Bu çalışma ayrıca NIH hibe K08NS065157 (TSK için) tarafından desteklenen, Baltalimanı Kemik Hastalıkları Penn Center, Artrit Ulusal Enstitüsü Ödülü Numarası P30AR050950, Kas-iskelet ve Deri Hastalıkları, bu iş (TSK ve Steven S. Scherer) destekledi. Son olarak, Shriners Pediatrik Araştırma Merkezi Tohum finansman (TSK) bu işi destekledi. Biz başlangıçta Şekil 1 skeçler üretiminde ona yardım için tüm montaj işlemi ve Amy A. Kim gösteren Dr Jin Young-Oğul kabul etmek istiyorum.

1. Hayvan Başlık 1.1. Tedavi <ol><li> Tüm hayvan prosedürleri ağrı ve rahatsızlığı en aza indirmek için alınan tedbirlerle, yerel Kurum Hayvan Bakım ve Etik Kurulu onayı ile ve Sağlık kılavuzların Kullanımı ve Komitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri göre yapılmalıdır. </li><li> Bizim fareler 12 saatlik bir ters ışık ve karanlık döngüsüne sıcaklık kontrollü şartlar altında muhafaza, beslenen fare yemi ve su ad libitum etmekte. </li><li> Siyatik sinir gerçekleştirildiğinde yetişkin rejenerasyon çalışmaları için, farelerin yaş en az 6 hafta olmalıdır. Bu yaş polyneural nöromüsküler kavşağa budama gerçekleşecek süredir ötesindedir. </li><li> Bu deneylerde, bu 6-8 hafta yaşında C57BL / Charles River elde edilen 6 fareleri kullanılmıştır. Siyatik sinir (örn: akson büyüme oranı) sonra rejenerasyon karşılaştırırken aksonal rejenerasyon farklılıkları yok olmuş gibi fare suşları, aynı olmalıdırFarklı doğal ırklar 15,16 arasında ed. Genetik olarak manipüle farelere kullanılacak olursa, Kardeş kontroller en uygundur. </li></ol> 1.2. Cerrahi Hazırlık <ol><li> Hayvanlar intraperitonal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) bir kokteyli ile cerrahi derin anestezi uygulanmıştır. Her hayvan, aynı zamanda post-operatif ağrı en aza indirmek için meloksikam bir deri altı enjeksiyon (10 mg / kg) alır. </li><li> Her iki kıç dikkatli bir cerrahi makası (Roboz, RC-5903) ve depilasyon Nair epilasyon kremi (yerel eczane bulunur) ile tamamlanır kullanarak tıraş edilmiştir. </li><li> Cilt steril pamuk uçlu bir aplikatör ve betadin cerrahi fırçalayın (Fisher Scientific, 19.066.452) kullanılarak temizlenir. </li><li> Oftalmik merhem (Fisher Scientific, 19.082.795) steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak gözlere uygulanır. </li><li> Fare Önceden ısıtılmış homeot yerleştirildi altında, temiz bir paslanmaz çelik levha üzerine yerleştirilirhermic battaniye sistemi (Harvard Apparatus, 507222F). Hayvan sıcaklığında 37 tutulur ° C. </li><li> Tüm uzuvları diz eklemi vücut (Şekil 1, panel A) ile dik açı yapar simetrik nedenle arka ayakları konumlandırmak için alınan bakım, aşağı bantlanır. </li><li> Cerrahi alan steril bir örtü ile kaplıdır. Tüm aletler otoklav veya sıcak boncuk sterilizasyon (Güzel Bilim Araçları, 18000-45) ve cerrah bir maske, önlük ve steril eldiven giyer ile sterilize edilir. </li></ol> 2. Tekrarlanabilir Siyatik Sinir Crush <ol><li> Hazırlandıktan sonra, orta hatta (Şekil 1) boyunca bir yarı-dairesel bir kesi cilt yapılır. Cilt hafifçe altta yatan kas disseke ve işlem sırasında yolu dışında kalması üzerine katlanır. Bu işlem sırasında 0.1 ml steril serum fizyolojik (Hospira, 0409-4888-20) uygulamaları kullanılarak nemli tutulur. </li><li> Gluteus maksimus ve biseps femori ön kafa arasındaki fasya uçağı Açılışs siyatik sinir (Şekil 1, panel A) açığa çıkarır. Cerrahi bir kontrol için, kontralateral siyatik sinirleri çıkarıldı ve harekete, ama sağlam bırakılmalıdır. Gluteal kasların daha sonra yeniden karşı çıkan ve 6-0 örgülü ipek, emilmeyen sütürler (Roboz, SUT-1073-1011) ile sütüre edilir. </li><li> Deneysel siyatik sinir sonra görselleştirme (Şekil 1, panel B) hafifletmek için yerinde Retraktörler ile, aynı şekilde maruz kalmaktadır. Retraktörler kullanmadan önce sterilize edilir. Not: retraktör ticari sistemler mevcuttur karşın, genellikle oldukça pahalıdır. Biz ucuz donanım malzemeleri ve böcek iğne (Malzemeler bölümüne bakınız) kullanarak tatmin edici bir retraktör sistemi yapmak için başardık. </li><li> Siyatik sinir yavaşça iridektomi makası kullanarak çevresindeki bağ dokusu arındırılır. </li><li> Güzel bir 5/45 (Güzel Bilim Araçları, 11251-35) forseps kullanarak sinir bir süper-ince hemostatik forseps alt çene (Güzel Bilim Too konulurls, 13020-12). Üç fasikül sıralı değil birbirlerinin üstüne (Şekil 1, inset B), hizalanır. Hemostatik forseps kendi ucundan 1.5 mm bir işareti ile kazınmış edilmiştir. Siyatik en dış bölümündeki ezme önce bu işareti uygun olarak yerleştirilir. Bu eşit genişlikte bir ezilme sağlar ve kırma gücü nedeniyle düzleştirildiğinde sinir hemostatik forseps pençesinden taşmadığından söyledi. Sinir forseps ucu ötesinde ise sinir sadece kısmen ezilmiş olacak. </li><li> Ezilme siyatik sinir yolunu yakınlaştıran bir iş parçacığı tarafından ölçülen, üçüncü ayak 45 mm sinir dik yapılır. Sinir hemostatik forseps 3 tıklama az 15 saniye boyunca bir kez ezilir. Bakım sinir germek için değil alınır. Hemostat yeniden açıldığında, tüm sinir ezilme yerinde saydam olmalıdır. </li><li> Önceden daldırma olmuştur hemostatik forseps ikinci bir çift (birinci özdeş)toz karbon (Fisher Scientific, C272-500) ezilme sitesi işaretlemek için kullanılır. Sinir 3 tıklama az 15 saniye boyunca aynı ezilme yerinde ezilir. Işaretleme yok karbon ilk çarpıldı sınır ötesine gerekir. Ezilme sitenin işaretleme hassas Gerekirse bu özellikle önemlidir. Kullanmadan önce, karbon tozu iki saat boyunca UV ışığına maruziyet ile sterilize edilir ve daha sonra steril tekniği kullanarak işlenir. <ol><li> Için karbon forseps önceden daldırma ancak cerrahi alanda yaygın karbon engel, forseps toz karbon açıldı, sonra yavaşça (ama tıklandığında değil) kapalı kapattı ve hemostat dışına karbon steril gazlı bez ile silinmelidir edilir . Forseps kırma yüzeyler eşit toz karbon kaplı olduğunu doğrulamak için en az 3x büyütme altında kontrol edilir. Gerekirse, tekrar daldırma ve silinir. </li></ol></li><li> Gluteal kas yeniden karşıt ve karşı taraf ile aynı şekilde dikilir edilir. </li><li> Son olarak, cilt insizyonu 9 mm refleks klipler (;: 500.345 tabancasına Dünya Hassas Aletler, 500.346) ile kapatılır. 9 mm refleks klipleri hareketi, küçük refleks klipler veya 6-0 sütür (Roboz, SUT-1073-1011) kısıtlamak için tespit edilirse yerine kullanılabilir. </li></ol> 3. Post-Operatif Bakım <ol><li> Bunlar hareketi belirtileri gösteren ° C&#39;ye kadar olan prosedür izlenerek, hayvanlara 37 az bir ısıtıcı yüzeyi üzerine yerleştirilir. </li><li> Bunlar daha sonra su ve gıda Hidrojel ve ıslak gıda şeklinde katta kolay sağlanır ev kafesi, geri hareket ettirilir. </li></ol> 4. Yarı İnce Hazırlama <ol><li> Pentobarbital aşırı dozda (300 mg / kg) takiben bacak kas siyatik sinir * açığa çıkarılır. İn situ kalan sinir ile, but 30 dakika süreyle buz üzerinde 0.1 M fosfat tampon içinde% 2 ve% 2 paraformaldehit gluteraldehid batırılır. * Tüm montaj kas hazırlığı tamamladıktan varsa, kasları hasat vardırsiyatik sinir maruz kalmadan önce ed. </li><li> Sinir dikkatle proksimal ucunda tek ele alınan bakım ile kaldırılır. Sonra, sinir, üç saat daha aynı sabitleştirici sonrası sabit olduğu. </li><li> Sabitlenmesinden sonra sinir 0.1 M fosfat tampon içinde üç kez yıkanır. </li><li> Sinir bir saat boyunca 0.1 M fosfat tampon içinde% 2 osmiyum tetroksit batırılır. </li><li> Sinir daha sonra artan konsantre etanol içinde sıralı daldırma (% 50,% 70,% 80,% 95,% 100,% 100, 100%) ile kurutulmuş olup. Her daldırma 15 dakikadır. </li><li> Susuz sinir üç dakika her biri için, propilen oksit iki kez inkübe edilir. </li><li> Sonra sinir propilen oksit bir 1:1 karışımından batırılır ve (genellikle bir gece boyunca), en azından 6 saat boyunca 812 Embed edilir. </li><li> Sonra sinir propilen oksit ve 2:1 karışımı batırılır ve bir gece boyunca 812 Embed. </li><li> Son olarak, sinir altı saat için saf Göm 812 daldırılmış olan, daha sonra uygun bir kalıp ve BA gömülü48 saat boyunca 60 ° C&#39;de Düşey Nokta Kuyu. </li><li> 1.0 mikron kesitler Toluidin blue ile bir bıçak cam ve vitray bir Ultracut UCT ultramicrotome (Leica) kullanarak ezmek sitesinden bir set mesafede distal sinir kesiği itibaren kesilir. İnce kesitler de elektron mikroskobu ile ultrastrüktürel incelenmesi için üretilebilir. </li></ol> 5.. Tüm Dağı Muscle Hazırlık <ol><li> İlk olarak farelere pentobarbital bir doz (300 mg / kg) ile itlaf edilmiş ve arka bacak dizlerde kaldırılır. </li><li> Arka bacak Dört kas analizi için kaldırılır: tibialis anterior (TA), ekstansör digitorum longus (EDL), soleus ve peroneus longus. </li><li> Tüm kasları dikkatli disseksiyon ile kaldırılır ve siyah bir sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) kaplı çanak kendi bağ dokusu ile tutturulmuş edilir. Bu 30 dakika için% 4 paraformaldehit in PBS ile yıkandı ve sonra tespit edilir. </li><li> TA daha sonra OCT (Fisher Scientific, 14-3 gömülü, PBS durulanır73-65), aseton ve hızlı bir şekilde ve kuru bir buz banyosu içinde donduruldu. <ol><li> Bu -80 ° C&#39;de bütün montaj hazırlığı başarısız durumda ince kesit boyunca saklanır. Genel olarak, TA yeterli bütün bağlar için çok kalın. </li></ol></li><li> EDL, soleus ve peroneus longus 0.1 M glisin * (Fisher Scientific, AC12007-0010; PBS ile seyreltilerek) yerleştirilir PBS ile 3 x 10 dakika boyunca çalkalanır 30 dakika boyunca, ve yine PBS içinde 3 x 10 dakika yıkanır. Daha sonra, -20 azından tam 5 dakika süreyle buz% 100 metanol ° C&#39;de söndürüldü, PBS ile 3 x 10 dakika yıkanır, ve alfa-bungarotoxin (PBS ile seyreltilerek 1:200) 30 dakika boyunca floresan konjuge yıkandığı edilir. Kasları, bir% 2 BSA ile 1 saat blok (KPL, 50-61-00) ve% 0.2 Triton X-100 (Nokta Scientific Incorporated, 9002-93-1) takip PBS ile 3 x 10 dakika boyunca çalkalanır Aynı% 2 BSA/0.2% Triton blok içinde seyreltilmiş Primer antikor kokteyli içinde 4 ° C&#39;de sallanan ederken PBS içinde *, ve bir gece boyunca inkübe edildi. * Glycine ve bloke edici çözümler kas hasat olarak aynı gün yapılır ve kullanımdan önce oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca karıştırılmaktadır. <ol><li> Bir fare monoklonal sinaptik vezikül işaretleyici (SV2 DSHB, 1:1000 sulandırılmış) ve rodamin konjuge alfa; akson ve nöromuskuler sinaps işaretlemek için, bir fare monoklonal nörofilaman marker kombinasyonu (1:1000 sulandırılmış Covance, SMI-312R) kullanabilirsiniz -bungarotoxin (Sigma-Aldrich, 1:200 oranında sulandırılmış). Reaktif Schwann hücreleri işaretlemek için biz tavşan anti-GAP-43 (Novus Biyolojik, NB300-143, 1/500 sulandırılmış) kullanın. Primer antikorlar bir IgG1 alt belirli floresein konjuge keçi anti-fare sekonder antikoru ve DyLight 649 konjuge eşek anti-tavşan (1:200 seyreltilmiş Jackson Immunoresearch) görselleştirilmiştir. </li></ol></li><li> Ertesi gün, kas 3 x 10 dakika süreyle PBS içinde yıkandı ve sekonder antikor olarak inkübe (% 2 BSA/0.2% Triton engelleme çözeltide) 1:200 seyreltilir. Bunlar daha sonra PBS ile yöne içinde 2 x 10 dakika yıkanır, ve başka bir 10 dakikalık PBS içinde durulama; 5 dakikalık bir DAPI batırıldıktan (deiyonize su içinde 300 nM ile seyreltilmiş Invitrogen, D3571) tarafından llowed. </li><li> Her kası daha sonra siyah bir sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) kaplı petri üzerinde disseke edilir. Iç kas lifleri (Şekil 3, panel AC) soyulmakta tarafından Başlangıçta tendonlar, kas içine yerleştirilmesi noktasında kaldırılır ve sonra kasları inceltilir. Bakım uç plakası bantları (Şekil 3, paneller DF) dahil olmak üzere kas dış yüzeyi, korumak için alınır. Çıkan kas vectashield (Vector Laboratories, H-1000) ve 22 ile artı slaytlar (Fisher Scientific, 12-550-15) üzerine monte edilir net oje tarafından mühürlenmiş x 40 mm cam lamelleri (Fisher Scientific, 12-548-5C) İki tarafta. Düzgün uç plakası bant temas coverslip slayt monte zaman. </li></ol> 6. Rejenerasyon Ölçme <ol><li> Rejenerasyon üç kasları (peroneus, EDL ve soleus) tahmin edilebilir. Biz genellikle eskion dört gün sinir ezilme sonra amin rejenerasyon, NMJs önemli bir yüzdesi yeniden innerve hangi bir zaman. Her iki önceki ve sonraki zaman noktalarında istenmektedir bilimsel söz bağlı olarak, hem de uygundur. Her kas, tüm uç plakası grubu yeniden innervasyon incelenmiştir. Sadece en face yüzey NMJs puanlanır. Bu şekilde, kas başına en azından 200 NMJs hızlı bir şekilde incelenebilir. </li><li> Kas skor yeniden innervasyon bir &quot;yeniden-innervasyon oranı&quot; belirler. Payda α-bungarotoxin bağlayıcı ve Schwann hücre GAP-43 immunoreaktivitesi etiketli olarak Denerve kas kavşağı sayısıdır. Numaratör olarak neurofilament/SV2 immunoreaktivitesi tarafından etiketli yeniden innerve NMJs sayısıdır. Gerekirse, NMJs ya kısmen (SV2 ile α-bungarotoxin eksik kapsama) veya tamamen (SV2 ile α-bungarotoxin tam kapsama) yeniden innerve olarak sınıflandırılabilir. Yeniden innerve ve Denerve NMJs ilişkin örnekler için Şekil 3, panellerin G ve H bakınız. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig1.jpg" /> Şekil 1. Sinir ezmek için önemli arka bacak anatomisi şematik. A. yarı dairesel bir cilt kesisi altta yatan kasları ortaya yapılmıştır. B. gluteal kasların (yukarıda adım 2.4) ayrılmış ve siyatik sinir ortaya çıkmıştır. Bir ok yaklaşık ezilme sitesini ifade eder. Retraktör yerleştirme genel bir kılavuz olarak gösterilir ve ezmek için hemostatik forseps siyatik ve yaklaşım görselleştirme kolaylaştırmak için her ameliyat sırasında ayarlanır B (ilave):. Sadece ezmek önce hemostatik forseps alt çenede siyatik Yerleştirilmesi (adım yukarıda 2.5). Ayrı fasiküller ezilme sırasında değil, dikey olarak da yatay bitişik olduğunu göstermek için etiketli, ancak. Rağmen üç FYSM&#39;yiicles Bu diyagram olarak etiketlenmiştir, bir de dördüncü bir fasikül, peroneal eklem şubesi görebilirsiniz. Siyatik sinirin dallanma düzeni daha ayrıntılı anatomik çizim ezilme noktasına distal fasikül için, Sıçan, Şekil 188 17 Greene&#39;nin Anatomi bakın. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig2.jpg" /> Şekil 2. Ezilmiş siyatik sinir yerinde ve Toluidin mavisi boyanmış, yarı ince kesitlerde bir karbon-işaretli ezilme sitesi. A. yerinde çarpıldı sitesi (sol arka bacak) bir örneği. Siyah karbon ezilme sitesinde gösterir. Yıldız uyluk kasları innervates ve ezilme ameliyat sırasında yararlı bir dönüm noktası olarak hizmet tibial sinirin bir dalı işaretler. Siyatik sinirin tibial bölümü mavi, yeşil peroneal belirtilen ve sarı. B. Yarı ince kesitlerde sural hemostatik kuvveti ile yapılan tam bir ezilme kanıtlıyorps. açılı forseps ile yapılan tamamlanmamış bir ezilme gösteren C. Yarı ince kesitler. Her iki görüntülerde yozlaşan miyelin profilleri ok uçları ile işaretlenir. Panelinde C okları korunmuş miyelin profillerinin örnekler ve kurtulmuş aksonların bir küme işaretleyin. Ölçek çubuğu 10 mm arasıdır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig3.jpg" /> Şekil 3 Tüm montaj kas şematik ve temsilcisi NMJs AC:.. EDL (A), peroneus longus (B) ve arka bacak çıkarıldıktan sonra soleus (C) kasların Rendered görüntüler. Gösterilen Kaslar sağ arka ekstremite gelmektedir. Diz ve ayak bileği anatomik yönü de referans olarak dahil edilmiştir. Tendonlar beyaz renkli ve kas üstüne konumlandırılmış zaman düz siyah bir çizgi özetlenmiştir. Onların kas altına uzatmak ne zaman siyah bir kesikli çizgi özetlenmiştir. Kesikler kırmızı kesikli çizgiler ile gösterilmiştir.Muscle gibi mavi oklarla gösterilen kesim siteleri, uzak soyulmuş ve sonradan inceltilir. Incelme sonrası, kas tutturulmuş tendonların kalanları etrafında keserek pimleri ayrılır DF:. Rendered görüntüleri bütün montaj kasların bağ doku ve incelme sonraki çıkarıldıktan sonra. Uç plakası bantları her kas özetlenmiştir GH:. On dört gün yeniden innervasyon (G) ve denerve (H) kas kavşağı gösteren siyatik sinir sonra Soleus bütün montaj kas. Yukarıdaki bölüm 5.5.1 açıklandığı gibi bu panellerde, NMJs, aksonlar ve Schwann hücrelerinin canlandırırlar. Asetilkolin reseptörleri, aksonlar yeşil kırmızı, mavi ve Schwann hücre işler. Panel G, oklar bir akson tarafından yeniden inerve edilmiştir NMJ alanlarını gösterir. Panelinde H ok uçları GAP-43 pozitif Schwann hücre süreçlerini gösterir. Akson olmadığına dikkat edin. Ölçek çubuğu 10 mm arasıdır.

<ol>
	<li>Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neurotoxic+and+neuroprotective+agents+on+peripheral+nerve+regeneration+assayed+by+time-lapse+imaging+in+vivo.">Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).</li><li>Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).</li><li>Amado, S., Sim&#241;es, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Lu&#237;s, A. L., Shirosaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hybrid+chitosan+membranes+and+N1E-115+cells+for+promoting+nerve+regeneration+in+an+axonotmesis+rat+model.">Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model.</a> Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+transplantation+effects+on+sciatic+nerve+regeneration+after+a+standardized+crush+injury+in+the+rat.">Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat.</a> Microsurgery. 28, 458-470 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+morphological+assessment+of+a+standardized+rat+sciatic+nerve+crush+injury+with+a+non-serrated+clamp.">Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp.</a> J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).</li><li>Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+assess+function+after+sciatic+nerve+lesion+in+the+mouse+-+adaptation+of+the+sciatic+static+index.">A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse - adaptation of the sciatic static index.</a> J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).</li><li>Ronchi, G., Raimondo, S., Varej&#227;o, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+crush+injury+of+the+mouse+median+nerve.">Standardized crush injury of the mouse median nerve.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).</li><li>Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin+G-2+ligand+mRNA+is+downregulated+in+spinal+motoneurons+after+sciatic+nerve+lesion.">Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion.</a> Neuroreport. 21, 782-785 (2010).</li><li>Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+potential+role+of+SOCS1+and+SOCS3+in+Wallerian+degeneration+in+injured+peripheral+nerve.">Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve.</a> Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).</li><li>Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+axonal+regeneration+in+the+central+and+peripheral+nervous+systems+of+the+NG2-deficient+mouse.">Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse.</a> BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).</li><li>Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+N-CAM+and+N-cadherin+expression+in+axotomized+and+crushed+rat+sciatic+nerve.">Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve.</a> J. Anat. 206, 69-78 (2005).</li><li>Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+nerve+crushes+with+a+non-serrated+clamp.">Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp.</a> J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Biz ezmek sitenin işaretleme hassas bir güvenilir tam siyatik sinir elde etmek için bir yöntem sunduk. Daha önce belirtildiği gibi, siyatik sinir farelerde ve sıçanlarda periferik sinir zedelenmesini ortak bir modeldir. Çarpıldı Her yöntemin avantajları ve dezavantajları olsa da, bu yöntemin kolayca özel donanım (örneğin özel kelepçeler, vb) minimum ile kutlandı tam bir ezilme üretilen bulundu. Crush Yöntemleri Fare siyatik sinir için kullan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Adı (tanım / miktar) </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> No 0000 Blade Mini Clipper </td><td> Roboz </td><td> RC-5903 </td></tr><tr><td> Nair Saç Çıkarıcı (9 oz.) </td><td> Kilise ve Dwight A.Ş. </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Betadine Cerrahi Ovalama (1 galon) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19066452 </td></tr><tr><td> Oftalmik merhem (1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19082795 </td></tr></tbody></table> Cerrahi Aletler: <table border="1"><tbody><tr><td> Adı (tanım / miktar) </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> FST 250 Sıcak boncuk sterilizatör </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18000-45 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Iris Makas (11 cm uzunluğunda) </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 500216 </td></tr><tr><td> Potts-Smith Forseps (Düz, 18cm; 1x2 Diş) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11024-18 </td></tr><tr><td> McPherson-Vannas Makas (5 mm bıçak) </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 14124-G </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Forseps - Dumoxel Standart İpucu </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11252-30 </td></tr><tr><td> Dumont # 5/45 Forseps - Dumoxel Standart İpucu </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-35 </td></tr><tr><td> Ultra İnce hemostat (Düz; Pürüzsüz İç Yüzeyler) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 13020-12 </td></tr><tr><td> Toz Aktif Karbon (500 gr) </td><td> Fisher Scientific </td><td> C272-500 </td></tr><tr><td> C-1 İğne (Steril, İpek, Siyah, Örgülü, ile Boyut 6-0 DikişlerEmilemeyen; 18 &quot;Uzunluk, 36 Kutu) </td><td> Roboz </td><td> SUT-1073-1011 </td></tr><tr><td> Refleks Klip tabancasına (9 mm klipler) </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 500345 </td></tr><tr><td> 9mm Paslanmaz Çelik Refleks Klipler (100/box) </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 500346 </td></tr></tbody></table> Hayvan Bakımı: <table border="1"><tbody><tr><td> Adı (tanım / miktar) </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> % 0,9 Sodyum Klorür (Koruyucu Ücretsiz; 20 ml) </td><td> Hospira </td><td> 0409-4888-20 </td></tr><tr><td> Esnek Prob ile komple sıcakkanlı Battaniye Sistemi (Orta, 115 VAC, 60 Hz) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 507222F </td></tr></tbody></table> Cerrahi Platform ve Retraktörler: (Yerel nalburdan satın) <table border="1"><tbody><tr><td> İsim (anlatma /) </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Paslanmaz Çelik Platformu (Öğütülmüş; ~ 12 &quot;x12&quot; x1 / 8 &quot;) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Düğme Mıknatıslar (Örnek: Eclipse E825) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Paslanmaz Çelik Cıvata (3 &quot;Uzun; Düğme mıknatıslar tarafından belirlenir Çapı) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Paslanmaz Çelik Kuruyemiş (Cıvata Sığdırmak için Büyüklükte) </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Kauçuk Gruplar (Işık Gerilim) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Böcek Pins (Ends Hem Hooks Form Bent) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Yarı incelir: <table border="1"><tbody><tr><td> Adı (tanım / miktar) </td><td> Tedarikçi &lt;/ Strong&gt; </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Paraformaldehit (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat Dibazik Susuz (500 gr; Fosfat Tampon hazırlamak için kullanılır) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat mono Susuz (1 kg; Fosfat Tampon hazırlamak için kullanılır) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> Glutaraldehit (% 50; 10 x 10 mL) </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 18431 </td></tr><tr><td> Osmiyum tetroksit (4% Sulu, 10 x 10 mL) </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 18465 </td></tr><tr><td> Propilen oksit (450 mL) </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 18601 </td></tr><tr><td> Embed 812 (Kit, sert blok / yüksek görüntü kontrastı için) </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> ToluidiD Blue (25 g) </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 19451 </td></tr></tbody></table> Tüm Dağı Muscle Hazırlama ve İmmünohistokimya: <table border="1"><tbody><tr><td> Adı (tanım / miktar) </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Paraformaldehit (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat Dibazik Susuz (500 gr; Fosfat Tampon hazırlamak için kullanılır) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat mono Susuz (1 kg; Fosfat Tampon hazırlamak için kullanılır) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> % 10 BSA seyreltici / engelleme Çözelti (200 mL) </td><td> Kirkegaard &amp; Perry Laboratories, Inc </td><td> 50-61-00 </td></tr><tr><td> Triton X-100 (100 mL) </td&gt; <td> Nokta Bilimsel Incorporated </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Glisin,% 98 (1 kg) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12007-0010 </td></tr><tr><td> Doku-Tek Cryo-OCT Bileşik (12 Olgu; 4 oz şişe) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-373-65 </td></tr><tr><td> Sylgard DOW 170 (£ 2 Kiti) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9492579 </td></tr><tr><td> Paslanmaz Çelik Böcek Pimler, Boyut 1 (100/pkg) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26001-40 </td></tr><tr><td> Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0195-.5MG </td></tr><tr><td> SMI-312 (0.1 mL) karşı fare monoklonal antikor </td><td> Covance </td><td> SMI-312R </td></tr><tr><td> SV2 (0.1 mL) karşı fare monoklonal antikor </td><td> Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası (DSHB) </td><td> SV2 </td></tr><tr><td> Tavşan PolyGAP-43 Karşı klonal antikor </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB300-143 </td></tr><tr><td> Flöresein Konjuge Keçi anti-fare IgG, Özgül Fcγ Sınıfı 1 </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=115-095-205&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">11 5-095-205</a> </td></tr><tr><td> DyLight 649 Konjuge Eşek Anti-tavşan IgG </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=711-495-152&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">711-495-152</a> </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, dilactate; 10 mg) </td><td> Invitrogen </td><td> D3571 </td&gt; </tr><tr><td> Montaj Vectashield Orta (10 mL) </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H-1000 </td></tr><tr><td> SuperFrost Plus Mikroskop Slaytlar (Beyaz; Boyut: 75 x 25 mm; 144 adet) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium Kapak Camları (Boyut: 40 x 22 mm, 1 oz Paketi.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5C </td></tr></tbody></table>

reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis

Periferik sinir sistemi (PNS) rejenerasyon yaygın insan hastalıkla ilişkisi ve böylece muhtemel MSS rejenerasyon 1 başarısızlıkları aydınlatarak PNS nöronlar tarafından monte sağlam rejeneratif yanıtı anlamak için hem de çalışılmıştır. Siyatik sinir ezilme (axonotmesis) kemirgenlerde 2 periferik sinir hasarı en yaygın modellerden biridir. Bu rejenerasyon 3,4 optimum yani kesmeleri Kırma tüm aksonlar ama Schwann hücre bazal lamina korunur. Bu araştırmacı tam Schwann hücresi ve bazal lamina 4 hem de etkileşim için büyüyen bir akson yeteneği çalışma sağlar. Sıçanlar, genellikle deneysel sinir ezme için tercih edilen hayvan modellerinde olmuştur. Bunlar yaygın olarak bulunmaktadır ve bunların lezyonlanan siyatik sinir insan sinir lezyonları 5,4 makul bir yaklaşım sağlar. Sıçan sinir büyüklüğünden daha küçük olsa da, farenin sinir birçok benzer niteliklere sahiptir. En önemlisi de, mouse modelleri, çünkü transjenik hatları geniş yer giderek değerli artık rejenerasyon 6, 7 için kritik bireysel molekülleri ayrıntılı bir Diseksiyon için olanak sağlar. Önceki araştırmacılar basit açılı forseps, soğutulmuş forseps, hemostatik forseps, vasküler kelepçeler ve araştırmacı tasarlanmış kelepçeler 8,9,10,11,12 dahil olmak üzere bir sinir ezilme veya yaralanma üretmek için birden çok yöntem kullanılmıştır. Araştırmacılar ayrıca dikiş, karbon partikülleri ve floresan boncuk 13,14,1 dahil olmak üzere yaralanma sitede işaretleme çeşitli yöntemler kullandılar. Biz doğru ve kalıcı güzel bir hemostatik forseps ve işaretleme sonraki karbon ezilme-sitesini kullanarak ezilme yerinde işaretleme ile bir tekrarlanabilir tam siyatik sinir elde etmek için bizim bir yöntem sunduk. Siyatik sinir prosedürü bizim açıklamasına bir parçası olarak biz de kas bütünün nispeten basit bir yöntem dahil ettik biz daha sonra rejenerasyon ölçmek için kullanabileceğiniz monte edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis at JoVE.com

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Bu yazıda fare siyatik sinir ezmek için bir metodu tanımlar. Bu yöntem, hazır hemostatik forseps kullanır ve kolay ve tekrarlanabilir tam siyatik sinir üretir. Buna ek olarak, siyatik sinir sonra rejenerasyon analizi için uygun kas bütün bağlar hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

reproducible-mouse-sciatic-nerve-crush-subsequent-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.4K Görüntüleme.  Temple University. Bu yazıda fare siyatik sinir ezmek için bir metodu tanımlar. Bu yöntem, hazır hemostatik forseps kullanır ve kolay ve tekrarlanabilir tam siyatik sinir üretir. Buna ek olarak, siyatik sinir sonra rejenerasyon analizi için uygun kas bütün bağlar hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Video: Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we demonstrate and describe a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on the following steps: (1) dissection of nerve fascicles and separation of connective tissue; (2) incubation of short segments of nerve fascicles in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures; and (3) extraction of the remaining axon-enriched material. Proteomic and biochemical characterization of this preparation has confirmed a high degree of enrichment for axonal components.

We demonstrate a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on dissection of nerve fascicles and incubation in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material.

Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Nörobilim

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Yetişkin Tüm Dağı Hazırlık Drosophila Dev Fiber Boya Enjeksiyon Ventral Sinir Kablosu

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

Mantar Formu, Sirkülasyon ve Damak Tat Tomurcuklarının Bütün Montajlı Boyama, Görselleştirme ve Analizi

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In addition, in the research field of movement disorders, sciatic crush injury has been employed to trigger a dystonia-like phenotype in genetically predisposed DYT-TOR1A rodent models of dystonia. To achieve consistent, reproducible and comparable results after a sciatic nerve crush injury, a standardized method for inducing the nerve crush is essential, in addition to a standardized phenotypical characterization. Attention must be paid not only to the specific assortment of behavioral tests, but also to the technical requirements, the correct execution and consecutive data analysis. This protocol describes in detail how to perform a sciatic nerve crush injury and provides a behavioral test battery for the assessment of motor deficits in rats that includes the open field test, the CatWalk XT gait analysis, the beam walking task, and the ladder rung walking task.

We provide a protocol for the assessment of motor behavior via a behavioral test battery in rats after sciatic nerve crush injury.

Tek Taraflı Siyatik Sinir Ezilme Yaralanması Sonrası Sıçanlarda Motor Davranışın Multifaktöriyel Değerlendirilmesi

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high morphological and functional plasticity. In numerous nervous system disorders, NMJ is an early pathological target resulting in neurotransmission failure, weakness, atrophy, and even in muscle fiber death. Due to its relevance, the possibility to quantitatively assess certain aspects of the relationship between NMJ components can help to understand the processes associated with its assembly/disassembly. The first obstacle when working with muscles is to gain the technical expertise to quickly identify and dissect without damaging their fibers. The second challenge is to utilize high-quality detection methods to obtain NMJ images that can be used to perform quantitative analysis. This article presents a step-by-step protocol for dissecting extensor digitorum longus and soleus muscles from rats. It also explains the use of immunofluorescence to visualize pre and postsynaptic elements of whole-mount NMJs. Results obtained demonstrate that this technique can be used to establish the microscopic anatomy of the synapsis and identify subtle changes in the status of some of its components under physiological or pathological conditions.

The ability to accurately detect neuromuscular junction components is crucial in evaluating modifications in its architecture because of pathological or developmental processes. Here we present a complete description of a straightforward method to obtain high-quality images of whole-mount neuromuscular junctions that can be used to perform quantitative measurements.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...