Bu protokol, floresan mikroskobu kullanarak genç veya yetişkin farelerden miyelinli aksonların nörofilament popülasyonunun doğrudan görüntülenmesine olanak sağlayarak izole sinir segmentlerinde nörofilament taşımanın yön ve hızını ölçmeyi mümkün kılar. Bu yöntem ilgi protein bir fotoaktiz floresan füzyon ifade farelerin durumu bağlıdır, ancak herhangi bir kolayca parçalanmış sinir kullanılmak üzere adapte edilebilir. Başlamak için, 60 mililitrelik şırınga içine oksijenli tuzlu dökün ve şırıngada minimum hava kaldığından emin olun.
Şırıngayı boruya bağlayın ve çıkış tüpünü bir atık şişesine yerleştirin. Dış contayı perfüzyon odası gövdesine yerleştirin, akış giriş ve çıkış direklerinin contadaki deliklerle hizalanmasını sağlayın, sonra iç contayı 1,5 numaralı dairesel örtüye yerleştirin ve sıkı bir mühür sağlamak için contadaki kırışıklıkları dikkatlice düzeltin. Kapak ve contayı kağıt havluya veya conta yukarı bakacak şekilde bir görev mendili üzerine yerleştirin.
Omurganın ortasına yakın deride bir dorsal kesi yapmak ve hayvanın ventral yönü etrafında kesmeye devam etmek için büyük diseksiyon makas bir çift kullanın. Yavaşça kas uzak deri çekin ve fasya kesti. Daha sonra, siyatik sinir ortaya çıkarmak için kuyruk ve diz arasında orta uyluk kasları bir kesi yapmak için mikrodiskes makas kullanın.
Kas yoluyla görülebilir sinir, kesilmediğinden emin olun. Kas kaldırmak için kesi dorsally ve ventrally genişletin, sonra buzağı kasları kaldırmak, kesikler sığ ve kısa sinirlere zarar önlemek için tutmak. Tibial sinir tamamen topuk siyatik sinir dalları noktadan maruz kalana kadar kasları kaldırmaya devam edin.
Forceps bir çift ile omurga proksimal ucunda tibial sinir kavramak ve mikrodizeksiyon makas bir çift ile kesilmiş, sinir için çok fazla gerginlik uygulamak değil emin olun. Dikkatle kas uzak kaldırın ve herhangi bir ekleri kesti, sinir üzerinde gerginlik koymak için dikkat. Tibial sinirin omurga distal ucunu kesin ve oda sıcaklığında oksijenli tuzlu küçük bir Petri kabına aktarın.
Sinirproksimal ucundan başlayarak, yavaşça çok ince uç forceps bir çift ile maruz akson biter kavramak. Forceps ikinci bir çift ile, proksimally sinir kılıfı kavramak ve yavaş yavaş bu işlem sırasında hiçbir gereksiz gerginlik uygulandığından emin olmak için sinirdistal sonuna doğru çekin. Sinirproksimal ucunu kavrayın ve yavaşça bir kapak üzerine yatırın, sonra hafif gerginlik altında düzleştirmek.
Mikroakemer kaydırakları, oluklu kaydırakla sinirin üzerine yerleştirin ve akış yönünü sinire paralel konumlandırın. Kapak ve mikroakemer tertibatını ters çevirin ve dış contaya karşı olan kaydırakla perfüzyon odası gövdesine yerleştirin. Profüzyon odasını sabitlemek için, metal gövdeye yerleştirin ve kilitleme halkasını döndürün.
Yavaşça tuzlu şırınga piston depress ve perfüzyon odası doldurun. Kurulum ve görüntüleme sırasında giriş ve çıkış borusu, çıkış şişesi ve şırıngayı her zaman odanın üzerinde tutun. Profüzyon tertibatını ters bir mikroskop aşamasına aktarın ve tuzlu şırıngayı şırınga pompasına monte edin, ardından motoru çalıştırın ve hızı dakikada 0,25 mililitre akış hızına ayarlayın.
Sıralı çözelti ısıtıcıbağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Objektif ısıtıcıbağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Hedefe yağ uygulayın ve profüzyon odasını sahne montajına takın.
Oda ısıtıcı ped yağ uygulayın ve perfüzyon odasına takın, sonra bağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Profüzyon odasını sahne adaptörüne kilitleyin ve nesnel yağı odanın alt tarafındaki kapak kaymasıyla temas edin. Kapak yüzeyine en yakın sinirin alt yüzeyindeki akson tabakasına odaklanmak için Brightfield aydınlatmasını kullanın.
Miyelinli aksonlar, Brightfield iletilmiş ışık aydınlatması altında kontrast geliştirme olmadan görülebilen bir miyelin kılıfının varlığı ile tanımlanabilir. Bir Brightfield referans görüntü elde, sinir in yön kaydı, sonra bir 488 nanometre lazer ve fotoaktibl GFP için uygun bir emisyon filtresi kullanarak bir konfokal görüntü elde. Lazer gücünü yaklaşık beş kat normal görüntüleme gücüne ayarlayın ve pozlama süresi üç ila dört dakika olan bir görüntü elde edin, ardından beyazlatma adımından sonra aktivasyon öncesi otofloresansı kaydetmek için başka bir konfokal görüntü edinin.
Brightfield görüntüsünün istenen etkinleştirme penceresi boyutuna eşit uzunlukta aksonlarla paralel bir çizgi çizin. Bu satırı kılavuz olarak kullanarak, aksonları dik görüş alanına dikdörtgen bir ilgi alanı çizin. 405 nanometre ışıkla desen uyarma ile bu bölgedeki GFP floresansını etkinleştirin ve etkinleştirmeden hemen önce ve hemen ardından bir görüntü elde edilir.
Etkinleştirme sona ererken, bir dakikalık zamanlayıcı başlatın. Patladığında, bir timelapse serisi nin edinimi başlar. 0,5 mililitre çift distile suya 250 miligram floresan tozu ekleyin ve görünür parçacıklar olmayana kadar karıştırın, ardından çözünmemiş herhangi bir malzemeyi tortulamak için bir masa üstü santrifüjde 30 saniye boyunca çözeltiyi döndürün.
Bir slayta sekiz mikrolitre floresan çözeltisi ekleyin ve 1,5 kapak lı bir sayı uygulayın. Fazla sıvıyı blotlayın, kapağı ojeyle kapatın ve kaydırağın kurumasını bekleyin. Slayt kapağı tarafını ters mikroskop aşamasına yerleştirin ve odağı kapak kayması yüzeyindeki ince floresan düzlemine ayarlayın.
Hava kabarcıkları veya büyük floresan parçacıkları içermeyen bir görüş alanı bulmak için kaydırağı hareket ettirin ve orta daki görüntünün orijinal odak düzlemi olması için 0,2 mikrometre aralıklarla altı mikrometreye yayılan bir Z-yığını edinin. Kamera deklanşörü de dahil olmak üzere tüm ışık yolu panjurlarını kapatın ve lazer gücünü ve pozlama süresini sıfır saniyeye ayarlayın. Karanlık alan görüntüsünü oluşturmak için ortalama olacak bu ayarlarla 100 görüntü yığını edinin.
Darbe kaçış ve nabız yayılımı deneylerinden elde edilen temsili görüntüler burada gösterilmiştir. Darbe kaçış yöntemi için, aktive bölgede floresan çürüme kinetik uzun vadeli ve kısa vadeli duraklama davranışı hakkında bilgi verebilir. Etkinleştirilen bölge bu deneyler için kısa olabilir.
Floresan nörofilamentler daha büyük bir havuz sağlamak için daha uzun aktif bölge nabız yayma yöntemi için kullanılır. Bu, kanat bölgelerindeki floresan artışının doğrusal olarak kaldığı süreyi uzatır. Burada 15 mikrometre yan pencere kullanılmaktadır.
Ölçüm penceresinden gelen toplam floresan ölçüldü. Çürüme, on-track nörofilamentlerin gidişini temsil eden ilk üstel bozunma ve 10 ila 20 dakika arasında ikinci bir yavaş üstel çürümeyi temsil eden, pist dışı filamentlerin gidişini temsil eden darbe kaçış yöntemi için bifhasiktir. Darbe yayılımı stratejisi için, hareketin hız ve yönlülüğünün hesaplamaları sadece yan camların eğimlerine bağlıdır.
Burada kullanılan pencere uzunlukları için doğrusal faz yaklaşık beş dakika uzar. Glikoletik olarak inhibe edilmiş bir sinirin timelapse burada gösterilmiştir, aktive bölgenin dışına taşıma belirgin bir azalma gösteren. Gerçekten de, distal ve proksimal eğimler inhibitör ile tedavi sinirlerde önemli ölçüde daha düşüktür.
Ayrıca bu iki durum arasında nüfus hızında önemli bir azalma vardır. Bu protokolü denerken, hayvanın kurban edilmesinden sonra sinir sağlığı nın düşmesi nedeniyle diseksiyonu ve oda montaj bölümlerini yaparken aceleci davranmanın çok önemli olduğunu unutmayın. Nöronal hücre kültürü, bu protokol kullanılarak toplanan nüfus ölçeği verilerini tamamlayacak olan bireysel nörofilamentlerin hareketinin ölçülmesine ve analizine izin verebilir.
