsantrasyonunu ve teslim edilen dozu sürekli izlerken havadaki parçacıklara tekrarlanan ve uzun süre maruz kalmak için uygundur. Birlikte ele alındığında, bu bronş modeli, sürekli akışa maruz kalma sistemi ile birlikte, toksisite testi için kullanılabilecek gerçekçi, tekrarlanan soluma maruz kalma koşullarını taklit edebilir.

Bu makale, ALI'deki insan bronşiyal epitel hücrelerini kültleme ve maruz bırakma için toksisite testi için kullanılabilecek gerçekçi, tekrarlanan soluma maruz kalma koşullarını taklit eden bir yöntem sunmaktadır. Hem hücre modelinin hem de maruz kalma sisteminin özellikleri, tekrarlanan pozlamalar için kullanılabilecek gerçekçi bir soluma maruz kalma modeli elde etmek için gereklidir. Bu özelliklerle ilgili sonuçlar aşağıda gösterilmiştir.
Hücre modeli gereksinimleri ve seçimi
Uygun bir hücre modeli seçerken, aşağıdaki özellikler dikkate alınmalıdır:
<ol><li>Hücre modeli, akciğer bariyerini taklit etmek için çalışan sıkı kavşaklara sahip bir konfluent monolayer oluşturabilmelidir.</li>
<li>Hücre modeli, koşullandırılmış (sıcaklık ve nem) havaya tekrar tekrar maruz kaldığında optimum performans göstermelidir.</li>
<li>Hücre modeli bir pozlama yanıt vermelidir.</li>
</ol>Bu çalışma dört farklı insan bronşiyal epitel hücre hattı ile başladı: 16HBE, Calu-3, H292 ve BEAS-2B. Bunların hepsi nanomalzemelerin ve kimyasalların toksisite testi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Dört hücre hattından sadece Calu-3 hücreleri yukarıdaki tüm gereksinimleri karşılamıştır. Hücreler, TEER tarafından ölçülen zaman içinde sabit bir bariyer olarak kalan sıkı kavşaklara sahip bir monolayer oluşturmuştur (Şekil 3), diğer hücre hatları ise ya bir bariyer oluşturmamıştır ya da ALI'de kültürlendiğinde bariyer fonksiyonunda bir düşüş göstermiştir (Şekil 4). Buna ek olarak, H292 ve BEAS-2B, daha uzun bir süre kültürlendiğinde birden fazla hücre katmanına aşırı büyüme eğiliminde oldu. Geleneksel sualtı hücre kültörü ve ALI kültüring büyük ölçüde farklılık gösterdi, çünkü ALI'de besinler sadece bazolateral taraftan mevcuttu ve hücreler apikal tarafta kuru koşullara maruz kaldı. Bu durumlar hücre modellerinde strese neden olabilir ve bu da zaman içinde hücre canlılığını ölçerek gözlenebilir. Hücre hatları 16HBE, H292 ve BEAS-2B, ALI'de kültürlendiğinde artmış bir LDH salınımı gösterirken, Calu-3 hücreleri sadece hafif bir LDH salınımı gösterdi (Şekil 5).
Daha sonra, Calu-3 modelinin maddelere yanıtı test edildi. Pozitif kontrol maddesi olarak LPS, modelin apikal tarafına nebulizasyon yoluyla uygulandı. Biriken doz 0.25 μg/cm2idi. Calu-3 hücreleri, LDH salınımında ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) salınımında artarak lipopolisakkarit (LPS) reaksiyonu göstermiştir (Şekil 6).
Son olarak, Calu-3 monolayer kuvars silika (DQ12) nanomalzemelere (IOM, Edinburgh) maruz kaldı. Kristal silika silikozu indükleyebilir ve akciğer tümörlerine de neden olabilir. Bu nedenle, Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC) kristal silikayı Grup I insankanserojeni 20olarak sınıflandırmıştır. Kristal silikanın etki mekanizmasının, reaktif yüzeyi21 , 22,23'ün neden olduğu kalıcı iltihabın indüksiyonu ile olduğu düşünülmektedir. Hem sıçanlarda hem de farelerde yapılan çeşitli in vivo çalışmalar, kristal silika 24 , 25 ,26,27 , 28,29'asoluma maruziyeti sonrası tümörler ve fibrozis de dahil olmak üzere inflamasyon ve histopatoloji değişikliklerinin indüksiyonunu rapor eder. Bu etkilerin tümü tekrarlanan maruziyet ve/veya uzun süreli takiplerden sonra gözlenir. Calu-3 modeli, in vivo çalışmalardan elde edilen gözlemlerin ALI'de tekrar tekrar ortaya çıkılabilen bir in vitro model kullanılarak taklit edilip edilemeyeceğini araştırmak için kullanıldı.
Calu-3 hücreleri art arda 3 hafta, haftada 5 gün, DQ12'ye günde 4 saat maruz kaldı. Biriken doz QCM kullanılarak ölçüldü. Ortalama birikmiş doz günde 120 ng / cm2 idi, kümülatif doz 1.6 μg / cm2, in vivo bir etkiye neden olan dozlara benzer. Diğer parçacık özellikleri Tablo 1'degösterilmiştir. 3 haftalık maruziyetten sonra, DQ12 teer, hücre canlılığı ve monosit kemoattraktant protein 1 (MCP-1) salınımında temiz hava kontrollerine kıyasla önemli bir etki yaratmadı (Şekil 7). In vivo verilere dayanarak DQ12'nin daha fazla toksisitesi beklendiğinden, AB projesi GRACIOUS (teslim edilebilir 5.3) içinde optimize edilen protokole göre hücresel bir test kullanılarak parçacıkların reaktivitesi kontrol edildi. DQ12 grubunun reaktivitesi beklenenden daha düşüktü (Şekil 8), pozitif kontrol parçacıkları karbon siyahı (CB) ile karşılaştırıldığında büyüklük sıraları daha düşüktü. Bu reaktivite eksikliği Calu-3 modelinde toksisite yanıtının olmamasını açıklayabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig01.jpg"> Şekil 1: Otomatik pozlama istasyonu (AES). Sol figür dokunmatik panel ile kabinin dışını gösterir. AES'in pozlama modüllerine sahip üç seviyesi vardır: temiz hava maruziyetleri için en üst seviye ve aerosol maruziyetleri için orta ve alt seviye. Doğru şekil, hücreli kesici uçların yerleştirildiği pozlama modülünü gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig02.jpg"> Şekil 2: Pozlama kurulumunun şematik gösterimi. Soldan sağa: 1) peristaltik bir pompa ile püskürtme nozüle bağlı ENM süspansiyonu; 2) Basınçlı hava kullanarak sprey nozül ENM süspansiyonu nebulize eder ve bir karıştırma odası aracılığıyla aerosoller AES'ye yönlendirilir; 3) AES'ye girmeden hemen önce aerosol karakterizasyon cihazları bağlanır: SMPS, OPS, TBM ve TEOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig03.jpg"> Şekil 3: 10 gün boyunca hava sıvısı arayüzünde (ALI) kültlemeden sonra Calu-3 hücrelerinin temsili görüntüsü. 10 gün boyunca ALI'de kültlendikten sonra Calu-3 hücrelerinin floresan mikroskopi görüntüsü. Sıkı bağlantı proteini ZO-1 yeşile boyanır, hücrelerin çekirdekleri maviye boyanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig04.jpg"> Şekil 4: 21 günlük bir kültür döneminde dört farklı hücre hattının transepithelial elektrik direnci (TEER). 21 gün boyunca kültürlendiğinde 16HBE, Calu-3, H292 ve BEAS-2B TEER değerleri: ilk 7 gün suya gömüldü, ardından ALI'de 14 gün. TEER değerleri kesici ucun arka plan direnci için düzeltildi ve kesici ucun yüzey alanıyla çarpıldı. Semboller ve hata çubukları, altı kesici ucun ortalama değerini ve standart sapmasıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig05.jpg"> Şekil 5: 21 günlük bir kültür döneminde dört farklı hücre hattının LDH salınımı. 21 gün kültürlendiğinde 16HBE, Calu-3, H292 ve BEAS-2B'nin LDH sürümü: 7 gün su altında kaldı, ardından ALI'de 14 gün. Gösterilen LDH değerleri, hücre türü başına en fazla LDH salınımı ile göredir. Semboller ve hata çubukları, beş kesici ucun ortalama değerini ve standart sapmasıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig06.jpg"> Şekil 6: LPS'ye maruz kalan Calu-3 hücrelerinde hücresel etkiler. Calu-3 hücreleri bulut nebülizasyonu ile 0.25 μg/cm2 LPS'ye maruz kaldı. (A) WST-1 dönüştürmesi. (B) LDH sürümü. (C) LPS maruziyeti sonrası TNF-α serbest bırakır. Semboller ve hata çubukları, üç kesici ucun ortalama değerlerini ve standart sapmalarını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig07.jpg"> Şekil 7: DQ12 nanomalzemelere maruz kalan Calu-3 hücrelerinde hücresel etkiler. Calu-3 hücreleri DQ12 nanomalzemelere 3 hafta (günde 4 saat, haftada 5 gün), günde yaklaşık 120 ng/ cm2, kümülatif doz 1.6 μg / cm2maruz kaldı. (A) TEER değerleri. (B) LDH sürümü. (C) DQ12 pozlamadan sonra MCP-1 sürümü. Tüm semboller ve hata çubukları, denetimler için üç kesici ucun ve DQ12 pozlaması için altı kesici ucun ortalama değerlerini ve standart sapmalarını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig08.jpg"> Şekil 8: DQ12'nin hücresel reaktivitesi. DQ12, yüzey reaktivitesini tespit etmek için 2ʹ.7ʹ-Dichlorofluorescein Diasetat (DCFH-DA) probu ile inkübe edildi. Pozitif kontrol olarak karbon siyahı (CB) partikülleri dahil edildi. CB ile karşılaştırıldığında, DQ12 çok düşük yüzey reaktivitesine sahiptir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parçacık kütlesi (μg/m3)</td>
			<td>Parçacık numarası (#/cm3)</td>
			<td>Hareketlilik parçacık boyutu (nm)</td>
			<td>Geometrik standart sapma</td>
			<td>Optik parçacık boyutu (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2969 (418)</td>
			<td>83983 (10215)</td>
			<td>66.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.1 (1.3)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: DQ12 pozlama özellikleri. Değerler, parantez içinde standart sapma ile ortalama olarak gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing at JoVE.com

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Tanımlanan, toksisite testi için parçacıklara gerçekçi, tekrarlanan inhalasyon maruziyeti için bir in vitro bronş modelinin hücre kültürü ve maruz kalma yöntemidir.

Toksisite Testi için Havadaki Parçacıklara Gerçekçi, Tekrarlanan Soluma Maruziyeti için Hava Sıvısı Arayüzü Bronşiyal Epitel Modeli

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

an-air-liquid-interface-bronchial-epithelial-model-for-realistic

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Görüntüleme.  National Institute for Public Health and the Environment (RIVM). Tanımlanan, toksisite testi için parçacıklara gerçekçi, tekrarlanan inhalasyon maruziyeti için bir in vitro bronş modelinin hücre kültürü ve maruz kalma yöntemidir.

Video: An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Biyoloji

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Tüm-Vücut Nanopartikül Aerosol Solunum Etkilenmeler

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Drosophila toksisite laboratuvarda test etmek için bir omurgasız Model sistemi olarak kullanmak için deneysel protokol

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Zebra Balığı Embriyosunda Toksisite Değerlendirmesi için Startle Testi

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

Yazar Spotlight: Zebra Balığı Embriyo İrkilme Tepkisi Testi Kullanılarak Yüksek Verimli Toksisite Taraması

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

Zebra Balığı Titreşim İrkilme Tepkisi Tarama Sistemi Kullanılarak Kimyasalların Toksisitesinin Değerlendirilmesi

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...