Questo lavoro è finanziato dalla CBS Bridging Grant assegnata a OOM. OOM, PAA e AS hanno progettato lo studio ed eseguito gli esperimenti. AS e PAA hanno analizzato i risultati. OOM e PAA hanno preparato il manoscritto. Ringraziamo il Dr. Karl Disseroth (Stanford University) per aver reso l'AAV disponibile per il nostro uso.

Tutte le procedure sperimentali e di manipolazione degli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Louisiana State University School of Veterinary Medicine.
1. Animale da esperimento
<ol><li>Utilizzare topi di 5-6 settimane.</li>
	<li>Ospitare 3-5 animali per gabbia in condizioni standard di 12 ore alternando luce e buio. Cibo e acqua dovrebbero essere forniti ad libitum.</li>
</ol>2. Craniotomia e preparazione animale
NOTA: Questa sezione descrive le procedure pre- e peri-operatorie per la craniotomia del topo. Utilizzare apparecchi stereotassica standard e coordinate appropriate (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML e Dorsoventral: DV). Fare riferimento a un atlante del cervello del topo per determinare le coordinate per la regione del cervello di interesse.
<ol><li>Anestetizzare i topi mediante iniezione di cocktail intraperitoneale ketamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg). Eseguire un test del pizzico della dita del piede per garantire l'assenza di sensazione prima dell'inizio dell'intervento chirurgico. NOTA: In alternativa, l'anestesia isoflurano con una camera nasale appropriata può essere utilizzata anche per questo passaggio.</li>
	<li>Fissare delicatamente la testa dell'animale sull'apparato stereotassico. NOTA: è importante maneggiare gli animali con cautela durante questo processo. Inoltre, controllare la frequenza respiratoria e altri elementi vitali prima di procedere con l'intervento chirurgico. Lasciare riposare l'animale per ~ 7 minuti per ridurre lo stress.<ol>
<li>Posizionare una piastra riscaldante sul telaio stereotassico in modo tale che il corpo dell'animale sia sdraiato su di esso. Ciò contribuirà a mantenere la temperatura corporea e mantenere l'animale caldo durante la procedura. Conservare la piastra riscaldante per la cura e il recupero postoperatorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare un clipper per rimuovere i peli sul cuoio capelluto e pulire la pelle con una soluzione di iodio.<ol>
<li>Applicare lidocaina topica per bloccare la sensazione sul cuoio capelluto.</li>
		<li>Utilizzare un bisturi per fare un'incisione del cuoio capelluto della linea mediana che si estende dalla regione frontale a quella occipitale.</li>
		<li>Pulire l'area di incisione con soluzione di iodio, quindi esporre la calvaria. NOTA: Una piccola quantità di soluzione di perossido di idrogeno al 3% può essere applicata per rimuovere il periosteo dalla calvaria. Ciò aumenterà la visibilità dei punti di riferimento (bregma e lambda) e delle suture.</li>
		<li>Utilizzando un atlante stereotassico cerebrale di topo, determinare le coordinate AP e ML relative al bregma.</li>
		<li>Per l'iniezione di VTA, posizionare una siringa ad ago a punta smussata ultrafine (ad es. Siringa Neuros) alle coordinate AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm rispetto al bregma.</li>
		<li>Utilizzare uno strumento di perforazione per praticare un foro di 1 mm (craniotomia) nel cranio alla coordinata AP/ML contrassegnata. NOTA: questo passaggio richiede un livello significativo di cautela. Una pressione minima deve essere applicata durante la perforazione per evitare che la punta del trapano schiacci il tessuto cerebrale. Nel presente studio, la punta del trapano era di 0,8 mm e la velocità del trapano era impostata a 15.000 giri / min. ATTENZIONE: Se il perossido di idrogeno è stato utilizzato nella pulizia dell'incisione o della calvaria, garantire la rimozione totale della soluzione o consentire la completa secchezza prima della perforazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Iniezione di cocktail AAV
NOTA: Questa sezione descrive il processo di iniezione di AAV nel VTA di topi adulti C57BL/6 (23-27 g). Il metodo descritto può essere utilizzato per l'iniezione di AAV in qualsiasi regione del cervello utilizzando apparecchi stereotassica standard e coordinate appropriate. Per dimostrare questo protocollo, eYFP e hChR2 sono stati espressi nei neuroni del glutammato VTA utilizzando la trasfezione mediata da AAV5 sotto un promotore CaMKIIα (Figura 1). La ricombinazione Cre-lox può essere utilizzata anche per questo passaggio.
<ol><li>Montare una siringa con ago a punta smussata ultrafine (32 G; capacità di 5 μL con precisione di 100 nL) su un iniettore. Fissare il supporto della siringa su un micromanipolatore. NOTA: per questa procedura è stato utilizzato un supporto per siringa manuale, con calibrazione da 1,6 nL. È inoltre possibile utilizzare un iniettore automatico.</li>
	<li>Riempire la siringa con acqua a doppio distillato per pulire e testare il flusso del fluido.</li>
	<li>Aliquote di disgelo del cocktail AAV (sierotipo 5) su ghiaccio. Gli AAV sono meglio conservati a -80 °C per mantenere il titolo virale per una buona espressione.</li>
	<li>Riempire la siringa montata con 1.000 nL di soluzione AAV (10 mM in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4). Erogare 10 nL della soluzione AAV per confermare il flusso del liquido prima di abbassare l'ago in un sito di iniezione.</li>
	<li>Utilizzare un micromanipolatore per abbassare l'ago stereotassicamente nella profondità desiderata (coordinata DV). Dopo aver abbassato l'ago alla profondità desiderata, lasciare che la siringa rimanga in posizione per 10 minuti prima dell'iniezione. NOTA: Per questa procedura, l'ago è stato abbassato nel VTA ad una profondità (DV) di 4,5 mm dalla superficie piale del cervello. Per altre aree del cervello, utilizzare la coordinata dorsoventrale appropriata (fare riferimento all'atlante del cervello del topo).</li>
	<li>Iniettare 600-800 nL di AAV nel VTA. Il volume dell'iniezione può essere regolato in base alle dimensioni del sito target.<ol>
<li>Fornire la soluzione AAV alla velocità di 60 nL/min (intervallo di 3 min).</li>
		<li>Per esprimere eYFP e hChR2 nei neuroni e nelle proiezioni del glutammato VTA, iniettare AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP. NOTA: il metodo di ricombinazione Cre-lox può essere utilizzato anche a seconda dell'obiettivo dell'esperimento.</li>
		<li>Lasciare che l'ago rimanga in posizione per 15 minuti dopo l'iniezione di AAV. Ciò ridurrà la diffusione e il riflusso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prelevare l'ago della siringa e quindi suturare l'incisione per chiudere la ferita.</li>
	<li>Somministrare antibiotici e analgesia come parte delle cure post-operatorie. Posiziona il mouse su una calda piattaforma imbottita e monitora l'animale fino a quando non è sveglio. NOTA: Dopo 3 settimane di iniezione, l'espressione di AAV può essere osservata mediante il rilevamento a fluorescenza della proteina reporter (eYFP) nelle sezioni cerebrali del topo. Inoltre, gli esperimenti di fotostimolazione possono essere eseguiti dopo 3 settimane (Figura 2).</li>
</ol>4. Configurazione per registrazioni neurali in vivo con optogenetica
NOTA: Questa sezione descrive i passaggi per la registrazione neurale acuta con il tracciamento optogenetico di un circuito cerebrale (proiezione del neurone glutammato VTA al CA1). Se necessario, controllare il sistema (amplificatore e connessioni) per problemi di rumore elettrico e messa a terra prima di iniziare questo passaggio. L'esecuzione di questo passaggio in una gabbia di Faraday può aiutare a eliminare il rumore elettrico nella registrazione.
<ol><li>A 3 settimane dopo l'iniezione di AAV, anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di uretano (0,2 mg/kg). ATTENZIONE: L'uretano è cancerogeno e deve essere maneggiato con cautela mentre si indossano indumenti protettivi. Inoltre, la somministrazione di anestesia con uretano a questa concentrazione non è sopravvivenza.</li>
	<li>Apporre la testa dell'animale su un telaio stereotassico come descritto in precedenza (passo 2.2, Figura 3A). Eseguire una craniotomia per esporre la dura (Figura 3A). Utilizzare uno strumento di foratura (dimensione della punta: 0,8 mm, velocità: 15.000 giri / min) per rimuovere parte dell'osso parietale.<ol>
<li>La craniotomia dovrebbe essere larga circa 3 mm x 4 mm. Applicare gocce di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) su quest'area per prevenire la secchezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sotto un microscopio di dissezione (digitale), utilizzare una punta dell'ago piegata (27 G) per asportare la dura esposta. Fare attenzione a non separare la delicata copertura piale e i tessuti corticali in quest'area.</li>
	<li>Forare un foro nell'osso occipitale (dimensione della punta: 0,8 mm, velocità: 10.000 giri / min) per tenere la vite di terra (vite Phillips a testa di padella; M0,6 x 2,0 mm).</li>
	<li>Collegare un filo di terra in acciaio inossidabile. NOTA: è possibile utilizzare anche altri tipi di fili (Figura 3b).</li>
	<li>Per la fotostimolazione combinata (VTA) e la registrazione neurale (CA1), utilizzare un apparecchio stereotassico multi-rail dotato di micromanipolatori ultra-fini (10 μm o 1 μm). Montare la fibra ottica e la sonda neurale di registrazione rispettivamente su micromanipolatori da 10 μm e 1 μm.<ol>
<li>Se necessario, utilizzare un adattatore per sonda di testa (Figura 3c). NOTA: Nel protocollo attuale, uno stadio principale a 32 canali era dotato di un adattatore per contenere un elettrodo di registrazione a 4 canali (Figura 3d). Il filo di terra in acciaio inossidabile è stato saldato alla porta di collegamento a terra dell'adattatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alle coordinate AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, abbassare la fibra ottica di 400 μm di diametro nel VTA.<ol>
<li>Prima di abbassare la fibra ottica, collegare la ghiera a un cavo in fibra ottica (con ghiera in acciaio inossidabile o ceramica) collegato a una sorgente LED accoppiata a fibre. NOTA: assicurarsi che l'intensità della luce e la messa a fuoco siano impostate come desiderato. La scelta della sorgente luminosa a LED dovrebbe corrispondere alle opsin prese di mira. Qui, un driver LED a 470 nm (luce blu) è stato utilizzato per la fotoattivazione hChR2 (Figura 4a).</li>
		<li>Per sincronizzare l'impulso luminoso con la registrazione neurale, collegare il driver LED e la porta IN digitale del controller di registrazione a un pulsatore TTL (Transistor-Transistor Logic) (Figura 4b). Questo può essere ottenuto utilizzando uno splitter BNC. NOTA: l'uso di un pulsatore TTL offre la flessibilità di impostare digitalmente la frequenza e la durata del treno di impulsi desiderate. Nel protocollo attuale, gli impulsi luminosi da 10 ms sono stati attivati a 50 Hz18. Per il controllo TTL del driver LED, commutare il driver su "trigger". In questa modalità, l'intensità della luce può essere regolata ruotando la "manopola". La frequenza di stimolazione può essere regolata per adattarsi alle variabili sperimentali e potrebbe variare da 1 a 100 Hz. Per il tracciamento del circuito neurale, si raccomanda una frequenza di stimolazione di >20 Hz.</li>
		<li>Regolare la manopola per determinare l'intensità effettiva che può generare una risposta senza produrre artefatti fotoelettrici. Se necessario, riposizionare la fibra ottica per eliminare gli artefatti19. NOTA: il driver LED utilizzato per il protocollo corrente produce una potenza luminosa di ~21,8 mW.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Registrazione neurale
<ol><li>Utilizzare una sonda neurale acuta con un gambo spesso 15-50 μm, che misura almeno 5 mm di lunghezza. NOTA: la registrazione da strutture cerebrali profonde richiederà sonde neurali con un gambo più lungo. Nel presente studio è stata utilizzata una sonda con una lunghezza del gambo di 20 mm.</li>
	<li>Collegare lo stadio della testa del preamplificatore al controller di registrazione tramite un cavo SPI (Serial Peripheral Interface). Controllare l'illuminazione a colori dei LED sulle porte del controller di registrazione. I LED verdi e gialli indicano la tensione corretta sulla scheda amplificatore collegata. Il LED rosso indica un controllo dello stadio della testa del software funzionante (Figura 5b).</li>
	<li>Utilizzando un micropolatore, posizionare i siti di contatto dell'elettrodo nello strato di cella piramidale del CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: da +1,1 a 1,2 mm). NOTA: la fibra ottica e l'elettrodo possono essere posizionati in altre regioni cerebrali desiderate per la fotostimolazione e la registrazione.</li>
</ol>6. Impostazioni dell'amplificatore e del filtro
<ol><li>Collegare il sistema di amplificazione del controller di registrazione a un computer tramite una porta USB 3.0. Collegare lo stadio principale all'amplificatore utilizzando il cavo SPI. Avviare il software del controller. Se non collegato correttamente, il sistema visualizzerà un messaggio "dispositivo non trovato".</li>
	<li>Fare clic su Esegui per visualizzare l'attività sui canali. Ogni forma d'onda viene tracciata come tensione (asse y) rispetto al tempo (asse x). A seconda della regione di interesse, regolare la tensione e le scale temporali per regolare la visualizzazione della forma d'onda.</li>
	<li>Se sono attivi solo pochi canali, disabilitare i canali inutilizzati per ridurre le dimensioni del file sul disco di archiviazione.</li>
	<li>Impostare la frequenza di campionamento e le frequenze di taglio modificando i parametri della larghezza di banda sul software di acquisizione. Per la registrazione a singola unità, impostare le frequenze di taglio superiore e inferiore rispettivamente su 300 Hz e 5.000 Hz. Modificare la frequenza di campionamento dell'amplificatore a 30 kS/s. NOTA: la scelta di una frequenza di campionamento elevata produrrà una dimensione del file maggiore.</li>
	<li>Prima di registrare, controllare l'integrità dei canali dell'elettrodo misurando l'impedenza a 1.000 Hz. Questo può essere fatto avviando la funzione nell'interfaccia utente (software del controller). Un canale di lavoro dovrebbe avere un valore di impedenza compreso tra 0,1 e 5 MΩ.</li>
	<li>Se un'uscita audio (altoparlante) è collegata alla porta ANALOG OUT, regolare il guadagno e il silenziatore per un suono di picco ottimale.</li>
	<li>Per visualizzare il marcatore del treno di impulsi TTL nella registrazione del picco, abilitare la visualizzazione per il marcatore DIGITAL IN. Per registrare il timestamp del treno di impulsi, abilitare la visualizzazione del canale DIGITAL IN prima dell'esperimento principale. NOTA: di solito c'è più di un canale "DIGITAL IN" (1 o 2). Assicurarsi che il cavo BNC dell'pulsatore TTL sia collegato alla porta "DIGITAL IN" selezionata per la visualizzazione nel software del controller di registrazione.</li>
	<li>Per la visualizzazione in tempo reale della forma d'onda spike, aprire la finestra spike scope e impostare la soglia con il clic del mouse.</li>
	<li>Ispezionare il livello di rumore monitorando il Root Mean Square (RMS in μV). Per la registrazione pulita del picco, è preferibile che la soglia del picco neurale sia almeno 5x RMS.</li>
	<li>Una volta completata l'installazione, selezionare il formato di output del file. NOTA: Qui, il picco neurale CA1 è stato registrato in formato .rhd. Altri formati di file (.rhs e .dat) possono anche essere selezionati per corrispondere ai formati di file consentiti dal software di analisi.</li>
</ol>7. Registrazione e impostazioni optogenetiche in vivo
<ol><li>Aprire il software di controllo degli impulsi (TTL) che visualizza vari parametri di impulso regolabili. Selezionare la porta COM appropriata sul software. Impostare i parametri dell'impulso regolando le impostazioni Treno e Gruppo. NOTA: la condizione dell'impulso deve essere determinata considerando le variabili sperimentali e il design.</li>
	<li>Nel software del controller dell'amplificatore, fare clic su Esegui per rilevare i picchi neurali nell'ippocampo o nell'area cerebrale desiderata. Se necessario, regolare la profondità dell'elettrodo per rilevare i neuroni vitali e attivi.</li>
	<li>Una volta rilevata l'attività di tensione extracellulare, osservare i picchi basali per 15 minuti e monitorare i parametri vitali dell'animale. Inoltre, testare l'impulso luminoso per rilevare i neuroni reattivi all'interno del CA1 o della regione bersaglio anatomica desiderata. NOTA: verificare la disponibilità di artefatti fotoelettrici ed eliminarli regolando l'intensità della luce o la posizione della fibra ottica.</li>
	<li>Registrare l'attività di base per ~ 10 minuti prima di attivare l'impulso luminoso alla frequenza desiderata (Figura 5a,b). Ciò consentirà il confronto delle velocità di sparo o scoppio con e senza illuminazione. NOTA: Nel presente studio, l'attività di base è stata registrata per 10 minuti senza illuminazione, seguita dall'illuminazione a 50 Hz (Filmato 1).</li>
</ol>8. Analisi
<ol><li>Converti il file .rhd nel formato di outputNex 5.</li>
	<li>Nome file di processo. Nex5 in un software di smistamento offline per rilevare treni raster e forme d'onda a singola unità (Figura 5a–b).<ol>
<li>Selezionare il canale desiderato dalla finestra a discesa. NOTA: i dati di picco registrati continuamente possono essere visualizzati in una finestra separata dell'OFSS. Anche la scala temporale può essere regolata. Se viene utilizzato un tetrodo, l'OFSS può essere impostato per ordinare i 4 canali come tetrodo.</li>
		<li>Impostare il livello di tensione per l'estrazione della forma d'onda di attraversamento della soglia. ATTENZIONE: utilizzare un minimo di 5 RMS per il corretto rilevamento dei picchi.</li>
		<li>Rileva le forme d'onda, quindi esegui lo smistamento dei picchi utilizzando il metodo di ricerca della valle (automatico) o K-means (semiautomatico). Se necessario, unire unità che occupano regioni simili dello spazio PCA (3D-Principal Component Analysis).</li>
		<li>Esporta ordinato . Nex5 per ulteriori analisi (Figura 5c–d). NOTA: i risultati dell'analisi per l'intervallo interspike, la velocità di sparo e la velocità di scoppio possono essere esportati in altre piattaforme di analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Rilevazione della fluorescenza dell'espressione di AAV
<ol><li>Dopo la registrazione, eutanasizzare l'animale in una camera isoflurano.</li>
	<li>Eseguire la perfusione transcardica con PBS 10 mM (~10 mL), seguita da paraformaldeide tamponata con fosfato al 4% (PB-PFA, ~10 mL).</li>
	<li>Rimuovere l'intero cervello intatto e fissarlo in PB-PFA al 4% per 48 ore.</li>
	<li>Trasferire il cervello fisso in PB-PFA al 4% contenente il 30% di saccarosio per la crioconservazione a 4 °C. Dopo 72 ore, sezionare il cervello in un criostato e montare le fette su un vetrino rivestito di gelatina. NOTA: Nel protocollo attuale, le sezioni contenenti la parte chiusa dell'ippocampo (rostrale) sono state selezionate per dimostrare i terminali etichettati AAV nel DG, CA3 e CA1.</li>
</ol>

<ol>
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Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Upside+to+Reward+Sensitivity:+The+Hippocampus+Supports+Enhanced+Reinforcement+Learning+in+Adolescence.">An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence.</a> Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).</li><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward+and+Aversion.">Reward and Aversion.</a> Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).</li><li>Kahn, I., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+connectivity+between+the+hippocampus,+nucleus+accumbens,+and+ventral+tegmental+area+in+humans.">Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans.</a> Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).</li><li>Lisman, J. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Regulates+Aversive+Contextual+Learning+and+Associated+In+Vivo+Synaptic+Plasticity+in+the+Hippocampus.">Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus.</a> Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).</li><li>Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1/D5+receptors+mediate+informational+saliency+that+promotes+persistent+hippocampal+long-term+plasticity.">Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity.</a> Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).</li><li>Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+glutamate+neurons+co-release+GABA+and+promote+positive+reinforcement.">Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement.</a> Nature Communications. 7, 13697 (2016).</li><li>Funahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+Memory+in+the+Prefrontal+Cortex.">Working Memory in the Prefrontal Cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+context+with+reward:+a+functional+circuit+from+hippocampal+CA3+to+ventral+tegmental+area.">Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area.</a> Science. 333 (6040), 353-357 (2011).</li><li>McNamara, C. G., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+sources+of+dopamine+for+the+hippocampus.">Two sources of dopamine for the hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).</li><li>McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+promote+hippocampal+reactivation+and+spatial+memory+persistence.">Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence.</a> Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics.">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Anterograde+Transsynaptic+Tagging:+Mapping+Corticocollicular+Input-Defined+Neural+Pathways+for+Defense+Behaviors.">AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).</li><li>Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetics.">Two-photon optogenetics.</a> Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Negli ultimi dieci anni, la progettazione dei costrutti AAV è progredita in modo significativo. Come tale, più promotori neuronali specifici sono stati incorporati in una serie di sierotipi AAV per una migliore specificità della trasfezione14. Combinando geni per proteine di fluorescenza, trasportatori, recettori e canali ionici, esistono ora librerie di AAV per l'imaging, la neuromodulazione e il rilevamento dell'attività sinaptica. Nei costrutti AAV disponibili in commercio, una combinazione...

Nell'ultimo decennio, è stata sviluppata una serie di strumenti genetici per aumentare la specificità della modulazione di tipo neuronale e la mappatura di reti neurali complesse1. In particolare, i virus neurotropici con una capacità intrinseca di infettare e replicarsi nelle cellule neuronali sono stati utilizzati per esprimere o ablare proteine specifiche in sottotipi di neuroni. Quando ospitano proteine di fluorescenza o indicatori di attività sinaptica geneticamente codificati, i vettori AAV trasfettate etichettano e delineano le reti neurali attraverso le regioni del cervello2,3. La scelta di un promotore nel costrutto AAV dirige l'espressione del vettore in tipi di neuroni con un certo livello di specificità (espressionepromotore-dipendente). Tuttavia, attraverso la ricombinazione Cre-lox, i costrutti AAV vengono distribuiti con maggiore specificità per l'etichettatura dei neuroni4,5,6,7. Da notare, le ossine microbiche fotoattivate e le proteine di fluorescenza confezionate in vettori AAV possono essere espresse in vari sottotipi di neuroni8e sono ideali per l'imaging, il tracciamento del circuito di tipo neuronale e la fotomodulazione9,10.
I costrutti AAV iniettati stereotassicamente in una regione del cervello (o nucleo) guidano l'espressione della proteina reporter nei terminali soma, dendrite e assoni. L'espressione neurale di AAV che ospita un gene reporter (eYFP) facilita l'etichettatura dei corpi cellulari neuronali e il tracciamento anatomico delle proiezioni da e verso altre regioni del cervello11,12,13,14. I costrutti AAV-eYFP che trasportano l'opsina controllata dalla luce (ad esempio, hChR2), possono essere utilizzati come strumento per l'imaging6,15 e il tracciamento fisiologico basato sulla stimolazione delle proiezioni neurali per indirizzare le aree cerebrali in vivo16. A seconda del sierotipo AAV, la direzione dell'etichettatura dei neuroni può essere anterograda o retrograda11,12. Studi precedenti hanno stabilito che AAV5 viaggia anterogradamente nei neuroni12. Pertanto, la fotostimolazione dei corpi cellulari che esprimono hChR2 produce effetti presinaptici altrove nel cervello (target)17.
Qui, AAV (sierotipo 5) con un promotore CaMKIIα è stato utilizzato per esprimere eYFP (reporter) e hChR2 (opsina) nei neuroni del glutammato VTA e nelle proiezioni assonali. I risultati di questo studio dimostrano la distribuzione dipendente dallo strato dei terminali presinaptici VTA-glutammato nelle regioni ippocampali CA1, CA3 e DG. Inoltre, la fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA ha aumentato i tassi di attivazione di CA1 multi-unità e singola unità in vivo rispetto ai valori basali. Questo protocollo utilizza strumenti a prezzi accessibili e software disponibili in commercio che possono aumentare la qualità dei dati ottenuti da esperimenti di tracciamento dei circuiti neurali.

<table><tbody><tr><td>3% Hydrogen peroxide</td><td>Fisher chemical</td><td>H312</td><td></td></tr><tr><td>AAV-CaMKII&amp;alpha;-ChR2-eGYP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #26969</td><td></td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC Splitter</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Split Mating Sleeve for &amp;Oslash;1.25mm Ferrules.</td><td>Thorlabs</td><td>ADAL1-5</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>LR 39098</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin coated slides</td><td>Fisher scientific</td><td>OBSLD01CS</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&#039;s syringe (Neuros)</td><td>WPI Inc.</td><td>06H</td><td></td></tr><tr><td>Head stage adapter</td><td>Neuronexus</td><td>Adpt-Q4-OM32</td><td></td></tr><tr><td>High impedance silicon probe</td><td>Neuronexus</td><td>Q1x1-tet-5mm-121-CQ4</td><td></td></tr><tr><td>INTAN 512ch Recording Controller</td><td>INTAN</td><td>RHD2000</td><td></td></tr><tr><td>Iodine solution</td><td>Dynarex</td><td>1425</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Spectrum</td><td>K1068</td><td></td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>LED light source (470 nm)-blue light</td><td>Thorlabs</td><td>M470F3</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M0-203</td><td></td></tr><tr><td>Optic fiber</td><td>Thorlabs</td><td>CFMLC14L05</td><td></td></tr><tr><td>Pan head philips screw (M0.6 X 2mm)</td><td>Amazon</td><td>M0.6 X 2mm</td><td></td></tr><tr><td>Pre-amplifier headstage (32 Channel)</td><td>INTAN</td><td>C3314</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Kopf</td><td>1530</td><td></td></tr><tr><td>TTL pulser</td><td>Prizmatix</td><td>4031</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61430</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Version&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>version 8</td><td></td></tr><tr><td>Intan Recording Controller</td><td>Intantech</td><td>version 2.07</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td>version 5.215</td><td></td></tr><tr><td>Plexon Offline Spike Sorter</td><td>Plexon Inc</td><td>version 4.5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ACSF Composition:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 3 KCl, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and 25 Glucose).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined in vivo anatomical and functional tracing of ventral tegmental area glutamate terminals in the hippocampus

La modulazione optogenetica delle sotto-popolazioni neuronali nel cervello ha permesso ai ricercatori di sezionare circuiti neurali in vivo ed ex vivo. Ciò fornisce una premessa per determinare il ruolo dei tipi di neuroni all'interno di un circuito neurale e il loro significato nella codifica delle informazioni relative all'apprendimento. Allo stesso modo, il metodo può essere utilizzato per testare il significato fisiologico di due o più regioni cerebrali collegate in animali svegli e anestetizzati. Il presente studio dimostra come i neuroni del glutammato VTA modulano il tasso di attivazione dei neuroni piramidali putativi nel CA1 (ippocampo) dei topi anestetizzati. Questo protocollo utilizza l'etichettatura dipendente dal virus adeno-associato (AAV) dei neuroni del glutammato VTA per il tracciamento dei terminali presinaptici del glutammato VTA negli strati dell'ippocampo. L'espressione di opsina controllata dalla luce (channelrhodopsin; hChR2) e proteina di fluorescenza (eYFP) ospitata dal vettore AAV ha permesso il tracciamento anterogrado dei terminali del glutammato VTA e la fotostimolazione dei corpi delle cellule neuronali del glutammato VTA (nel VTA). Elettrodi di silicio acuto ad alta impedenza sono stati posizionati nel CA1 per rilevare risposte multi-unità e singola unità alla fotostimolazione VTA in vivo. I risultati di questo studio dimostrano la distribuzione dipendente dallo strato dei terminali presinaptici del glutammato VTA nell'ippocampo (CA1, CA3 e DG). Inoltre, la fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA ha aumentato il tasso di attivazione e scoppio delle presunte unità piramidali CA1 in vivo.

Tracciatura anterograda
L'espressione di AAV è stata verificata mediante imaging a immunofluorescenza della proteina reporter (eYFP) nel VTA di topi C57BL/6 21 giorni dopo l'iniezione (Figura 2). Il successo dell'etichettatura anterograda delle proiezioni di glutammato VTA presinaptico nell'ippocampo è stato verificato anche dal rilevamento eYFP negli strati di DG, CA3 e CA1(Figura 6a-d; Film 2 e 3)...

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Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.

Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

combined-vivo-anatomical-functional-tracing-ventral-tegmental-area

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K Views.  Louisiana State University School of Veterinary Medicine. L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.

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Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Ricerca

Comportamento

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Biochimica

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta risoluzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Manuale Protocollo Segmentazione for Human ippocampale Sottocampi Utilizzando 3T Risonanza Magnetica

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Neuroscienze

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

Migliorare l'applicazione di alto peso molecolare del dextrano Biotinylated ammina per proiezione Thalamocortical traccia nel ratto

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Procedura craniotomia per la visualizzazione delle attività neuronali nell'ippocampo dei topi che si comportano

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Imaging in tempo reale per l'attività neuronale nelle cellule del giro dentato dei topi 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

Autore in primo piano: Studio dell'attività neurale delle cellule granulari del giro dentato con il microscopio in miniatura

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

Riepilogo

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