Alt zeytin medullanın en ventral kısmıdır ve bu nedenle canlı bir hayvanda ulaşmak son derece zordur. Burada, yetişkin fare beyninin ventral taraftan sapını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz ve kalsiyum sensörlerini ifade eden alt zeytin nöronlarındaki nöronal aktiviteyi kaydetmek için GRIN lensleri kullanıyoruz. Bu yöntem, yaşam açısından kritik beyin sapının zarar görmesini önler ve uzamsal-zamansal aktivite kalıpları ve alt zeytinde girdi entegrasyonu üzerine incelemeler sağlar.
Operasyon birçok hayati yapıya sahip kompleks boğaz bölgesinde yapıldığı için üst düzey cerrahi becerilere sahip bir araştırmacı tarafından yapılması esastır. 20 kalibrelik kateterin ucundan 5 ila 6 milimetre uzunluğunda ve 0,8 milimetre genişliğinde bir yarık keserek bir entübasyon tüpü hazırlayın. Ucunu keserek kör ve kavisli bir iğne hazırlayın, kırılma yüzeyini zımparalayın ve plier ile bükün.
Bu trakeotomi sırasında bir trakeayı desteklemek için kullanılacaktır. Mililitre ketamin başına 15 miligramı salin ile seyreltin% 15 Ameliyat aletlerini ve sarf malzemelerini birleştirin. Isıtma yastığını 38 santigrat dereceye ayarlayın.
Burun katını stereotaksik çerçevede yatay olarak 180 derece çevirin. Daha önce virüs taşıyan GCaMP6s tarafından trans enfekte olan fareyi tartın ve enjeksiyon için seyreltilmiş ketamin miktarını hesaplayın. İndüksiyon kutusunu % 5 izofluran ile önceden doldurun ve fareyi uyuşturun.
Fareyi stereotaksik çerçeveye, ventral taraf yukarıya monte edin. Fare boğazını ve uyluk bölgesini tıraş edin. Artık saçları epilasyon kremi ile çıkarın.
Boğaz derisine topik olarak ksylocaine jöle uygulayın. Fare sıcaklığını rektal termal sensörle izleyin. Önceden ısıtılmış bir mililitre salin intraperitoneally enjekte edin.
Anestezinin derinliğini arka ayak parmaklarında güçlü bir tutamla değerlendirin. Algılanabilir yanıt çağrılmamalıdır. Orta hat boyunca boğaz derisinde dikey bir kesi yapın.
Künt diseksiyon yöntemi ile boyun derisini altındaki visseradan ayırın ve cildi kesin. Tükürük bezlerini bağ dokusundan serbest bırak ve sternotiroid kas kaplı trakeayı ortaya çıkarmak için yanal olarak çevirin. Intraperitoneally hayvan ağırlığı kilogram başına beş mililitre seyreltilmiş ketamin ilk doz enjekte.
Sternotiroid kası orta hat boyunca ince bir önps ucuyla dikkatlice bölerek nefes borusuna maruz kalabilirsiniz. Trakeayı kan damarlarından ve yemek borusundan künt diseksiyon yöntemi kullanarakps ile ayırın. Kilogram hayvan ağırlığı başına 2,5 mililitrede ikinci doz seyreltilmiş ketamin enjekte edin.
Çapraz olarak nefes borusuna künt bir iğne yerleştirin. Künt iğne ile nefes borusu kaldırın. Dikiş ipliğinin üçüncü trakea halkasının etrafından dolandırılmasını, tiroid bezini yarım daire iğne ile kaudal hale getirin.
Bu halkaya dört alet bağı yap. Göğüs derisini aynı yarım daire iğnesi ile delin ve ipliği cilde yönlendirin. Nefes ucsunu iplikle hafifçe kaldırın ve trakea kaudalini tiroid bezine kesin.
Nefes nefesini göğüs derisine doğru çekin. Altına küçük bir parça cerrahi sünger ekleyerek nefes borusunun açılmasını kaldırın. Nefes borusunun açma ucunun içinde kalan sıvıyı ince bir temizleme dokusu şeridi ile çıkarın.
izofluran akışını stereotaksik burunkondan entübasyon tüpüne geçirin. Entübasyon tüpünü nefes borusuna yerleştirin. Nefes almaya izin vermek için tüpteki yarığın bir kısmının nefes borusunun dışında kaldığından emin olun.
Üç ila dört alet bağı yaparak nefes borusunun fare göğsü derisine sabitlenerek sabitlenin. Entübasyon tüpünü sabitlemek için nefes borusunu dikiş ipliğine bağlayın. Sternotiroid kası ince önps ile kas lifleri boyunca kesin.
İzole edilmiş kısmı yay makası ile kesin. Kastaki kan damarlarındaki hasarı en aza indirmek için kastan arta kalan trakea ve larenksi dikkatlice serbest bırakın. Kalan trakea ve larenksi çıkarın.
Yemofagusun, ekli dokudanps ile serbest bırakın ve yay makası ile kesin. Beyin sapı ve atlasın ventral kemerini kaplayan boyuna kası çıkarın. Atlas ventral kemerini ve ön tüberkülünü kaplayan kası çıkarın.
Atlasın ventral kemerlerini rongeur ile kesin. Atlasın ön tüberkülünü çıkarın. Foramen magnum ve beyin sapını görüntülemek için kanı ve sıvıyı çıkarın.
Rongeur ile oksipital kemiği çıkararak foramen magnum'unu genişletin. Kıkırdağı çıkarın ve ventral beyin sapının net bir görünümüne sahip olmak için dura mater'in periosteal tabakasını ince tokmaklarla dikkatlice soyun. Kalp atış hızı, oksijen doygunluğu ve nefes hızı gibi hayati belirtileri izlemek için SpO2 sensörünü farenin uyluğuna sıkıştırın.
GRIN lensi implantasyon çubuğuna takın. Lensi %70 etanol batırılmış temizleme dokusu ile dikkatlice temizleyin. İmplantasyon çubuğunu stereotaksik çerçeveye sabitlenin ve minyatür mikroskobu implantasyon çubuğuna monte edin.
GRIN lensin daldırılması için beyin sapı alanına birkaç damla salin ekleyin. GRIN lensle beyin sapına yaklaşın. Yüzeysel alanda alt zeytin nöronlarını ifade eden GCaMP6'lar dikdörtgen şeklindeki bir bölgede, kalan atlasa yaklaşık 0,5 ila 1,7 milimetre rostral ve orta çizgiye yaklaşık 2,6 ila 1,1 milimetre yanal olarak bulunabilir.
GCaMP6s transfected inferior zeytin nöronlarını bulmak için minyatür mikroskoptaki heyecan mavisi LED'i açın. Nöronlar, çeşitli GCaMP6s ekspresyon seviyesi nedeniyle farklı taban çizgisi floresan yoğunluğu gösterir. Soldaki videoda daire içine alınmış alt zeytin nöron somatasının kalsiyum seviyesinin değişmesi, bize delta F'nin sağdaki F izleriyle bölündüğünü gösterecektir.
Fare sıcak ve nemli tutulsa da, uzun süreli anestezi ve ameliyatla kaçınılmaz olarak zayıflayacaktır. Farenin fiziksel durumunun kayıt için iyi olması için ameliyat süresini kısa tutmak önemlidir. Yetenekli bir araştırmacı ameliyatı 70 dakikada bitirebilir.
Bu yöntem, değişikliklerle, ventral beyin sapının diğer bitişik bölgelerini incelemek için kullanılabilir.
