Bu protokol, deniz pelajik tunicate Oikopleura dioica için uzun vadeli, güvenilir bir kültür sisteminin nasıl kurulabildiğini görsel olarak göstermektedir. Oikopleura kültür sistemi, ekoloji, gelişim, genomik ve evrimle ilgili çok çeşitli biyolojik alanları araştırmak için temel kaynaklar sağlar. Bu türün kısa bir yaşam döngüsü, yüksek fecundity vardır, ve kolayca kıyıdan toplanabilir, mükemmel bir model organizma yapma.
Bu protokol O.dioica için optimize edilmiş olsa da, diğer planktonik organizmalara uygulanabileceğini umuyoruz. Başlamak için, filtrelenmiş deniz suyu otoklavlama ile başlayan, Oikopleura kültürünü sürdürmek için alg gıda başlatmak. Chaetoceros calcitrans bir stok kültürü başlatmak için, otoklav deniz suyu 60 mils aşağıdaki ile takviye edildi:30 vitamin mikrolitre, çözelti A 30 mikrolitre, sodyum silikat 15 mikrolitre, ve streptomisin 60 mikrolitre.
Son olarak, bir önceki stok kültüründen 30 mikrolitre C.calcitrans bir inoculant olarak eklenmiştir. Diğer alg türleri ve kültür türleri için ek ve aşılama hacimleri ile ilgili el yazmasında tablo ikiye bakın. Aşılamadan sonra, stok ve alt kültürler sürekli aydınlatma ile 17 santigrat derecede bir kuluçka korunur.
Yaklaşık 10 gün sonra, alg büyüme şişeleri renkli olma tarafından doğrulanır. Bu durumda, aynı kuluçka makinesinde alt kültür korurken bir aya kadar dört santigrat derece stok kültürleri uzun vadeli depolama için taşıyın. Bir çalışma kültürü oluşturmak için, otoklavlı deniz suyu 400 mils gerekli takviyeleri ekleyin ve önceki alt kültür 100 mils ile aşılamak.
Şişeyi kauçuk bir kapakla kapatın, bir milimetrelik tek kullanımlık pipet takın ve onları bir yosun istasyonuna taşıyın ve sekiz saatlik fotoperiod ve sabit havalandırma ile oda sıcaklığında muhafaza edin. Şişenin alt kısmında toplanmayı önlemek için günde iki kez el ile alg kültürleri girdap. Alg kültürleri kurulduktan sonra, yerel bir sitede alan örnekleri toplayın.
Bir plankton ağı atın ve morina ucunun yüzeyin bir ila iki metre altına batmasını bekleyin. Ağı saniyede yaklaşık 5 ila bir metre hızla çekin. İki ila beş dakika boyunca ileri geri çekme devam edin.
Çekme süresi yerinde plankton bolluğuna göre ayarlanmalıdır. Çekme sonra, dikkatle net kaldırın ve yavaş yavaş 500-mil, cam şişe morina ucu içeriğini aktarın. Taşıma sırasında hayvanlariçin strese neden olabilir hava kabarcıkları önlemek için kenarına şişe doldurun.
Bu aşamada, Oikopleura varlığı karanlık bir arka plan karşı örnek şişeler görüntüleyerek teyit edilebilir. Ancak, tür düzeyinde tanımlama için mikroskobik gözlem gereklidir. Üç 500 mil lik şişe toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
Bir CTD profilleyicisi ile tuzluluk, sıcaklık ve klorofil konsantrasyonu kaydetmek için yüzey deniz suyu toplayın. Ayrıca, laboratuvar koşullarına hayvanların uyum yardımcı olmak için yerinde deniz suyu 10 ila 15 litre toplamak. Hayvanları uyumsağlamak için, numune alanından yüzey deniz suyunun bire bir oranını ve laboratuvarda tutulan filtrelenmiş deniz suyunu hazırlayın.
Son hacim plankton numunesinin konsantrasyonuna bağlı olarak 5 ila 10 litre arasında ayarlanmalıdır. 500 millik numuneyi hazırlanan kabın üzerine dikkatlice ekleyin. 15 RPM'de dönen senkron bir motora bağlı bir kürek kullanarak planktonu bir gecede süspansiyonda tutun.
Ertesi sabah, göz Oikopleura varlığını kontrol edin. Hayvanları petri kabına aktarın ve pozitif bir tanımlama için büyütme 20 ila 40 kez arasında ayarlanmış karanlık alan mikroskobu altında gözlemleyin. Oikopleura yarı saydam bir evin içinde kuyruklarını dalgalandıran kurbağa yavrusu şeklinde hayvanlar olarak karakterize edilir.
O.dioica onaylamak için, sarı gonadlar veya yumurta ile kadın ile tam olgun erkek arayın. Hayvanlar olgunlaşmamışsa, kuyruğun distal yarısında iki subkorneal hücrenin varlığını arayın. Bunlar hem olgun hem de olgunlaşmamış hayvanlarda bulunur.
Türler onaylandıktan sonra, onları yeni bir Petri kabına aktarın. Bu işlemi 10-20 kişi tür düzeyinde onaylanana kadar tekrarlayın. Hiçbir O.dioica bulunursa, bir ya da iki gün daha karıştırarak beher tutun.
Başlangıçta gözlemlenebilen küçük O.dioica büyümeye ve daha kolay görmeye devam edecektir. Bir hafta sonra hiçbiri görünmüyorsa, örneği atın ve yeniden örneklemeyi deneyin. Bir monokültür kurmak için, filtrelenmiş deniz suyu beş litre bir alan örneğinden 120 O.dioica izole.
Ertesi sabah, sarı gonadlar tarafından tanımlanan tam olgun erkekler ve parıldayan, altın küreler olarak görünen yumurta ile dişiler için arayın. 15 erkek ve 30 dişinin beş milimetrelik, künt uçlu pipetini 2,5 litre filtrelenmiş deniz suyu içeren bir kabına hafifçe aktararak bir yumurtlama kabı hazırlayın. Manuel transfer sırasında fiziksel stresi en aza indirmek için, yavaş yavaş yeni deniz suyu yüzeyinin altında hayvanları bırakın.
İzole edilmiş yetişkinlerin doğal olarak yumurtlamasını bekleyin. Yumurtlamadan sonra, yumurtlama kabının altından 5 ila 10 mil deniz suyu çıkarılarak ve mikroskop altında dekolteli yumurtalar tespit edilerek başarılı bir döllenme teyit edilebilir. Yumurtlamadan sonraki ilk sabah, ilk gün, şişirilmiş evleri olan yeni nesil genç hayvanlar kabın içinde görünmelidir.
Hayvanları 7,5 litre taze, filtrelenmiş deniz suyu içeren yeni bir kabına nazikçe aktarmak için 500 millik, el malı bir kabı kullanın. Türbülans ve kesme kuvvetlerini en aza indirmek için içeriği yavaşça yüzeye dökün. Yumurtlamadan sonraki ikinci sabah, ikinci gün, 150 hayvanı beş litre taze, filtrelenmiş deniz suyu içeren yeni bir kabına elle aktarın.
Üçüncü sabah yumurtlama sonrası, üçüncü gün, elle taze, filtredeniz suyu beş litre ile yeni bir beher için 120 hayvan aktarın. Dördüncü gün, cinsel olgun, yetişkin hayvanlar mevcut olmalıdır. Yeni nesil başlatmak için filtre deniz suyu 2,5 litre ile yeni bir yumurtlama kabı için 15 erkek ve 30 kadın toplamak.
Bu süreç kültür hayatı boyunca tekrarlanır ve sürdürülmektedir. O.dioica monokültürkorumak için, alg gıda çalışma kültürleri her gün hazırlanır. Hayvanlar günde üç kez beslenirler.
660 nanometrelik bir spektrofotometre seti kullanarak çalışma kültürünün emiciliğini ölçerek günlük gıdaları hazırlayın. Emicilik değerleri, hedef O.dioica kültür hacimleri ve hayvan olgunluğu, günün beslenmesi için gerekli olan yosun hacmini hesaplamak için önceden belirlenmiş bir alg büyüme eğrisine dayalı hazırlanmış bir elektronik tabloya yerleştirilir. Pipet 50-mil tüpler halinde hesaplanan hacimleri ve oda sıcaklığında beş dakika için 5, 000g santrifüj.
Yavaş yavaş supernatant dökün ve dikkatle yukarı ve aşağı peletli yosun yeniden askıya almak için pipet. Tüpleri orijinal hacimlerine taze, filtrelenmiş deniz suyuyla doldurun. Elektronik tablodaki günlük alg besleme grafiğine göre, belirtilen miktarı her bir kabı9 a.m ile besleyin.
12 p.m. ve 5 .m. Otomatik bir dozaj pompası 5 p.m hayvanları beslemek için ayarlanabilir.
hafta sonları culturing personel varlığı olmadan. Her beslemeden sonra, bir sonraki yem için kullanılmak üzere hazır olana kadar dört santigrat derece hazır hazırlanan alg gıda korumak. O.dioica 100 mikron örgü ve filtre olmayan morina ucu ile donatılmış değiştirilmiş bir plankton net nazik çekme tarafından bir limandan toplanabilir.
2015 ve 19 yılları arasında örnekleme Okinawa limanlarında O.dioica varlığında mevsimsel varyasyon gösterdi. Yüzey deniz suyu sıcaklığı hayvanların varlığını etkilemek gibi görünüyordu. Yüzey deniz suyu sıcaklığı 28 derece veya daha yüksek olduğunda O.dioica hakimdi.
O.dioica 24 ila 27 derece arasındaki sıcaklıklarda Oikopleura longicauda ile birlikte vardı. Ancak, O.longicauda 23 derecenin altındaki sıcaklıklarda hakimoldu. Tuzluluk değişiklikleri O.dioica bolluğu ile ilişkili değildi.
Kararlı O.dioica kültür sistemleri kurmak için en önemli üç faktör çok adımlı filtrasyon sistemi ile yüksek su kalitesini korumak, optimum besleme rejimi belirlenmesi, tercihen alg standart eğrileri oluşturarak, ve erkek ve kadın yeterli sayıda yumurtlama bearesi hazırlanması. Sağlanan protokolütaki o.dioica'nın yaşam döngüsü 23 derecede dört gündür. O.dioica'nın altı bağımsız nüfusunu güvenilir bir şekilde oluşturduk ve bunların hepsi 20 nesilden fazla sürdü.
Sonuç olarak, O.dioica istikrarlı bir kültür kurulması hızlı ve maliyet-etkin yapılabilir. Uygun bir kurulum ile, istikrarlı bir kültür bir hafta içinde elde edilebilir. Küçük genomu ve hızlı yaşam döngüsü ile birlikte, bu O.dioica güçlü bir kordat modeli tür yapar.
O.dioica hem yapay hem de doğal deniz suyunda muhafaza edilebilir. Alg gıdauzun uzun süreli depolanması katı kültür ve kriyopreservation kullanılarak mümkündür. Buna ek olarak, O.dioica sperm de kriyoopreserved olabilir ve bir yıldan fazla canlı kalır.
O.dioica çeşitli biyolojik alanlarda güçlü anlayışlar sağlamaya devam etmektedir. Yerel mevsimsellik anlayışı, titiz bir kültür sistemi ve birkaç adanmış bireyler, az çabayla etkili bir kültürün kurulmasına olanak sağlar.
