Bu protokol, hava yolu epitel hücrelerinin sağlık ve hastalıktaki işlevi ve rolü ile ilgili çeşitli araştırma sorularını ele almak için kullanılabilecek sağlam ve uygun maliyetli bir yöntem içindir. Bu tekniğin temel avantajı, mukus üretimi ve siliyer aktivite de dahil olmak üzere insan epitel hücre tabakasının iyi bir temsili olan bir hücre tabakası ile sonuçlanmasıdır. Bu teknik çok yönlüdür ve hastalıkla ilgili hakaretleri veya terapileri incelemek için kullanılabilir.
Başlamak için, insan akciğer dokusundan izole edilen bronşiyal halkayı 10 mililitre steril PBS ile 10 santimetrelik bir Petri kabında durulayın. Halkayı cımbızla tutarken, fazla bağ dokusunu ve kan kalıntılarını çıkarmak için küçük makas kullanın. Halkayı ikiye bölün ve iki yarıyı kapalı steril bir kapta Primocin içeren HBSS'de 10 mililitre önceden ısıtılmış Proteaz 14 çözeltisine batırın.
Bronşiyal halka parçalarını iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, parçaları 10 mililitre ılık PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve bükülmüş cımbız kullanarak, bir hücre çözeltisi elde etmek için halkanın içini kazıyın. Yüzüğü atın.
Hücre çözeltisini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 50 mililitrelik son bir hacim elde etmek için ılık PBS ekleyin. Hücre çözeltisini santrifüj edin ve peleti 10 mililitre ılık PBS'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edin. PBS ile hacmi 50 mililitreye çıkarın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
Pelet, Primosin içeren ılık komple KSFM'de tekrar askıya alın. Daha sonra, kaplama çözeltisini altı delikli plakadan, kuyu başına iki mililitre hücre süspansiyonu ile değiştirin. % 80 ila% 90 akıcılığa ulaşılana kadar hücrelerin büyümesine izin verinaklılık, PBEC'lerin kriyoprezervasyonu için, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve hücreleri bir kez kuyu başına iki mililitre sıcak PBS ile yıkayın.
Kuyu başına 500 mikrolitre yumuşak tripsin ekleyerek hücreleri deneyin ve 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin. Tripsin çözeltisini döndürün ve plakaya hafifçe dokunarak hücreleri serbest bırakın. Ayrılan hücreleri, soya fasulyesi tripsin inhibitörü içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Süspansiyonu santrifüj edin ve peleti penisilin ve streptomisin içeren 10 mililitre KSFM'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Hücreleri otomatik bir hücre sayacında saydıktan sonra, hücreleri dondurucu bir ortamda mililitre başına 400.000 hücrelik bir konsantrasyona yeniden askıya alın ve bu süspansiyonun bir mililitresini bir kriyoviyal içine ekleyin. Şişeleri serin bir hücre kabına aktarın ve eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.
24 saat sonra, şişeleri uzun süreli depolama için eksi 196 santigrat derece sıvı azota aktarın. Bir T75 hücre kültürü şişesini kaplamak için, PBS'ye 10 mililitre kaplama çözeltisi ekleyin ve şişeyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirmeden önce kapağı sıkıca kapatın. Ertesi gün, kaplama çözeltisini şişeden 10 mililitre tam KSFM ile değiştirin.
İnkübatörün havaya girmesine izin vermek için ortamın inkübatörde hafifçe açılmış bir kapakla 37 santigrat dereceye kadar ısınmasına izin verin. Kriyokorunmuş PBEC'leri 37 santigrat derece boncuk banyosunda hızla çözün. Tüm içeriği kriyoviyal için önceden ısıtılmış T75 şişesine ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtın.
Hücrelerin sıkıca bağlandığından emin olduktan sonra, ortamı 10 mililitre taze ve ılık tam KSFM ile değiştirin ve% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşana kadar büyütün. Kesici uç başına 400 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyerek hücre kültürü eklerini kaplayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki mililitre yumuşak tripsin ekleyerek şişedeki PBEC'leri deneyin ve beş ila 10 dakika inkübe edin.
Şişeyi döndürerek ve hafifçe hafifçe dokunarak hücre ayrılmasını kolaylaştırın. Daha sonra, şişeye dört mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve hücre süspansiyonunu 25 mililitrelik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu santrifüj edin ve peletleri altı mililitre komple BD ortamında yeniden askıya alın.
Otomatik hücre sayacındaki hücreleri sayın. Kaplamadan sonra, kaplama çözeltisini eklerden çıkarın. Hücre süspansiyonunu bir nanomol EC 23 ile desteklenmiş tam BD ortamı ile seyreltin ve eklerin zarının üstüne 500 mikrolitre ekleyin.
Kesici ucun altındaki kuyucuğa 1,5 mililitre komple BD ortamı ekleyin. Hücreler Hava-Sıvı Arayüzüne veya ALI'ye aktarılmaya hazır olduğunda, ortamı eklerden ve kuyudan çıkarın ve sadece kuyuya 50 nanomolar EC 23 ile desteklenmiş yeni komple BD ortamı ekleyin. Kuyulardaki ortamı haftada üç kez değiştirin.
Fazla mukus ve hücresel kalıntıları gidermek için, kesici ucun içindeki hücre tabakasının apikal tarafına yavaşça 200 mikrolitre ılık PBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, aşırı mukus ve hücresel enkaz içeren PBS'yi aspire edin. TEER, ALI PBEC kültürlerinin kalitesini değerlendirmek için ölçüldü.
Yedi günde, hücre tabakasının 300 ohm'dan yüksek elektrik direnci başarılı bir kültür olarak kabul edilir. Ayrıca, elektriksel dirençteki donörler arası değişkenlik, Hava-Sıvı Arayüzündeki kültürün yedinci günü ile 14. günü arasında zamanla azalmıştır ve kullanılan DMEM'in kökeninden belirgin şekilde etkilenmiştir. Bazal, siliyer, kadeh ve kulüp hücreleri gibi tüm ana farklı hücre tipleri, 14 günlük ALI kültüründe gözlendi ve ekspresyon seviyeleri donöre bağımlıydı.
Test edilen EC 23'ün farklı konsantrasyonları arasında, 50 nanomolar'da maksimum TEER gözlenmiştir. Retinoik asit ve sentetik analoğu EC 23'ün karşılaştırılması, siliyer ve kadeh hücreleri için belirteçlerin gen ekspresyonunun 50 nanomolar EC 23 ve retinoik asit arasında benzer olduğunu doğrulamaktadır. Farklı tedarikçilerden gelen ortamların kullanılması, hücresel bileşimde önemli farklılıklara neden olurken, TEER'deki farklılıklar daha az belirgindi.
Öte yandan, farklı tedarikçilerden kesici uçların kullanılması, hücresel ayrışmada önemli farklılıklara neden olmamıştır. Ayrıca, ALI PBEC ve PneumaCult ortamının TEER değerlerinde ve hücresel bileşiminde tam BD ortamına kıyasla bir fark gözlenmiştir. Hücreler ALI'ye transfer olmaya hazır olduğunda, EC 23 konsantrasyonlarını arttırın.
Ayrıca, çözüldükten sonra hücreleri santrifüj etmeyin ve SBTI ekledikten sonra hücreleri hücre kültürü plastiklerinden hızlı bir şekilde çıkarın. Hava yolu epitel hücrelerinin kültürlerini bu protokolde sağlanan şekilde kullanarak, örneğin hava yolu epitel hücrelerinin işlevine, gen ekspresyonuna, aracılık üretimine bakmak için çeşitli analiz yöntemleri kullanarak bunu takip edebilir ve böylece, örneğin, örneğin sigara dumanına maruz kalmanın sonuçları hakkında fikir edinebilirsiniz. Bu hücre kültürü protokolü için bir sonraki adım, bağışıklık hücreleri veya vasküler hücreler gibi ek hücre tiplerinin entegrasyonudur ve bu, doku temsilini arttırmaya yardımcı olacaktır.
