Bu çalışma, OOM'ye verilen CBS Bridging Grant tarafından finanse edilir. OOM, PAA ve AS çalışmayı tasarladı ve deneyleri gerçekleştirdi. AS ve PAA sonuçları analiz etti. Makaleyi OOM ve PAA hazırladı. Dr. Karl Disseroth'a (Stanford Üniversitesi) AAV'ı kullanımımıza sunduklarından dolayı teşekkür ederiz.

Tüm deneysel ve hayvan işleme prosedürleri Louisiana Eyalet Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Deneysel hayvan
<ol><li>5-6 haftalık fareler kullanın.</li>
	<li>12 saat değişen ışık ve karanlık döngü standart koşulları altında kafes başına 3-5 hayvan barındırın. Yiyecek ve su reklam libitum sağlanmalıdır.</li>
</ol>2. Kraniyotomi ve hayvan hazırlığı
NOT: Bu bölümde fare kraniyotomisi için ameliyat öncesi ve peri-operatif prosedürler açıklanmaktadır. Standart stereotaktik aparat ve uygun koordinatları kullanın (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML ve Dorsoventral: DV). İlgi çekici beyin bölgesinin koordinatlarını belirlemek için bir fare beyin atlasına bakın.
<ol><li>Fareleri intraperitoneal ketamin (100 mg/kg)/ksilazin (10 mg/kg) kokteyl enjeksiyonu ile uyuşturun. Ameliyat başlamadan önce his olmamasını sağlamak için bir parmak sıkışma testi gerçekleştirin. NOT: Alternatif olarak, bu adım için uygun burun odasına sahip izofluran anestezisi de kullanılabilir.</li>
	<li>Hayvanın başını stereotaksik aparat üzerine hafifçe sabitlayın. NOT: Bu işlem sırasında hayvanları dikkatli bir şekilde ele almak önemlidir. Ayrıca, ameliyata devam etmeden önce nefes alma oranını ve diğer hayati değerleri kontrol edin. Stresi azaltmak için hayvanın ~7 dakika dinlenmesine izin verin.<ol>
<li>Stereotaksik çerçeveye, hayvanın vücudunun üzerinde yatarak yatarak bir ısıtma yastığı yerleştirin. Bu, vücut sıcaklığını korumaya ve hayvanı prosedür dışında olsa da sıcak tutmaya yardımcı olacaktır. Ameliyat sonrası bakım ve iyileşme için ısıtma yastığını saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saç derisinin üzerindeki saçları çıkarmak ve cildi iyot çözeltisi ile temizlemek için bir makas kullanın.<ol>
<li>Kafa derisindeki hissi engellemek için topikal lidokrin uygulayın.</li>
		<li>Önden oksipital bölgeye uzanan orta çizgili bir kafa derisi kesisi yapmak için neşter kullanın.</li>
		<li>Kesi alanını iyot çözeltisi ile temizleyin, ardından calvaria'yı açığa çıkarın. NOT: Periosteumu kalvariden çıkarmak için az miktarda% 3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulanabilir. Bu, simge yapıların (bregma ve lambda) ve dikişlerin görünürlüğünü artıracaktır.</li>
		<li>Fare beyni stereotaktik atlası kullanarak, bregmaya göre AP ve ML koordinatlarını belirleyin.</li>
		<li>VTA enjeksiyonu için, ultra ince künt noktalı iğne şırıngasını (örneğin, Nöros şırıngası) AP koordinatlarına yerleştirin: -3,08 mm/ML: bregmaya göre 0,5 mm.</li>
		<li>İşaretli AP/ML koordinatında kafatasında 1 mm'lik bir delik (kraniyotomi) delik açmak için bir delme aleti kullanın. NOT: Bu adım önemli düzeyde dikkat gerektirir. Matkap ucunun beyin dokusunu ezmemesi için delme yaparken minimum basınç uygulanmalıdır. Mevcut çalışmada matkap ucu 0,8 mm idi ve matkap hızı 15.000 rpm olarak belirlendi. DİkKAT: Kesi veya kalvarinin temizlenmesinde hidrojen peroksit kullanılmışsa, çözeltinin tamamen çıkarılmasını sağlayın veya delmeden önce tam kuruluk sağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AAV kokteyl enjeksiyonu
NOT: Bu bölümde yetişkin C57BL/6 farelerin VTA'sına (23-27 g) AAV enjeksiyonu işlemi açıklanmaktadır. Açıklanan yöntem, standart stereotaktik aparatlar ve uygun koordinatlar kullanılarak herhangi bir beyin bölgesine AAV enjeksiyonu için kullanılabilir. Bu protokolü göstermek için, eYFP ve hChR2, VTA glutamat nöronlarında CaMKIIα promotörü altında AAV5 aracılı transfeksiyon kullanılarak ifade edilmiştir (Şekil 1). Cre-lox rekombinasyonu bu adım için de kullanılabilir.
<ol><li>Bir enjektöre ultra ince künt nokta iğnesi (32 G; 100 nL doğrulukta 5 μL kapasiteli) ile bir şırınga takın. Şırınga tutucuyu bir mikromanipülatöre sabitle. NOT: Bu prosedür için 1,6 nL kalibrasyonlu manuel şırınna tutucu kullanılmıştır. Otomatik bir enjektör de kullanılabilir.</li>
	<li>Sıvı akışını temizlemek ve test etmek için şırınnayı çift damıtılmış su ile doldurun.</li>
	<li>Buz üzerinde AAV (serotype 5) kokteyli aliquots çözün. AAV'ler iyi ifade için viral titreyi korumak için en iyi şekilde -80 °C'de saklanır.</li>
	<li>Monte edilen şırınnayı 1.000 nL AAV çözeltisi (fosfat tamponlu salin (PBS) 10 mM), pH 7.4 ile doldurun. İğneyi bir enjeksiyon bölgesine indirmeden önce sıvının akışını onaylamak için AAV çözeltisinin 10 nL'sini dağıtın.</li>
	<li>İğneyi stereotaktik olarak istenen derinliğe (DV koordinatı) indirmek için bir mikromanipülatör kullanın. İğneyi istenen derinliğe indirdikten sonra, şırınganın enjeksiyondan önce 10 dakika yerinde kalmasını kesin. NOT: Bu işlem için iğne, beynin pial yüzeyinden 4,5 mm derinlikte (DV) VTA'ya indirildi. Diğer beyin bölgeleri için uygun dorsoventral koordinatı kullanın (fare beyin atlasına bakın).</li>
	<li>VTA'ya 600-800 nL AAV enjekte edin. Enjeksiyon hacmi hedef sitenin boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir.<ol>
<li>AAV çözümünü 60 nL/dk (3 dakika aralık) hızında sunun.</li>
		<li>VTA glutamat nöronlarında ve projeksiyonlarında eYFP ve hChR2'yi ifade etmek için AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP enjekte edin. NOT: Cre-lox rekombinasyon yöntemi, deneyin amacına bağlı olarak da kullanılabilir.</li>
		<li>AAV enjeksiyonundan sonra iğnenin 15 dakika yerinde kalmasını izin verin. Bu, difüzyonu ve geri akışı azaltacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şırınga iğnesini çekin ve yarayı kapatmak için kesiği dikin.</li>
	<li>Ameliyat sonrası bakımın bir parçası olarak antibiyotik ve analjezi uygular. Fareyi sıcak yastıklı bir platforma yerleştirin ve uyanana kadar hayvanı izleyin. NOT: 3 haftalık enjeksiyondan sonra fare beyin bölümlerinde muhabir proteininin (eYFP) floresan tespiti ile AAV ekspresyolü gözlemlenebilir. Ayrıca, fotostimülasyon deneyleri 3 hafta sonra yapılabilir (Şekil 2).</li>
</ol>4. Optogenetik ile in vivo nöral kayıtlar için kurulum
NOT: Bu bölümde, bir beyin devresinin optogenetik izlemesi (CA1'e VTA glutamat nöron projeksiyonu) ile akut nöral kayıt için adımlar açıklanmaktadır. Gerekirse, bu adıma başlamadan önce sistemi (amplifikatör ve bağlantılar) elektrik gürültüsü ve topraklama sorunları için kontrol edin. Bu adımı bir Faraday kafesinde gerçekleştirmek, kayıttaki elektrik gürültüsünü ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir.
<ol><li>AAV enjeksiyonundan 3 hafta sonra, fareleri intraperitoneal üretan enjeksiyonu (0.2 mg/kg) ile uyuşturun. DİkKAT: Üretan kanserojendir ve koruyucu giysi giyerken dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Ayrıca, bu konsantrasyonda üretan anestezi uygulamak sağkalım değildir.</li>
	<li>Hayvanın başını daha önce açıklandığı gibi stereotaktik bir çerçeveye yapıştırın (adım 2.2, Şekil 3A). Durayı ortaya çıkarmak için kraniyotomi gerçekleştirin (Şekil 3A). Parietal kemiğin bir kısmını çıkarmak için bir delme aleti (bit boyutu: 0,8 mm, hız: 15.000 rpm) kullanın.<ol>
<li>Kraniyotomi yaklaşık 3 mm x 4 mm genişliğinde olmalıdır. Kuruluğu önlemek için bu bölgeye yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) damlaları uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseksiyon (dijital) mikroskop altında, maruz kalan durayı çıkarmak için bükülmüş bir iğne ucu (27 G) kullanın. Bu bölgedeki hassas pial kaplamayı ve kortikal dokuları ayırmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Zemin vidasını (tava başı Phillips vidası) tutmak için oksipital kemikte bir delik açın (bit boyutu: 0.8 mm, hız: 10.000 rpm); M0,6 x 2,0 mm).</li>
	<li>Paslanmaz çelik zemin tellerini bağlayın. NOT: Diğer tel türleri de kullanılabilir (Şekil 3b).</li>
	<li>Kombine fototimülasyon (VTA) ve nöral kayıt (CA1) için ultra ince (10 μm veya 1 μm) mikromanipülatörlerle donatılmış çok raylı stereotaksik bir aparat kullanın. Optik fiberi ve kayıt sinir probını sırasıyla 10 μm aralık ve 1 μm menzilli mikromanipülatöre monte edin.<ol>
<li>Gerekirse, bir kafa aşaması prob adaptörü kullanın (Şekil 3c). NOT: Mevcut protokolde, 4 kanallı bir kayıt elektrodu(Şekil 3d)tutmak için 32 kanallı bir kafa aşamasına bir adaptör takılmıştır. Paslanmaz çelik öğütülmüş tel, adaptörün zemin bağlantı noktasına lehimlenmişti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ap: -3.08 mm ML: 0.5 mm koordinatlarında, 400 μm çapındaki optik fiberi VTA'ya 200 μm düşür.<ol>
<li>Optik elyafı düşürmeden önce, yükseği fiber bağlantılı bir LED kaynağına bağlı bir fiber optik kabloya (paslanmaz çelik veya seramik yüksük ile) bağlayın. NOT: Işık yoğunluğunun ve odağın istenildiği gibi ayarlandığından emin olun. LED ışık kaynağının seçimi hedeflenen opsinlere karşılık gelmelidir. Burada, hChR2 fotoaktivasyonu için 470 nm (mavi ışık) LED sürücüsü kullanıldı (Şekil 4a).</li>
		<li>Işık darbesini nöral kayıtla senkronize etmek için, LED sürücüsünü ve kayıt denetleyicisi dijital IN bağlantı noktasını transistör-transistör mantığı (TTL) darbesine(Şekil 4b)bağlayın. Bu, bir BNC ayırıcı kullanılarak elde edilebilir. NOT: TTL darbeli solunum hizmeti kullanımı, istenen darbeli tren frekansını ve süresini dijital olarak ayarlama esnekliği sağlar. Mevcut protokolde, 50 Hz18'de 10ms ışık darbeleri tetiklendi. LED sürücünün TTL kontrolü için sürücüyü "tetikleyici" olarak değiştirin. Bu modda, ışık yoğunluğu "düğme" döndürülerek düzenlenebilir. Stimülasyon frekansı deneysel değişkenlere uyum sağlayacak şekilde ayarlanabilir ve 1 ila 100 Hz arasında değişebilir. Nöral devre izleme için >20 Hz'lik bir stimülasyon frekansı önerilir.</li>
		<li>Fotoelektrik eserler üretmeden yanıt oluşturabilecek etkili yoğunluğu belirlemek için düğmeyi ayarlayın. Gerekirse, objeleri ortadan kaldırmak için optik elyafı yeniden konumlandırın19. NOT: Mevcut protokol için kullanılan LED sürücü ~21,8 mW ışık gücü üretir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Sinirsel kayıt
<ol><li>En az 5 mm uzunluğunda, 15-50 μm kalınlığında bir saplı akut bir sinir probu kullanın. NOT: Derin beyin yapılarından kayıt, daha uzun saplı sinirsel problar gerektirecektir. Mevcut çalışmada 20 mm sap uzunluğunda bir prob kullanılmıştır.</li>
	<li>Ön amplifikatör kafa sahnesini seri çevre birimi arabirimi (SPI) kablosuyla kayıt denetleyicisine bağlayın. Kayıt denetleyicisi bağlantı noktalarında LED'lerin renk aydınlatmasını kontrol edin. Yeşil ve sarı LED'ler bağlı amplifikatör kartında uygun voltajı gösterir. Kırmızı LED, çalışan bir yazılım kafası sahne kontrolünü gösterir (Şekil 5b).</li>
	<li>Bir mikro manipülatör kullanarak, elektrot temas alanlarını CA1'in piramit hücre katmanına yerleştirin (AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 ila 1.2mm). NOT: Optik fiber ve elektrot, fotostimülasyon ve kayıt için istenen diğer beyin bölgelerine konumlandırılabilir.</li>
</ol>6. Amplifikatör ve filtre ayarları
<ol><li>Kayıt denetleyicisi amplifikatör sistemini USB 3.0 bağlantı noktasından bir bilgisayara bağlayın. SPI kablosunu kullanarak baş sahneyi amplifikatöre bağlayın. Denetleyici yazılımını başlatın. Düzgün bağlanmamışsa, sistem bir "aygıt bulunamadı" iletisi görüntüler.</li>
	<li>Kanallardaki etkinliği görüntülemek için Çalıştır'ı tıklatın. Her dalga formu gerilim (y ekseni) ve zamana (x ekseni) olarak çizilir. İlgi alanına bağlı olarak, dalga biçimi ekranını ayarlamak için voltaj ve zaman ölçeklerini ayarlayın.</li>
	<li>Yalnızca birkaç kanal etkinse, depolama diskinde dosya boyutunu azaltmak için kullanılmayan kanalları devre dışı bırakın.</li>
	<li>Satın alma yazılımındaki bant genişliği parametrelerini düzenleyerek örnekleme hızını ve kesme frekanslarını ayarlayın. Tek birimli kayıt için üst ve alt kesme frekanslarını sırasıyla 300 Hz ve 5.000 Hz olarak ayarlayın. Amplifikatör örnekleme hızını 30 kS/s olarak değiştirin. NOT: Yüksek örnekleme hızı seçmek daha büyük bir dosya boyutu üretecektir.</li>
	<li>Kayıt etmeden önce, empedansı 1.000 Hz olarak ölçerek elektrot kanallarının bütünlüğünü kontrol edin. Bu, işlevi kullanıcı arayüzünde (denetleyici yazılımı) başlatarak yapılabilir. Bir çalışma kanalının empedans değeri 0,1 ila 5 MΩ arasında olmalıdır.</li>
	<li>Analog OUT bağlantı noktasına bir ses çıkışı (hoparlör) bağlıysa, optimum ani ses için kazancı ve susturucusu ayarlayın.</li>
	<li>TTL darbeli tren işaretçisini ani kayıtta görüntülemek için Digital IN işaretçisinin görüntüsünü etkinleştirin. Darbe treni zaman damgasını kaydetmek için, ana denemeden önce Digital IN kanal ekranını etkinleştirin. NOT: Genellikle birden fazla "Digital IN" kanalı (1 veya 2) vardır. TTL darbeciden gelen BNC kablosunun kayıt denetleyicisi yazılımında görüntülenmek üzere seçilen "DIGITAL IN" bağlantı noktasına bağlı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Ani dalga biçiminin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, başak kapsamı penceresini açın ve fare tıklatarak eşiği ayarlayın.</li>
	<li>Kök Ortalama Karesini (μV'de RMS) izleyerek gürültü seviyesini inceleyin. Temiz ani kayıt için, sinirsel ani artış eşiğinin en az 5x RMS olması tercih edilir.</li>
	<li>Kurulum tamamlandıktan sonra dosya çıkış biçimini seçin. NOT: Burada, CA1 sinirsel ani artış .rhd biçiminde kaydedildi. Diğer dosya biçimleri (.rhs ve .dat) analiz yazılımı tarafından izin verilen dosya biçimleriyle eşleşecek şekilde de seçilebilir.</li>
</ol>7. In vivo optogenetik kayıt ve ayarlar
<ol><li>Çeşitli ayarlanabilir darbe parametrelerini görüntüleyen darbe kontrol yazılımını (TTL) açın. Yazılımda uygun COM bağlantı noktasını seçin. Tren ve Grup ayarlarını yaparak darbe parametrelerini ayarlayın. NOT: Nabız durumu deneysel değişkenler ve tasarım göz önünde bulundurularak belirlenmelidir.</li>
	<li>Amplifikatör denetleyicisi yazılımında, hipokampustaki veya istenen beyin bölgesindeki sinirsel ani artışları algılamak için Çalıştır'ı tıklatın. Gerekirse, uygulanabilir ve aktif nöronları tespit etmek için elektrot derinliğini ayarlayın.</li>
	<li>Hücre dışı voltaj aktivitesi tespit edildikten sonra, 15 dakika boyunca taban çizgisi sivri uçlarını gözlemleyin ve hayvanın hayatilerini izleyin. Ayrıca, CA1 veya istenen anatomik hedef bölgedeki duyarlı nöronları tespit etmek için ışık darbesini test edin. NOT: Fotoelektrik objeleri kontrol edin ve ışık yoğunluğunu veya optik fiber konumunu ayarlayarak ortadan kaldırın.</li>
	<li>Işık darbesini istenen frekansta tetiklemeden önce temel aktiviteyi ~10 dakika boyunca kaydedin(Şekil 5a,b). Bu, aydınlatmalı ve aydınlatmasız ateşleme veya patlama oranlarının karşılaştırılmasına izin verecektir. NOT: Mevcut çalışmada, temel aktivite aydınlatma olmadan 10 dakika boyunca kaydedilmiş, ardından 50 Hz 'de aydınlatma(Film 1).</li>
</ol>8. Analiz
<ol><li>.rhd dosyasını Nex5 çıktı biçimine dönüştürün.</li>
	<li>İşlem dosyası adı. Tek birim raster trenleri ve dalga formlarını algılamak için çevrimdışı bir sıralayıcı yazılımında Nex5 dosyası (Şekil 5a–b).<ol>
<li>Açılan pencereden istediğiniz kanalı seçin. NOT: Sürekli kaydedilen ani veriler OFSS'nin ayrı bir penceresinde görüntülenebilir. Zaman ölçeği de ayarlanabilir. Bir tetrode kullanılırsa, OFSS 4 kanalı tetrode olarak sıralamak için ayarlanabilir.</li>
		<li>Eşik geçişi dalga biçimi ekstraksiyonu için voltaj seviyesini ayarlayın. DİkKAT: Uygun ani algılama için en az 5x RMS kullanın.</li>
		<li>Dalga formlarını algılayın, ardından vadi arama (otomatik) veya K-means (yarı otomatik) yöntemini kullanarak ani sıralama gerçekleştirin. Gerektiğinde, 3D-Principal Bileşen Analizi (PCA) alanının benzer bölgelerini kaplayan birimleri birleştirin.</li>
		<li>Sıralanmış dışarı aktarma . Daha fazla analiz için Nex5 dosyaları (Şekil 5c–d). NOT: Ara aralık, atış hızı ve patlama hızı için analiz sonuçları diğer analiz platformlarına aktarılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. AAV ifadesinin floresan tespiti
<ol><li>Kayıttan sonra, hayvanı bir izofluran odasında ötenazi.</li>
	<li>10 mM PBS (~10 mL) ile transkardiyal perfüzyon ve ardından %4 fosfat tamponlu paraformaldehit (PB-PFA, ~10 mL) gerçekleştirin.</li>
	<li>Tüm beyni sağlam bir şekilde çıkarın ve 48 saat boyunca% 4 PB-PFA'da sabitle.</li>
	<li>Sabit beyni 4 °C'de kriyoprezervasyon için %30 sakkaroz içeren %4 PB-PFA'ya aktarın. 72 saat sonra, beyni kriyostatta bölümleyin ve jelatin kaplı bir kaydıraktan dilimler monte edin. NOT: Mevcut protokolde, DG, CA3 ve CA1'deki AAV etiketli terminalleri göstermek için hipokampüsün (rostral) kapalı kısmını içeren bölümler seçilmiştir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent,+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons.">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).</li><li>Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-synaptic+Neural+Circuit-Tracing+with+Neurotropic+Viruses.">Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses.</a> Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).</li><li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+as+transneuronal+tracers.">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Dragatsis, I., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+generation+of+conditional+gene+repair+mutations+in+mice.">A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice.</a> Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).</li><li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141 (1), 154-165 (2010).</li><li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior.">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).</li><li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics.">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li><li>Kohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genetic+and+optogenetic+tools+reveal+hippocampal+CA2+circuits.">Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).</li><li>Gombash, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Viral+Vector+Delivery+to+the+Enteric+Nervous+System:+A+Review.">Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review.</a> Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Viral+Vectors+in+Neuroscience+Research.">Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Montardy, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+glutamatergic+VTA+neural+population+responses+to+aversive+and+rewarding+conditioning+in+freely-moving+mice.">Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice.</a> Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+vector:+use+for+transgene+expression+and+anterograde+tract+tracing+in+the+CNS.">Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS.</a> Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+anterograde+transsynaptic+tagging:+mapping+corticocollicular+input-defined+neural+pathways+for+defense+behaviors.">AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV+serotype+1+transduction+efficiency+and+tropism+in+the+murine+brain.">Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain.</a> Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).</li><li>Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Stimulation+of+the+Basolateral+Amygdala+Increased+Theta-Modulated+Gamma+Oscillations+in+the+Hippocampus.">Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).</li><li>Buzsaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+probing+local+circuits:+high-density+silicon+probes+combined+with+optogenetics.">Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics.</a> Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).</li><li>Benardo, L. S., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+action+on+hippocampal+pyramidal+cells.">Dopamine action on hippocampal pyramidal cells.</a> Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).</li><li>Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Upside+to+Reward+Sensitivity:+The+Hippocampus+Supports+Enhanced+Reinforcement+Learning+in+Adolescence.">An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence.</a> Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).</li><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward+and+Aversion.">Reward and Aversion.</a> Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).</li><li>Kahn, I., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+connectivity+between+the+hippocampus,+nucleus+accumbens,+and+ventral+tegmental+area+in+humans.">Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans.</a> Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).</li><li>Lisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+hippocampal+circuitry+to+function:+recall+of+memory+sequences+by+reciprocal+dentate-CA3+interactions.">Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions.</a> Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).</li><li>Lisman, J. E., Grace, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippocampal-VTA+loop:+controlling+the+entry+of+information+into+long-term+memory.">The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory.</a> Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).</li><li>Broussard, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Regulates+Aversive+Contextual+Learning+and+Associated+In+Vivo+Synaptic+Plasticity+in+the+Hippocampus.">Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus.</a> Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).</li><li>Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1/D5+receptors+mediate+informational+saliency+that+promotes+persistent+hippocampal+long-term+plasticity.">Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity.</a> Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).</li><li>Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+rewarding+and+novel+events+in+facilitating+memory+persistence+in+a+separate+spatial+memory+task.">The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task.</a> Learning &amp; Memory. 21 (2), 61-72 (2014).</li><li>Ntamati, N. R., Luscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VTA+Projection+Neurons+Releasing+GABA+and+Glutamate+in+the+Dentate+Gyrus.">VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus.</a> eNeuro. 3 (4), (2016).</li><li>Yoo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+glutamate+neurons+co-release+GABA+and+promote+positive+reinforcement.">Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement.</a> Nature Communications. 7, 13697 (2016).</li><li>Funahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+Memory+in+the+Prefrontal+Cortex.">Working Memory in the Prefrontal Cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+context+with+reward:+a+functional+circuit+from+hippocampal+CA3+to+ventral+tegmental+area.">Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area.</a> Science. 333 (6040), 353-357 (2011).</li><li>McNamara, C. G., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+sources+of+dopamine+for+the+hippocampus.">Two sources of dopamine for the hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).</li><li>McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+promote+hippocampal+reactivation+and+spatial+memory+persistence.">Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence.</a> Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics.">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Anterograde+Transsynaptic+Tagging:+Mapping+Corticocollicular+Input-Defined+Neural+Pathways+for+Defense+Behaviors.">AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).</li><li>Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetics.">Two-photon optogenetics.</a> Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Son on yılda, AAV yapılarının tasarımı önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu nedenle, daha fazla nörona özgü promotörler, gelişmiş transfeksiyon özgüllüğü için bir dizi AAV serotipine dahil edilmiştir14. Floresan proteinler, taşıyıcılar, reseptörler ve iyon kanalları için genleri birleştirerek, AAV kütüphaneleri artık görüntüleme, nöromodülasyon ve sinaptik aktivite tespiti için mevcuttur. Ticari olarak mevcut AAV yapılarında, genetik olarak kodlanmış bir flor...

Son on yılda, nöron tipi modülasyonun özgüllüğünü ve karmaşık sinir ağlarının haritalandırılmasını artırmak için bir dizi genetik araç geliştirilmiştir1. Özellikle, nöron alt tiplerinde belirli proteinleri ifade etmek veya alevlendirmek için nöronal hücrelerde enfekte olma ve çoğaltma yeteneğine sahip nörotropik virüsler konuşlandırılmıştır. Floresan proteinleri veya genetik olarak kodlanmış sinaptik aktivite göstergelerini barındırırken, transfected AAV vektörleri beyin bölgelerindeki sinir ağlarını etiketler ve tanımlama2,3. AAV yapısında bir promotörün seçimi, vektörün nöron tiplerinde bir miktar özgüllük(promotöre bağımlı ifade) ile ifadesini yönlendirir. Bununla birlikte, Cre-lox rekombinasyonu sayesinde, AAV yapılarınöron etiketlemesi 4,5,6,7için daha fazla özgüllükle dağıtılır. Not olarak, AAV vektörlerinde paketlenmiş fotoaktive mikrobiyal opsinler ve floresan proteinler çeşitli nöron alt tiplerinde ifade edilebilir8ve görüntüleme, nöron tipi devre izleme ve fotomodülasyon için idealdir9,10.
AAVs, soma, dendrit ve akson terminallerinde muhabir proteininin ekspresyonunun ifadesini yönlendiren bir beyin bölgesine (veya çekirdeğe) stereotaktik olarak enjekte edilen yapılar oluşturur. Bir muhabir geni (eYFP) barındıran AAV'nin sinirsel ifadesi, nöron hücre cisimlerinin etiketlenerek diğer beyin bölgelerine ve diğer beyin bölgelerine yapılan projeksiyonların anatomik olarak izlenmesini kolaylaştırır11,12,13,14. Işık kontrollü opsin taşıyan AAV-eYFP yapıları (örneğin, hChR2),6,15 görüntüleme ve16 vivo beyin bölgelerini hedeflemek için sinirsel projeksiyonların stimülasyontabanlı fizyolojik izleme için bir araç olarak dağıtılabilir. AAV serotipine bağlı olarak, nöron etiketlemenin yönü anterograd veya retrograd11,12olabilir. Önceki çalışmalar, AAV5'in nöronlarda anterograd olarak seyahat ettiğini ortaya12. Böylece, hChR2'yi ifade eden hücre cisimlerinin fotostimülasyonu beynin başka yerlerinde presynaptik etkiler üretir (hedef)17.
Burada VTA glutamat nöronlarında ve aksonal projeksiyonlarda eYFP (muhabir) ve hChR2 (opsin) ifade etmek için CaMKIIα promotörüne sahip AAV (serotip 5) kullanıldı. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, CA1, CA3 ve DG hipokampal bölgelerdeki VTA glutamat presynaptik terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, temel değerlerle karşılaştırıldığında CA1 çok birimli ve tek birimli ateşleme oranlarını vivo olarak artırdı. Bu protokol, sinir devresi izleme deneylerinden elde edilen verilerin kalitesini artırabilecek uygun fiyatlı araçlar ve ticari olarak kullanılabilen yazılımları kullanır.

<table><tbody><tr><td>3% Hydrogen peroxide</td><td>Fisher chemical</td><td>H312</td><td></td></tr><tr><td>AAV-CaMKII&amp;alpha;-ChR2-eGYP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #26969</td><td></td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC Splitter</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Split Mating Sleeve for &amp;Oslash;1.25mm Ferrules.</td><td>Thorlabs</td><td>ADAL1-5</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>LR 39098</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin coated slides</td><td>Fisher scientific</td><td>OBSLD01CS</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&#039;s syringe (Neuros)</td><td>WPI Inc.</td><td>06H</td><td></td></tr><tr><td>Head stage adapter</td><td>Neuronexus</td><td>Adpt-Q4-OM32</td><td></td></tr><tr><td>High impedance silicon probe</td><td>Neuronexus</td><td>Q1x1-tet-5mm-121-CQ4</td><td></td></tr><tr><td>INTAN 512ch Recording Controller</td><td>INTAN</td><td>RHD2000</td><td></td></tr><tr><td>Iodine solution</td><td>Dynarex</td><td>1425</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Spectrum</td><td>K1068</td><td></td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>LED light source (470 nm)-blue light</td><td>Thorlabs</td><td>M470F3</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M0-203</td><td></td></tr><tr><td>Optic fiber</td><td>Thorlabs</td><td>CFMLC14L05</td><td></td></tr><tr><td>Pan head philips screw (M0.6 X 2mm)</td><td>Amazon</td><td>M0.6 X 2mm</td><td></td></tr><tr><td>Pre-amplifier headstage (32 Channel)</td><td>INTAN</td><td>C3314</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Kopf</td><td>1530</td><td></td></tr><tr><td>TTL pulser</td><td>Prizmatix</td><td>4031</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61430</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Version&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>version 8</td><td></td></tr><tr><td>Intan Recording Controller</td><td>Intantech</td><td>version 2.07</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td>version 5.215</td><td></td></tr><tr><td>Plexon Offline Spike Sorter</td><td>Plexon Inc</td><td>version 4.5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ACSF Composition:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 3 KCl, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and 25 Glucose).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined in vivo anatomical and functional tracing of ventral tegmental area glutamate terminals in the hippocampus

Beyindeki nöron alt popülasyonlarının optogenetik modülasyonu, araştırmacıların in vivo ve ex vivo'daki sinir devrelerini parçalamalarına izin sağlamıştır. Bu, nöron tiplerinin bir sinir devresi içindeki rolünü ve öğrenmeye göre bilgi kodlamasındaki önemini belirlemek için bir öncül sağlar. Aynı şekilde, yöntem uyanık ve uyuşturulmış hayvanlarda iki veya daha fazla bağlı beyin bölgesinin fizyolojik önemini test etmek için kullanılabilir. Mevcut çalışma, VTA glutamat nöronlarının anestezi edilmiş farelerin CA1'deki (hipokampus) putatif piramital nöronların atış hızını nasıl modüle ettiklerini göstermektedir. Bu protokol, hipokampus katmanlarında VTA presynaptik glutamat terminallerinin izlenmesi için VTA glutamat nöronlarının adeno ilişkili virüs (AAV) bağımlı etiketlemesini kullanmaktadır. AAV vektörü tarafından barındırılan ışık kontrollü opsin (channelrhodopsin; hChR2) ve floresan proteininin (eYFP) ekspresyasyonu, VTA glutamat terminallerinin anterograd izlenmesine ve VTA glutamat nöron hücre cisimlerinin (VTA'da) fototimülasyonuna izin verdi. Yüksek empedanslı akut silikon elektrotlar, VTA fotostimülasyonuna in vivo olarak çok birimli ve tek birimli yanıtları tespit etmek için CA1'e yerleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları hipokampustaki (CA1, CA3 ve DG) presynaptik VTA glutamat terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, putatif CA1 piramidal ünitelerinin in vivo ateşlenme ve patlama hızını artırdı.

Anterograd izleme
AAV ekspresyolojisi, enjeksiyondan 21 gün sonra C57BL/6 fare vtasında muhabir proteininin (eYFP) immünofluoresans görüntülemesi ile doğrulanmıştır (Şekil 2). Hipokampustaki presynaptik VTA glutamat projeksiyonlarının başarılı anterograd etiketlemesi de DG, CA3 ve CA1 katmanlarında eYFP tespiti ile doğrulandı(Şekil 6a–d; Film 2 ve 3).
...

Watch this Scientific Journal Video about Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus at JoVE.com

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

combined-vivo-anatomical-functional-tracing-ventral-tegmental-area

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K Görüntüleme.  Louisiana State University School of Veterinary Medicine. Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Video: Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Davranış

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Biyokimya

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Yüksek çözünürlük<em&gt; İn Vivo</em&gt; 3T Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanma İnsan hipokampal alanlar için Manuel Segmentasyon Protokolü

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Nörobilim

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

Yüksek molekül ağırlıklı Biotinylated Dextran Amin uygulama içinde sıçan izleme Thalamocortical projeksiyon için geliştirmek

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Farelerin dentat gyrus hücrelerinde nöron aktivitesi için gerçek zamanlı görüntüleme 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

Yazar Spotlight: Dentate Gyrus Granül Hücrelerinin Nöral Aktivitesinin Minyatür Mikroskop ile İncelenmesi

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[³H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Yüksek çözünürlük

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Yüksek molekül ağırlıklı Biotinylated Dextran Amin uygulama içinde sıçan izleme Thalamocortical projeksiyon için geliştirmek

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi