Bu çalışma, OOM'ye verilen CBS Bridging Grant tarafından finanse edilir. OOM, PAA ve AS çalışmayı tasarladı ve deneyleri gerçekleştirdi. AS ve PAA sonuçları analiz etti. Makaleyi OOM ve PAA hazırladı. Dr. Karl Disseroth'a (Stanford Üniversitesi) AAV'ı kullanımımıza sunduklarından dolayı teşekkür ederiz.

Tüm deneysel ve hayvan işleme prosedürleri Louisiana Eyalet Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Deneysel hayvan
<ol><li>5-6 haftalık fareler kullanın.</li>
	<li>12 saat değişen ışık ve karanlık döngü standart koşulları altında kafes başına 3-5 hayvan barındırın. Yiyecek ve su reklam libitum sağlanmalıdır.</li>
</ol>2. Kraniyotomi ve hayvan hazırlığı
NOT: Bu bölümde fare kraniyotomisi için ameliyat öncesi ve peri-operatif prosedürler açıklanmaktadır. Standart stereotaktik aparat ve uygun koordinatları kullanın (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML ve Dorsoventral: DV). İlgi çekici beyin bölgesinin koordinatlarını belirlemek için bir fare beyin atlasına bakın.
<ol><li>Fareleri intraperitoneal ketamin (100 mg/kg)/ksilazin (10 mg/kg) kokteyl enjeksiyonu ile uyuşturun. Ameliyat başlamadan önce his olmamasını sağlamak için bir parmak sıkışma testi gerçekleştirin. NOT: Alternatif olarak, bu adım için uygun burun odasına sahip izofluran anestezisi de kullanılabilir.</li>
	<li>Hayvanın başını stereotaksik aparat üzerine hafifçe sabitlayın. NOT: Bu işlem sırasında hayvanları dikkatli bir şekilde ele almak önemlidir. Ayrıca, ameliyata devam etmeden önce nefes alma oranını ve diğer hayati değerleri kontrol edin. Stresi azaltmak için hayvanın ~7 dakika dinlenmesine izin verin.<ol>
<li>Stereotaksik çerçeveye, hayvanın vücudunun üzerinde yatarak yatarak bir ısıtma yastığı yerleştirin. Bu, vücut sıcaklığını korumaya ve hayvanı prosedür dışında olsa da sıcak tutmaya yardımcı olacaktır. Ameliyat sonrası bakım ve iyileşme için ısıtma yastığını saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saç derisinin üzerindeki saçları çıkarmak ve cildi iyot çözeltisi ile temizlemek için bir makas kullanın.<ol>
<li>Kafa derisindeki hissi engellemek için topikal lidokrin uygulayın.</li>
		<li>Önden oksipital bölgeye uzanan orta çizgili bir kafa derisi kesisi yapmak için neşter kullanın.</li>
		<li>Kesi alanını iyot çözeltisi ile temizleyin, ardından calvaria'yı açığa çıkarın. NOT: Periosteumu kalvariden çıkarmak için az miktarda% 3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulanabilir. Bu, simge yapıların (bregma ve lambda) ve dikişlerin görünürlüğünü artıracaktır.</li>
		<li>Fare beyni stereotaktik atlası kullanarak, bregmaya göre AP ve ML koordinatlarını belirleyin.</li>
		<li>VTA enjeksiyonu için, ultra ince künt noktalı iğne şırıngasını (örneğin, Nöros şırıngası) AP koordinatlarına yerleştirin: -3,08 mm/ML: bregmaya göre 0,5 mm.</li>
		<li>İşaretli AP/ML koordinatında kafatasında 1 mm'lik bir delik (kraniyotomi) delik açmak için bir delme aleti kullanın. NOT: Bu adım önemli düzeyde dikkat gerektirir. Matkap ucunun beyin dokusunu ezmemesi için delme yaparken minimum basınç uygulanmalıdır. Mevcut çalışmada matkap ucu 0,8 mm idi ve matkap hızı 15.000 rpm olarak belirlendi. DİkKAT: Kesi veya kalvarinin temizlenmesinde hidrojen peroksit kullanılmışsa, çözeltinin tamamen çıkarılmasını sağlayın veya delmeden önce tam kuruluk sağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AAV kokteyl enjeksiyonu
NOT: Bu bölümde yetişkin C57BL/6 farelerin VTA'sına (23-27 g) AAV enjeksiyonu işlemi açıklanmaktadır. Açıklanan yöntem, standart stereotaktik aparatlar ve uygun koordinatlar kullanılarak herhangi bir beyin bölgesine AAV enjeksiyonu için kullanılabilir. Bu protokolü göstermek için, eYFP ve hChR2, VTA glutamat nöronlarında CaMKIIα promotörü altında AAV5 aracılı transfeksiyon kullanılarak ifade edilmiştir (Şekil 1). Cre-lox rekombinasyonu bu adım için de kullanılabilir.
<ol><li>Bir enjektöre ultra ince künt nokta iğnesi (32 G; 100 nL doğrulukta 5 μL kapasiteli) ile bir şırınga takın. Şırınga tutucuyu bir mikromanipülatöre sabitle. NOT: Bu prosedür için 1,6 nL kalibrasyonlu manuel şırınna tutucu kullanılmıştır. Otomatik bir enjektör de kullanılabilir.</li>
	<li>Sıvı akışını temizlemek ve test etmek için şırınnayı çift damıtılmış su ile doldurun.</li>
	<li>Buz üzerinde AAV (serotype 5) kokteyli aliquots çözün. AAV'ler iyi ifade için viral titreyi korumak için en iyi şekilde -80 °C'de saklanır.</li>
	<li>Monte edilen şırınnayı 1.000 nL AAV çözeltisi (fosfat tamponlu salin (PBS) 10 mM), pH 7.4 ile doldurun. İğneyi bir enjeksiyon bölgesine indirmeden önce sıvının akışını onaylamak için AAV çözeltisinin 10 nL'sini dağıtın.</li>
	<li>İğneyi stereotaktik olarak istenen derinliğe (DV koordinatı) indirmek için bir mikromanipülatör kullanın. İğneyi istenen derinliğe indirdikten sonra, şırınganın enjeksiyondan önce 10 dakika yerinde kalmasını kesin. NOT: Bu işlem için iğne, beynin pial yüzeyinden 4,5 mm derinlikte (DV) VTA'ya indirildi. Diğer beyin bölgeleri için uygun dorsoventral koordinatı kullanın (fare beyin atlasına bakın).</li>
	<li>VTA'ya 600-800 nL AAV enjekte edin. Enjeksiyon hacmi hedef sitenin boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir.<ol>
<li>AAV çözümünü 60 nL/dk (3 dakika aralık) hızında sunun.</li>
		<li>VTA glutamat nöronlarında ve projeksiyonlarında eYFP ve hChR2'yi ifade etmek için AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP enjekte edin. NOT: Cre-lox rekombinasyon yöntemi, deneyin amacına bağlı olarak da kullanılabilir.</li>
		<li>AAV enjeksiyonundan sonra iğnenin 15 dakika yerinde kalmasını izin verin. Bu, difüzyonu ve geri akışı azaltacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şırınga iğnesini çekin ve yarayı kapatmak için kesiği dikin.</li>
	<li>Ameliyat sonrası bakımın bir parçası olarak antibiyotik ve analjezi uygular. Fareyi sıcak yastıklı bir platforma yerleştirin ve uyanana kadar hayvanı izleyin. NOT: 3 haftalık enjeksiyondan sonra fare beyin bölümlerinde muhabir proteininin (eYFP) floresan tespiti ile AAV ekspresyolü gözlemlenebilir. Ayrıca, fotostimülasyon deneyleri 3 hafta sonra yapılabilir (Şekil 2).</li>
</ol>4. Optogenetik ile in vivo nöral kayıtlar için kurulum
NOT: Bu bölümde, bir beyin devresinin optogenetik izlemesi (CA1'e VTA glutamat nöron projeksiyonu) ile akut nöral kayıt için adımlar açıklanmaktadır. Gerekirse, bu adıma başlamadan önce sistemi (amplifikatör ve bağlantılar) elektrik gürültüsü ve topraklama sorunları için kontrol edin. Bu adımı bir Faraday kafesinde gerçekleştirmek, kayıttaki elektrik gürültüsünü ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir.
<ol><li>AAV enjeksiyonundan 3 hafta sonra, fareleri intraperitoneal üretan enjeksiyonu (0.2 mg/kg) ile uyuşturun. DİkKAT: Üretan kanserojendir ve koruyucu giysi giyerken dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Ayrıca, bu konsantrasyonda üretan anestezi uygulamak sağkalım değildir.</li>
	<li>Hayvanın başını daha önce açıklandığı gibi stereotaktik bir çerçeveye yapıştırın (adım 2.2, Şekil 3A). Durayı ortaya çıkarmak için kraniyotomi gerçekleştirin (Şekil 3A). Parietal kemiğin bir kısmını çıkarmak için bir delme aleti (bit boyutu: 0,8 mm, hız: 15.000 rpm) kullanın.<ol>
<li>Kraniyotomi yaklaşık 3 mm x 4 mm genişliğinde olmalıdır. Kuruluğu önlemek için bu bölgeye yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) damlaları uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseksiyon (dijital) mikroskop altında, maruz kalan durayı çıkarmak için bükülmüş bir iğne ucu (27 G) kullanın. Bu bölgedeki hassas pial kaplamayı ve kortikal dokuları ayırmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Zemin vidasını (tava başı Phillips vidası) tutmak için oksipital kemikte bir delik açın (bit boyutu: 0.8 mm, hız: 10.000 rpm); M0,6 x 2,0 mm).</li>
	<li>Paslanmaz çelik zemin tellerini bağlayın. NOT: Diğer tel türleri de kullanılabilir (Şekil 3b).</li>
	<li>Kombine fototimülasyon (VTA) ve nöral kayıt (CA1) için ultra ince (10 μm veya 1 μm) mikromanipülatörlerle donatılmış çok raylı stereotaksik bir aparat kullanın. Optik fiberi ve kayıt sinir probını sırasıyla 10 μm aralık ve 1 μm menzilli mikromanipülatöre monte edin.<ol>
<li>Gerekirse, bir kafa aşaması prob adaptörü kullanın (Şekil 3c). NOT: Mevcut protokolde, 4 kanallı bir kayıt elektrodu(Şekil 3d)tutmak için 32 kanallı bir kafa aşamasına bir adaptör takılmıştır. Paslanmaz çelik öğütülmüş tel, adaptörün zemin bağlantı noktasına lehimlenmişti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ap: -3.08 mm ML: 0.5 mm koordinatlarında, 400 μm çapındaki optik fiberi VTA'ya 200 μm düşür.<ol>
<li>Optik elyafı düşürmeden önce, yükseği fiber bağlantılı bir LED kaynağına bağlı bir fiber optik kabloya (paslanmaz çelik veya seramik yüksük ile) bağlayın. NOT: Işık yoğunluğunun ve odağın istenildiği gibi ayarlandığından emin olun. LED ışık kaynağının seçimi hedeflenen opsinlere karşılık gelmelidir. Burada, hChR2 fotoaktivasyonu için 470 nm (mavi ışık) LED sürücüsü kullanıldı (Şekil 4a).</li>
		<li>Işık darbesini nöral kayıtla senkronize etmek için, LED sürücüsünü ve kayıt denetleyicisi dijital IN bağlantı noktasını transistör-transistör mantığı (TTL) darbesine(Şekil 4b)bağlayın. Bu, bir BNC ayırıcı kullanılarak elde edilebilir. NOT: TTL darbeli solunum hizmeti kullanımı, istenen darbeli tren frekansını ve süresini dijital olarak ayarlama esnekliği sağlar. Mevcut protokolde, 50 Hz18'de 10ms ışık darbeleri tetiklendi. LED sürücünün TTL kontrolü için sürücüyü "tetikleyici" olarak değiştirin. Bu modda, ışık yoğunluğu "düğme" döndürülerek düzenlenebilir. Stimülasyon frekansı deneysel değişkenlere uyum sağlayacak şekilde ayarlanabilir ve 1 ila 100 Hz arasında değişebilir. Nöral devre izleme için >20 Hz'lik bir stimülasyon frekansı önerilir.</li>
		<li>Fotoelektrik eserler üretmeden yanıt oluşturabilecek etkili yoğunluğu belirlemek için düğmeyi ayarlayın. Gerekirse, objeleri ortadan kaldırmak için optik elyafı yeniden konumlandırın19. NOT: Mevcut protokol için kullanılan LED sürücü ~21,8 mW ışık gücü üretir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Sinirsel kayıt
<ol><li>En az 5 mm uzunluğunda, 15-50 μm kalınlığında bir saplı akut bir sinir probu kullanın. NOT: Derin beyin yapılarından kayıt, daha uzun saplı sinirsel problar gerektirecektir. Mevcut çalışmada 20 mm sap uzunluğunda bir prob kullanılmıştır.</li>
	<li>Ön amplifikatör kafa sahnesini seri çevre birimi arabirimi (SPI) kablosuyla kayıt denetleyicisine bağlayın. Kayıt denetleyicisi bağlantı noktalarında LED'lerin renk aydınlatmasını kontrol edin. Yeşil ve sarı LED'ler bağlı amplifikatör kartında uygun voltajı gösterir. Kırmızı LED, çalışan bir yazılım kafası sahne kontrolünü gösterir (Şekil 5b).</li>
	<li>Bir mikro manipülatör kullanarak, elektrot temas alanlarını CA1'in piramit hücre katmanına yerleştirin (AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 ila 1.2mm). NOT: Optik fiber ve elektrot, fotostimülasyon ve kayıt için istenen diğer beyin bölgelerine konumlandırılabilir.</li>
</ol>6. Amplifikatör ve filtre ayarları
<ol><li>Kayıt denetleyicisi amplifikatör sistemini USB 3.0 bağlantı noktasından bir bilgisayara bağlayın. SPI kablosunu kullanarak baş sahneyi amplifikatöre bağlayın. Denetleyici yazılımını başlatın. Düzgün bağlanmamışsa, sistem bir "aygıt bulunamadı" iletisi görüntüler.</li>
	<li>Kanallardaki etkinliği görüntülemek için Çalıştır'ı tıklatın. Her dalga formu gerilim (y ekseni) ve zamana (x ekseni) olarak çizilir. İlgi alanına bağlı olarak, dalga biçimi ekranını ayarlamak için voltaj ve zaman ölçeklerini ayarlayın.</li>
	<li>Yalnızca birkaç kanal etkinse, depolama diskinde dosya boyutunu azaltmak için kullanılmayan kanalları devre dışı bırakın.</li>
	<li>Satın alma yazılımındaki bant genişliği parametrelerini düzenleyerek örnekleme hızını ve kesme frekanslarını ayarlayın. Tek birimli kayıt için üst ve alt kesme frekanslarını sırasıyla 300 Hz ve 5.000 Hz olarak ayarlayın. Amplifikatör örnekleme hızını 30 kS/s olarak değiştirin. NOT: Yüksek örnekleme hızı seçmek daha büyük bir dosya boyutu üretecektir.</li>
	<li>Kayıt etmeden önce, empedansı 1.000 Hz olarak ölçerek elektrot kanallarının bütünlüğünü kontrol edin. Bu, işlevi kullanıcı arayüzünde (denetleyici yazılımı) başlatarak yapılabilir. Bir çalışma kanalının empedans değeri 0,1 ila 5 MΩ arasında olmalıdır.</li>
	<li>Analog OUT bağlantı noktasına bir ses çıkışı (hoparlör) bağlıysa, optimum ani ses için kazancı ve susturucusu ayarlayın.</li>
	<li>TTL darbeli tren işaretçisini ani kayıtta görüntülemek için Digital IN işaretçisinin görüntüsünü etkinleştirin. Darbe treni zaman damgasını kaydetmek için, ana denemeden önce Digital IN kanal ekranını etkinleştirin. NOT: Genellikle birden fazla "Digital IN" kanalı (1 veya 2) vardır. TTL darbeciden gelen BNC kablosunun kayıt denetleyicisi yazılımında görüntülenmek üzere seçilen "DIGITAL IN" bağlantı noktasına bağlı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Ani dalga biçiminin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, başak kapsamı penceresini açın ve fare tıklatarak eşiği ayarlayın.</li>
	<li>Kök Ortalama Karesini (μV'de RMS) izleyerek gürültü seviyesini inceleyin. Temiz ani kayıt için, sinirsel ani artış eşiğinin en az 5x RMS olması tercih edilir.</li>
	<li>Kurulum tamamlandıktan sonra dosya çıkış biçimini seçin. NOT: Burada, CA1 sinirsel ani artış .rhd biçiminde kaydedildi. Diğer dosya biçimleri (.rhs ve .dat) analiz yazılımı tarafından izin verilen dosya biçimleriyle eşleşecek şekilde de seçilebilir.</li>
</ol>7. In vivo optogenetik kayıt ve ayarlar
<ol><li>Çeşitli ayarlanabilir darbe parametrelerini görüntüleyen darbe kontrol yazılımını (TTL) açın. Yazılımda uygun COM bağlantı noktasını seçin. Tren ve Grup ayarlarını yaparak darbe parametrelerini ayarlayın. NOT: Nabız durumu deneysel değişkenler ve tasarım göz önünde bulundurularak belirlenmelidir.</li>
	<li>Amplifikatör denetleyicisi yazılımında, hipokampustaki veya istenen beyin bölgesindeki sinirsel ani artışları algılamak için Çalıştır'ı tıklatın. Gerekirse, uygulanabilir ve aktif nöronları tespit etmek için elektrot derinliğini ayarlayın.</li>
	<li>Hücre dışı voltaj aktivitesi tespit edildikten sonra, 15 dakika boyunca taban çizgisi sivri uçlarını gözlemleyin ve hayvanın hayatilerini izleyin. Ayrıca, CA1 veya istenen anatomik hedef bölgedeki duyarlı nöronları tespit etmek için ışık darbesini test edin. NOT: Fotoelektrik objeleri kontrol edin ve ışık yoğunluğunu veya optik fiber konumunu ayarlayarak ortadan kaldırın.</li>
	<li>Işık darbesini istenen frekansta tetiklemeden önce temel aktiviteyi ~10 dakika boyunca kaydedin(Şekil 5a,b). Bu, aydınlatmalı ve aydınlatmasız ateşleme veya patlama oranlarının karşılaştırılmasına izin verecektir. NOT: Mevcut çalışmada, temel aktivite aydınlatma olmadan 10 dakika boyunca kaydedilmiş, ardından 50 Hz 'de aydınlatma(Film 1).</li>
</ol>8. Analiz
<ol><li>.rhd dosyasını Nex5 çıktı biçimine dönüştürün.</li>
	<li>İşlem dosyası adı. Tek birim raster trenleri ve dalga formlarını algılamak için çevrimdışı bir sıralayıcı yazılımında Nex5 dosyası (Şekil 5a–b).<ol>
<li>Açılan pencereden istediğiniz kanalı seçin. NOT: Sürekli kaydedilen ani veriler OFSS'nin ayrı bir penceresinde görüntülenebilir. Zaman ölçeği de ayarlanabilir. Bir tetrode kullanılırsa, OFSS 4 kanalı tetrode olarak sıralamak için ayarlanabilir.</li>
		<li>Eşik geçişi dalga biçimi ekstraksiyonu için voltaj seviyesini ayarlayın. DİkKAT: Uygun ani algılama için en az 5x RMS kullanın.</li>
		<li>Dalga formlarını algılayın, ardından vadi arama (otomatik) veya K-means (yarı otomatik) yöntemini kullanarak ani sıralama gerçekleştirin. Gerektiğinde, 3D-Principal Bileşen Analizi (PCA) alanının benzer bölgelerini kaplayan birimleri birleştirin.</li>
		<li>Sıralanmış dışarı aktarma . Daha fazla analiz için Nex5 dosyaları (Şekil 5c–d). NOT: Ara aralık, atış hızı ve patlama hızı için analiz sonuçları diğer analiz platformlarına aktarılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. AAV ifadesinin floresan tespiti
<ol><li>Kayıttan sonra, hayvanı bir izofluran odasında ötenazi.</li>
	<li>10 mM PBS (~10 mL) ile transkardiyal perfüzyon ve ardından %4 fosfat tamponlu paraformaldehit (PB-PFA, ~10 mL) gerçekleştirin.</li>
	<li>Tüm beyni sağlam bir şekilde çıkarın ve 48 saat boyunca% 4 PB-PFA'da sabitle.</li>
	<li>Sabit beyni 4 °C'de kriyoprezervasyon için %30 sakkaroz içeren %4 PB-PFA'ya aktarın. 72 saat sonra, beyni kriyostatta bölümleyin ve jelatin kaplı bir kaydıraktan dilimler monte edin. NOT: Mevcut protokolde, DG, CA3 ve CA1'deki AAV etiketli terminalleri göstermek için hipokampüsün (rostral) kapalı kısmını içeren bölümler seçilmiştir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent,+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons.">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).</li><li>Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-synaptic+Neural+Circuit-Tracing+with+Neurotropic+Viruses.">Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses.</a> Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).</li><li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+as+transneuronal+tracers.">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Dragatsis, I., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+generation+of+conditional+gene+repair+mutations+in+mice.">A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice.</a> Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).</li><li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141 (1), 154-165 (2010).</li><li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior.">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).</li><li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics.">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li><li>Kohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genetic+and+optogenetic+tools+reveal+hippocampal+CA2+circuits.">Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).</li><li>Gombash, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Viral+Vector+Delivery+to+the+Enteric+Nervous+System:+A+Review.">Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review.</a> Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Viral+Vectors+in+Neuroscience+Research.">Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Montardy, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+glutamatergic+VTA+neural+population+responses+to+aversive+and+rewarding+conditioning+in+freely-moving+mice.">Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice.</a> Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+vector:+use+for+transgene+expression+and+anterograde+tract+tracing+in+the+CNS.">Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS.</a> Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+anterograde+transsynaptic+tagging:+mapping+corticocollicular+input-defined+neural+pathways+for+defense+behaviors.">AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV+serotype+1+transduction+efficiency+and+tropism+in+the+murine+brain.">Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain.</a> Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).</li><li>Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Stimulation+of+the+Basolateral+Amygdala+Increased+Theta-Modulated+Gamma+Oscillations+in+the+Hippocampus.">Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).</li><li>Buzsaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+probing+local+circuits:+high-density+silicon+probes+combined+with+optogenetics.">Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics.</a> Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).</li><li>Benardo, L. S., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+action+on+hippocampal+pyramidal+cells.">Dopamine action on hippocampal pyramidal cells.</a> Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).</li><li>Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Upside+to+Reward+Sensitivity:+The+Hippocampus+Supports+Enhanced+Reinforcement+Learning+in+Adolescence.">An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence.</a> Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).</li><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward+and+Aversion.">Reward and Aversion.</a> Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).</li><li>Kahn, I., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+connectivity+between+the+hippocampus,+nucleus+accumbens,+and+ventral+tegmental+area+in+humans.">Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans.</a> Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).</li><li>Lisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+hippocampal+circuitry+to+function:+recall+of+memory+sequences+by+reciprocal+dentate-CA3+interactions.">Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions.</a> Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).</li><li>Lisman, J. E., Grace, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippocampal-VTA+loop:+controlling+the+entry+of+information+into+long-term+memory.">The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory.</a> Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).</li><li>Broussard, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Regulates+Aversive+Contextual+Learning+and+Associated+In+Vivo+Synaptic+Plasticity+in+the+Hippocampus.">Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus.</a> Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).</li><li>Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1/D5+receptors+mediate+informational+saliency+that+promotes+persistent+hippocampal+long-term+plasticity.">Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity.</a> Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).</li><li>Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+rewarding+and+novel+events+in+facilitating+memory+persistence+in+a+separate+spatial+memory+task.">The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task.</a> Learning &amp; Memory. 21 (2), 61-72 (2014).</li><li>Ntamati, N. R., Luscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VTA+Projection+Neurons+Releasing+GABA+and+Glutamate+in+the+Dentate+Gyrus.">VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus.</a> eNeuro. 3 (4), (2016).</li><li>Yoo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+glutamate+neurons+co-release+GABA+and+promote+positive+reinforcement.">Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement.</a> Nature Communications. 7, 13697 (2016).</li><li>Funahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+Memory+in+the+Prefrontal+Cortex.">Working Memory in the Prefrontal Cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+context+with+reward:+a+functional+circuit+from+hippocampal+CA3+to+ventral+tegmental+area.">Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area.</a> Science. 333 (6040), 353-357 (2011).</li><li>McNamara, C. G., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+sources+of+dopamine+for+the+hippocampus.">Two sources of dopamine for the hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).</li><li>McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+promote+hippocampal+reactivation+and+spatial+memory+persistence.">Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence.</a> Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics.">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Anterograde+Transsynaptic+Tagging:+Mapping+Corticocollicular+Input-Defined+Neural+Pathways+for+Defense+Behaviors.">AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).</li><li>Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetics.">Two-photon optogenetics.</a> Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Son on yılda, AAV yapılarının tasarımı önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu nedenle, daha fazla nörona özgü promotörler, gelişmiş transfeksiyon özgüllüğü için bir dizi AAV serotipine dahil edilmiştir14. Floresan proteinler, taşıyıcılar, reseptörler ve iyon kanalları için genleri birleştirerek, AAV kütüphaneleri artık görüntüleme, nöromodülasyon ve sinaptik aktivite tespiti için mevcuttur. Ticari olarak mevcut AAV yapılarında, genetik olarak kodlanmış bir flor...

Son on yılda, nöron tipi modülasyonun özgüllüğünü ve karmaşık sinir ağlarının haritalandırılmasını artırmak için bir dizi genetik araç geliştirilmiştir1. Özellikle, nöron alt tiplerinde belirli proteinleri ifade etmek veya alevlendirmek için nöronal hücrelerde enfekte olma ve çoğaltma yeteneğine sahip nörotropik virüsler konuşlandırılmıştır. Floresan proteinleri veya genetik olarak kodlanmış sinaptik aktivite göstergelerini barındırırken, transfected AAV vektörleri beyin bölgelerindeki sinir ağlarını etiketler ve tanımlama2,3. AAV yapısında bir promotörün seçimi, vektörün nöron tiplerinde bir miktar özgüllük(promotöre bağımlı ifade) ile ifadesini yönlendirir. Bununla birlikte, Cre-lox rekombinasyonu sayesinde, AAV yapılarınöron etiketlemesi 4,5,6,7için daha fazla özgüllükle dağıtılır. Not olarak, AAV vektörlerinde paketlenmiş fotoaktive mikrobiyal opsinler ve floresan proteinler çeşitli nöron alt tiplerinde ifade edilebilir8ve görüntüleme, nöron tipi devre izleme ve fotomodülasyon için idealdir9,10.
AAVs, soma, dendrit ve akson terminallerinde muhabir proteininin ekspresyonunun ifadesini yönlendiren bir beyin bölgesine (veya çekirdeğe) stereotaktik olarak enjekte edilen yapılar oluşturur. Bir muhabir geni (eYFP) barındıran AAV'nin sinirsel ifadesi, nöron hücre cisimlerinin etiketlenerek diğer beyin bölgelerine ve diğer beyin bölgelerine yapılan projeksiyonların anatomik olarak izlenmesini kolaylaştırır11,12,13,14. Işık kontrollü opsin taşıyan AAV-eYFP yapıları (örneğin, hChR2),6,15 görüntüleme ve16 vivo beyin bölgelerini hedeflemek için sinirsel projeksiyonların stimülasyontabanlı fizyolojik izleme için bir araç olarak dağıtılabilir. AAV serotipine bağlı olarak, nöron etiketlemenin yönü anterograd veya retrograd11,12olabilir. Önceki çalışmalar, AAV5'in nöronlarda anterograd olarak seyahat ettiğini ortaya12. Böylece, hChR2'yi ifade eden hücre cisimlerinin fotostimülasyonu beynin başka yerlerinde presynaptik etkiler üretir (hedef)17.
Burada VTA glutamat nöronlarında ve aksonal projeksiyonlarda eYFP (muhabir) ve hChR2 (opsin) ifade etmek için CaMKIIα promotörüne sahip AAV (serotip 5) kullanıldı. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, CA1, CA3 ve DG hipokampal bölgelerdeki VTA glutamat presynaptik terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, temel değerlerle karşılaştırıldığında CA1 çok birimli ve tek birimli ateşleme oranlarını vivo olarak artırdı. Bu protokol, sinir devresi izleme deneylerinden elde edilen verilerin kalitesini artırabilecek uygun fiyatlı araçlar ve ticari olarak kullanılabilen yazılımları kullanır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>H312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV-CaMKII&#945;-ChR2-eGYP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #26969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cable</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC Splitter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Split Mating Sleeve for &#216;1.25mm Ferrules.</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ADAL1-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>LR 39098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin coated slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>OBSLD01CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton&#39;s syringe (Neuros)</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>06H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage adapter</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Adpt-Q4-OM32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High impedance silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Q1x1-tet-5mm-121-CQ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INTAN 512ch Recording Controller</td>
			<td>INTAN</td>
			<td>RHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>K1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Driver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source (470 nm)-blue light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M470F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M0-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFMLC14L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan head philips screw (M0.6 X 2mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>M0.6 X 2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-amplifier headstage (32 Channel)</td>
			<td>INTAN</td>
			<td>C3314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTL pulser</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intan Recording Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuroexplorer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexon Offline Spike Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF Composition:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined in vivo anatomical and functional tracing of ventral tegmental area glutamate terminals in the hippocampus

Beyindeki nöron alt popülasyonlarının optogenetik modülasyonu, araştırmacıların in vivo ve ex vivo'daki sinir devrelerini parçalamalarına izin sağlamıştır. Bu, nöron tiplerinin bir sinir devresi içindeki rolünü ve öğrenmeye göre bilgi kodlamasındaki önemini belirlemek için bir öncül sağlar. Aynı şekilde, yöntem uyanık ve uyuşturulmış hayvanlarda iki veya daha fazla bağlı beyin bölgesinin fizyolojik önemini test etmek için kullanılabilir. Mevcut çalışma, VTA glutamat nöronlarının anestezi edilmiş farelerin CA1'deki (hipokampus) putatif piramital nöronların atış hızını nasıl modüle ettiklerini göstermektedir. Bu protokol, hipokampus katmanlarında VTA presynaptik glutamat terminallerinin izlenmesi için VTA glutamat nöronlarının adeno ilişkili virüs (AAV) bağımlı etiketlemesini kullanmaktadır. AAV vektörü tarafından barındırılan ışık kontrollü opsin (channelrhodopsin; hChR2) ve floresan proteininin (eYFP) ekspresyasyonu, VTA glutamat terminallerinin anterograd izlenmesine ve VTA glutamat nöron hücre cisimlerinin (VTA'da) fototimülasyonuna izin verdi. Yüksek empedanslı akut silikon elektrotlar, VTA fotostimülasyonuna in vivo olarak çok birimli ve tek birimli yanıtları tespit etmek için CA1'e yerleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları hipokampustaki (CA1, CA3 ve DG) presynaptik VTA glutamat terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, putatif CA1 piramidal ünitelerinin in vivo ateşlenme ve patlama hızını artırdı.

Anterograd izleme
AAV ekspresyolojisi, enjeksiyondan 21 gün sonra C57BL/6 fare vtasında muhabir proteininin (eYFP) immünofluoresans görüntülemesi ile doğrulanmıştır (Şekil 2). Hipokampustaki presynaptik VTA glutamat projeksiyonlarının başarılı anterograd etiketlemesi de DG, CA3 ve CA1 katmanlarında eYFP tespiti ile doğrulandı(Şekil 6a–d; Film 2 ve 3).
...

Watch this Scientific Journal Video about Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus at JoVE.com

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

combined-vivo-anatomical-functional-tracing-ventral-tegmental-area

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K Görüntüleme.  Louisiana State University School of Veterinary Medicine. Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Video: Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Nörobilim

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...