Protokolümüzü kullanarak, canlı anestezi uygulanmış farelerin motor ve duyusal nöronlarından aksonlar içindeki sinyal endozomlarının ve mitokondrilerin dinamiklerini görselleştirebilir ve nicel olarak değerlendirebiliriz. Aksonların in vivo bazal fizyolojisini anlamak ve fare hastalık modelinde periferik nörodejenerasyonu yönlendiren önemli pato-mekanizmayı ortaya çıkarmak için kullanılabilecek bu yöntem. Tekniğimiz, farmakolojik ajanlar ve gen terapileri gibi potansiyel tedavilerin canlı motor ve duyusal nöronlarda aksonal taşıma üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.
Bu teknik, belirli bir periferik sinir aksonundaki farklı organelleri aynı anda görüntülemek ve yaşlanmanın yanı sıra motor hastalık modellerinin çalışmasını iletmek için kullanılabilir. Daha küçük kaslara optimal kas içi enjeksiyonlar için derecelendirilmiş bir cam mikropipet çekerek hazırlıklara başlayın. Ameliyat için, steril bir cerrahi örtüyü 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısı paspası üzerine sabitleyin ve ameliyat mikroskobunu konumlandırın ve odaklayın.
Ardından, gerekli tüm cerrahi aletleri ve aletleri makalede açıklandığı gibi paketinden çıkarın. Hazırlıklar tamamlandığında, anestezi uygulanan fareyi cerrahi alanın ayrı bir bölgesinde bulunan ağızlığa aktarın ve kürkü cerrahi bölgeden tıraş etmeden önce hem kornea hem de pedal çekilme reflekslerinin bulunmadığından emin olun. Ardından, cerrahi bandın yapışkan tarafını kullanarak tıraş edilmiş kürkü fareden çıkarın.
Ardından, ameliyat öncesi ağırlığı kaydetmek için fareyi tartım terazilerinin üzerine getirin. Ardından, göz yağlayıcısı uygulamak ve fareyi ve ağızlığı cerrahi bölgeye aktarmak için pamuklu çubuk kullanın. Tibialis anterior veya TA kasını enjekte etmek için, fareyi arkaya yerleştirin ve arka bacağı orta hattan 10 derece uzatın.
Arka bacak doğru pozisyonda olduğunda, ayağın üzerine bir cerrahi bant yerleştirin. Tıraş edilen alanı% 70 etanol veya eşdeğer bir çözelti kullanarak sterilize edin. Tetanoz, nörotoksin veya HcT çözeltisinin çalışan atoksik fragmanını çekilmiş bir cam mikropipete çekin.
Daha sonra, motor ve plaka bölgelerine karşılık gelen bölgedeki ilgili kas üzerinde küçük bir kesi yapın. Sonra. HcT'yi enjekte etmek için kas üzerindeki dış fasyayı delin. Mikropipeti yavaşça geri çekilmeden önce beş ila 10 saniye boyunca pozisyonda bırakın.
Enjeksiyondan sonra, kesileri bir ila iki dikişle kapatın. Ardından, fareyi 30 dakika boyunca gözlem altında izole edilmiş bir kurtarma kafesine aktarın. Cerrahi alet ve aletleri cerrahi alanın etrafına yerleştirerek siyatik siniri açığa çıkarmaya hazırlanın.
Görüntüleme işlemine yardımcı olmak için parafilmi açılı bir uçla bir santimetre genişliğinde dar bir dikdörtgen halinde keserek bir kama oluşturun. Hazırlıklar yapıldıktan sonra, fareyi cerrahi bölgedeki ağızlığa aktarın ve kafayı ağızlığa sabitlemek için cerrahi bant kullanın. Hedeflenen arka bacağı orta hattan 45 derece uzayın ve cerrahi bantla sabitleyin.
Kornea ve pedal çekilme refleksleri yoksa, makas kullanarak siyatik sinirin üzerindeki cildi kesin. Daha sonra, siyatik sinir ve kan damarlarına zarar vermeden üstteki biseps femoris kası ve kas sistemini veya bağ dokusunu çıkarın. Sağlam siyatik sinir yeterince maruz kaldığında, kurumayı önlemek için siyatik sinirin etrafındaki alana önceden ısıtılmış steril salin uygulayın.
Daha sonra, derin yatan bağ dokusunu bozmak için kavisli forseps kullanın ve önceden hazırlanmış parafilm kamasını sinirin altına yerleştirin. Isı paspasının üstündeki fareyi izofluran ve oksijenle dolu indüksiyon odasına hareket ettirmeden önce tuzlu suyla ıslatılmış pamuk yününü maruz kalan bölgeye yerleştirin. Görüntüleme için, özelleştirilmiş mikroskop aşamasına 22 x 64 milimetrelik bir kapak camı yerleştirin ve kapak camının konumunu bir bantla sabitleyin.
Hedefe daldırma yağı uyguladıktan sonra, mikroskop aşamasını ters çevrilmiş mikroskopa bağlayın ve kapak camına temas etmek için yağa batırılmış hedefi yavaşça kaldırın. Kurulum hazır olduğunda, anestezik ağızlığı bant kullanarak mikroskop sahnesine sabitleyin. Ardından, pamuk yününü siyatik sinirden çıkarın ve fareyi indüksiyon odasından ağızlığa, açıkta kalan sinir kapak camına bakacak şekilde aktarın.
Farenin kafasını ağızlığa sabitleyin ve yeterli en düşük anestezi seviyesini korurken, maruz kalan siyatik sinirin yakınındaki kapak kaymasına steril salin eklemek için fareyi kuyruğundan yavaşça kaldırın. Oküler yardımla, optimal odak noktasını belirlemek için siyatik siniri bulun ve hareketli aksonal organeller içeren bir ilgi alanı seçin. Ardından, Edinme düğmesine tıklayarak ve bir ilgi alanı seçerek bilgisayar yazılımına geçin.
80 kat büyütme elde etmek için dijital yakınlaştırmayı kullanın ve aksonları yatay olarak görselleştirmek için seçilen alanı döndürün Bölgeler kutusunu tıklatın ve ilgilendiğiniz dikdörtgen bir bölge seçin. Edinme Modunda, çerçeve boyutunu en az 1024x1024 piksel olarak ayarlayın ve 100 ila 1.000 karelik hızlandırılmış alım işlemini başlatın. Fare başına üç aksondan en az 10 hareketli kargo yakalayın.
Çalışmada, transgenik fareler kullanılarak in vivo motor akson-spesifik etiketleme elde edildi. Kolinerjik motor aksonlardaki gelişmiş yeşil floresans proteini veya eGFP ekspresyonu, canlı, anestezi uygulanmış bir ChAT'den gözlendi. eGFP fare.
Alternatif yöntemle, bir ChAT'den yeni eksize edilmiş bir sinirde tdDomates ekspresyonu. tdDomates faresi ek doku işleme tabi tutulmadan elde edildi. Ek olarak, aksonlar iskelet kaslarına eGFP'yi kodlayan HcT veya adenovirüsler gibi izleyiciler veya belirteçler enjekte edilerek tanımlandı.
Temsili analiz, HB9'un canlı motor nöronlarında sinyal veren endozomların in vivo aksonal taşınımını temsil eden bir hızlandırılmış görüntü serisini göstermektedir. GFP fare. GFP, HB9'da daha ayrıntılı bir modele sahipti.
GFP aksonları. Mito'nun ıslahı. ChAT'li CFP fareleri.
tdDomates fareleri, motor aksonlarda mitokondrinin görselleştirilmesini sağladı. Dahası, Ranvier Düğümü de tanımlanabilir. Mito kaslarına HcT enjeksiyonu.
CFP fareleri, aynı aksonlar içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo olarak eşzamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi. Anterograd ve retrograd olarak hareket eden organellerin yanı sıra durmuş organeller gözlendi. Görüntüleme işlemi sırasında anestezinin azaltılması avantajlıdır, çünkü büyük solunum artefaktlarının etkisini sınırlayabilir ve böylece aksonal transportun izlenmesini ve analizini basitleştirebilir.
Siyatik sinirler, RNA ve protein analizinin organel dinamiklerini motor proteinleri ve kargoya özgü adaptörler gibi aksonal taşıma makinesinin temel bileşenleriyle ilişkilendirmesi için öğretici olabilir.
