Yazarlar, Sokac laboratuvarında bu tekniğin öncülükine yardımcı olan Liuliu Zheng ve Zenghui Xue'nun yanı sıra analize yardımcı olan Hasan Seede'nin çalışmalarını minnetle kabul ediyorlar. Bu çalışma nih (R01 GM115111) tarafından bir hibe ile finanse edilir.

1. Embriyo toplama kapları ve elma suyu agar tabakları hazırlayın
<ol><li>Enjeksiyon deneyinden beş gün önce,28 tane inşa edin veya en az iki küçük embriyo toplama bardağı temin edin. Küçük toplama bardakları ile kullanılmak üzere taze 60 mm elma suyu agar tabakları yapın28. Tabakları 4 °C'de nemli kağıt havlularla kaplı plastik kutularda saklayın. NOT: Adım 1.3'te açıklandığı gibi sinek sayılarıyla doldurulan küçük embriyo toplama bardakları, deney başına yeterli embriyo sayısı sağlarken, embriyo elleçleme ve enjeksiyonunun erken gelişim evrelerinin görüntülenmesine izin verecek kadar kısa sürede yapılabilmesini sağlayacaktır.</li>
	<li>18 °C'ye kadar ılık elma suyu tabakları ve tabağın ortasına bir dab maya ezmesi ekleyin. Maya macunu, aktif maya ve damıtılmış suyun basit bir macunudur.</li>
	<li>En cömert yumurtlamayı teşvik etmek için, deneyden 2 gün önce sinekli toplama bardakları kurun. Toplama bardaklarına en az 100 dişi ve 50 erkek sinek ekleyin ve hazır bir elma suyu tabağı ile üst üste koyun (Şekil 1, adım 1). Enjeksiyon deneyine kadar geçen günlerde elma suyu plakalarını her gün en az iki kez, sabahları bir kez ve akşamları bir kez değiştirin. NOT: En iyi enjeksiyon ve görüntüleme sonuçları, embriyo toplama bardakları 12 saat ışık açma/kapama döngüsü ile 18 °C'de tutulduğunda elde edilir.</li>
</ol>2. Mikroenjeksiyon için G-actinRed'in çalışan bir stok çözeltisi hazırlayın
NOT: Bu hazırlık sadece 5 mg / mL çalışma stoğunun 2 μL'sini yapar G-actinRed, bu nedenle kullanıcılar mikroenjeksiyon tekniğine alışık değilse, 3. Satıcıdan alınan 10 μg G-actinRed stoğu, orijinal ambalajında 6 aya kadar 4 °C'de ~500 g kurutuculu 16 oz vidalı üst kavanozda saklanabilir.
<ol><li>Önceden bir G-tampon stok çözeltisi hazırlayın: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Oda sıcaklığında filtreleyin ve saklayın.</li>
	<li>Enjeksiyon gününde, belirtilen son konsantrasyonlarda aşağıdakilerle birlikte G-tampon stoğunu kullanarak buz üzerinde taze bir snap kapağı mikrosantrifüj tüpünde 1 mL G-tampon çalışma çözeltisi hazırlayın: 1 mM dithiothreitol (DTT) ve 0.2 mM ATP, pH 8.0. NOT: 1 mL'lik G-buffer çalışma çözümü, bir deney için gerekenden daha fazladır, ancak hazırlığı kolaylaştırır. Fazlalık denemeden sonra atılabilir veya kullanıcılar tercihlerine göre ölçeklendirilebilir.<ol>
<li>10 μg G-actinRed stoğunu buzda tutarak, önce tüpün içindeki G-actinRed'in pembe damlacığı üzerine 1 μL filtrelenmiş, damıtılmış su ekleyin.</li>
		<li>Ardından, adım 2.2'den 1 μL soğuk, taze hazırlanmış G-tampon çalışma çözeltisi ekleyin. Pipet hacmi 1 μL'ye ayarlanmışken iyice karıştırmak için ~20 kez yukarı ve aşağı borulayın. G-actinRed stoğu artık 5 mg/mL'lik son seyreltmede olacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazırlanan G-actinRed'i buz üzerinde bozulmadan 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hazırlanan G-actinRed'i 16.000 x g'da 4 °C'de 20 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjle kırarak herhangi bir çökeltmeyi çıkarın.</li>
	<li>Süpernatantın 1,5 μL'lik kısmını buz üzerinde taze bir kapak mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice borulayarak koyu pembe peletten kaçının.</li>
	<li>Hazırlanan G-actinRed supernatant'ı bir mikroneedle yüklenmeye hazır olana kadar 6 saate kadar buzda saklayın. NOT: Mikroneedles, bir mikropipette çekme makinesinde peşin olarak kılcal borulardan çekilebilir, daha sonra oda sıcaklığında 100 x 20 mm Petri kabındaki modelleme kil şeridinde saklanabilir. Mikroneedle çekme için önerilen parametreler Pipet Yemek Kitabı29'da bulunabilir.</li>
</ol>3. Embriyoları toplayın ve enjeksiyon için monte edin
<ol><li>Sineklerin 18 °C'de maya macunu ile elma suyu plakalarına 30 dakika boyunca embriyo bırakmasına izin verin.</li>
	<li>Sinekler döşenirken, maya ezmesi olmayan bir elma suyu agar tabağını oda sıcaklığına önceden ısıtın, jiletle elma suyu agarının 4 cm x 1 cm dikdörtgen kamasını kesin ve 25 mm x 75 mm'lik bir cam kaydırağa yerleştirin.<ol>
<li>30 dakikalık toplamadan hasat plakası ve28'de açıklandığı gibi damıtılmış su ile 1:1 seyreltilmiş taze çamaşır suyu dökülerek ve plakayı 1 dakika döndürerek embriyoları kaynatın (Şekil 1, adım 2). NOT: Farklı çamaşır suyu markaları farklı konsantrasyonlarda satılmaktadır. Burada kullanılan çamaşır suyu şişeden% 6 sodyum hipoklorittir ve% 3 sodyum hipoklorit nihai konsantrasyonuna seyreltilir. Biraz daha düşük konsantrasyonlardaki diğer çamaşır suyu markaları eşit derecede iyi çalışacaktır.</li>
		<li>Çamaşır suyu ve dekonsiyone embriyoları bir toplama sepetine (70 μm hücre süzgeci) dökün ve tabağı bir fışkırtma şişesinden damıtılmış su ile iki kez durulayın ve bu yıkamaları toplama sepetine ekleyin.</li>
		<li>Kafeinsiz embriyoları, maya kümeleri görünmeyene ve sepet bir kağıt havluya şişirildiğinde fazla çamaşır suyundan pembe iz bırakmayana kadar damıtılmış su ile toplama sepetinde kuvvetlice durulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Damıtılmış su ile nemlendirilmiş kıllı bir boya fırçası kullanarak, dekonsiyone edilmiş ve yıkanmış embriyoları toplama sepetinden cam slayttaki hazırlanan elma suyu agar kamasına aktarın.</li>
	<li>Dikdörtgen agar kamasının uzun ekseni boyunca on embriyoyu düz bir çizgide düzenlemek için bir çift ince uçlu cımbız veya bir diseksiyon iğnesi kullanın (Şekil 1, adım 3). Embriyoları, ön kutupları sağa bakacak ve dorsal tarafı araştırmacıya bakacak şekilde baş döndürücü olarak düzenleyin(Şekil 1, adım 3, büyütülmüş).</li>
	<li>Bir P200 pipet ucunun ucunun 0,5 cm'lik kısmını jiletle kesin ve "embriyo tutkalına" daldırın(28'deaçıklanmıştır). 24 mm x 50 mm dikdörtgen kapak ucunun uzun kenarı boyunca 5 mm genişliğinde bir bölgeyi cömertçe kaplayın (Şekil 1, adım 4) ve kuru, tutkal tarafını yukarı bırakın. Kurutma ~ 30 s alacaktır ve tutkal kaplı bölgenin tamamı ıslak veya parlak değil mat göründüğünde tamamlanır. NOT: "Embriyo tutkal" ı en az 48 saat önceden hazırlayın. 28'deaçıklandığı gibi bir scintillation şişesinde çift taraflı bant şeritlerine n-Heptane ekleyin.</li>
	<li>"Embriyo tutkalı" kuruduktan sonra, kapak germe tutkal tarafını agar üzerindeki hizalanmış embriyo sırasının üzerine hafifçe yerleştirin ve kapak ucunun kenarı ile embriyo sırası arasında 2-3 mm boşluk bırakın. NOT: Embriyoları kapak ucunun kenarına çok yakın yapıştırmak, deney sırasında embriyoların çok fazla kurumasına neden olabilir.</li>
	<li>Kapak kapağını ters çevirin, böylece embriyolar şimdi yukarı bakacaktır. Kapak çizgisinin uzun bir kenarı boyunca bir çizgide sıkışıp kalmalıdırlar ve ventral bölgeleri kapak çizgisinin en yakın kenarına bakmalıdır(Şekil 1, adım 4, büyütülmüş).</li>
	<li>16 oz vidalı üst kavanozda saklanan 150 g taze mavi kurutucunun üzerine embriyolarla kapak kapağını hafifçe yerleştirerek embriyoları kurulayın. Kapağı sıkıca vidalayın ve 8-10 dk boyunca kuluçkalayın(Şekil 1,adım 5).</li>
	<li>Tahliyeden sonra, kapak kapağını kurutucu kavanozdan çıkarın ve kapakçığın her kısa tarafını bir mikroskop kaydıramasına bantlayın, embriyo tarafı yukarı, iki adet 4 cm2 çift taraflı bantla, böylece embriyo kapak kapağı enjeksiyon aşamasına sığar (Şekil 1, adım 6).</li>
	<li>Hizalanmış embriyoları örtmek ve daha fazla dehidrasyondan korumak için Pasteur pipetli 2-3 damla Halocarbon 27 yağı ekleyin (Şekil 1, adım 6).</li>
</ol>4. Aktüer çubuk oluşumunu teşvik etmek için enjeksiyon ve ısı stresi embriyoları
NOT: Tüm enjeksiyonlar 18 °C'de sıcaklık kontrollü bir odada yapılır.
<ol><li>Cam petri kabından en az 100 mm x 20 mm boyutunda nemli kuluçka odaları hazırlayın ve odayı damıtılmış su ile nemlendirilmiş laboratuvar doku sileceklerinin bükümleriyle hizalayın (Şekil 1, adım 8). Embriyo enjekte etmeden önce kuluçka odalarını 32 °C'de veya istenen kuluçka sıcaklığında önceden ısıtın.</li>
	<li>Mikroenjektör için hava akımı vanasını açın ve mikroenjektörü açın (en az 90 psi basınçlı basınçlı basınçlı hava veya ev havası uygundur).</li>
	<li>Embriyolar kururken, daha önce hazırlanan G-actinRed süpernatantı mikro yükleyici ucu kullanarak mikroneedle geri yükleyin. Pipet 1-1,5 μL çekecek şekilde ayarlayın. NOT: Akinin viskozitesi nedeniyle, yükleme hacimleri doğru olmayabilir ve en az bir ila iki mikroneedle daha yüklemek için yeterli aksini kalmış olabilir. Mikroneedle uygun şekilde kalibre edilirse ve deney sırasında tıkanmazsa, yüklenen mikroneedle başına 60 embriyo enjekte edilebilir.</li>
	<li>Mikroneedle iğne tutucuya takın ve vidayı sıkın. Hava tüpünü mikroenjektöre bağlayın ve mikroneedle üzerindeki geri akış basıncının 30 hPa'ya kadar dengede olduğundan emin olun.</li>
	<li>Bir slayt mikrometresine 100 μm çapında bir G-actinKırmızısı (~500 pL) kabarcık püskürtmek için mikroenjektör ayarlarını kalibre edin. Doğru kabarcık boyutunu elde etmek için basınç düğmesini (500-1500 hPa) ve enjeksiyon darbe zaman düğmesini (0,1-0,5 s) mikroenjektör üzerinde döndürün. Aktüer viskozitesi ve mikroneedle uç boyutundaki değişkenliği hesaba katmak için her yeni mikroneedle yüklendiğinde bu ayarları yapın. NOT: Hazırlanan G-actinKırmızısı viskozdur ve mikroneedlenin ucunda embriyo enjekte etmeden önce atılması gereken hava olabilir. G-actinRed mikroneedle ucundan kolayca dışarı atmazsa, mikroneedle ucunu slayt mikrometresinin kenarına doğru hafifçe kırın.</li>
	<li>Slaydı monte edilmiş embriyolarla mikroskop aşamasına yerleştirin. NOT: Kurulan her enjeksiyon farklı olacaktır, bu nedenle araştırmacılar enjeksiyon yöntemini buna göre ayarlamak zorunda kalacaktır. Burada embriyolar sabit bir mikroneedle göre hareket ettirilir ve embriyoyu mikroneedle çalıştırarak her embriyoyu enjekte eder.</li>
	<li>10x hedefinin mikromanipülatör aşamasını ve odak noktasını, embriyoların görünür olması için ışık mikroskobuna ayarlayın. Vitelline zarının ana hatları en keskin olduğunda ve embriyo en büyük göründüğünde embriyolar doğru odak düzlemindedir. Doğru gelişim aşamasında olan enjekte etmek için embriyoları seçin, böylece enjeksiyon sonrası inkübasyon tamamlandığında, debriyajın çoğu istenen gelişim aşamasına ulaşır (örneğin, 32 ° C'de ısı stresinden sonra hücreselleştirmede çubukları gözlemlemek için Bownes'un2-3 30 aşamasında embriyo enjekte edin).</li>
	<li>İğneyi embriyolarla aynı odak düzlemine getirmek için mikroneedle kontrollerini kullanın. NOT: Aşamayı veya mikroneedleyi hareket ettirirken mikroneedle kapakta yakalanırsa, mikroneedle slayta çok yakındır ve doğru odak düzleminde değildir. Mikroneedle kapak ucuna paralel olmalı ve önemli bir açıda olmamalıdır (Şekil 1, adım 7).</li>
	<li>Mikroneedleyi embriyoya yerleştirin, böylece embriyoyu ventral bölgesinin ortasında, embriyo "ekvatorunda" vurur. Mikroneedle ucu embriyonun ortasında göründüğünde ayak pedalı veya "enjekte" düğmesi ile enjeksiyonu tetikleyin (Şekil 1, adım 7).</li>
	<li>G-actinRed'i bir kez enjekte edin ve mikroneedleyi yavaşça çıkarın. Sahneyi hareket ettirin ve uygun gelişim aşamasının her embriyosu için tekrarlayın. NOT: G-actinRed enjekte edildiği ve embriyodan biraz sitoplazma sızabileceği için embriyonun genişlemesi normaldir.</li>
	<li>Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, slaytı embriyolarla birlikte hazırlanan nemli inkübasyon odasına yerleştirin ve kapağı kapatın (Şekil 1, adım 8). Hücreselleşmeye ulaşan embriyolar elde etmeye çalışıyorsanız, nemli inkübasyon odasında 60-75 dakika boyunca embriyoları 32 °C'de ısı stresine sokun. NOT: Isı stresli embriyoların hücreselleştirilmesinde çubukların görselleştirilmesine izin veren kuluçka sürelerine dikkat edilir. İnkübasyon süresi ısı stres kontrolü olmayan embriyolar için daha uzun olacaktır, çünkü gelişim daha düşük bir sıcaklıkta daha yavaş olacaktır31. Bu kontrol embriyoları, belirli bir deneyin tasarımına ve sorulacak soruya bağlı olarak 18 °C veya 25 °C gibi sıcaklıklarda nemli odalarda inkübe edilebilir. G-actinRed'in embriyo boyunca yayılması için gereken minimum kuluçka süresi 30 dk'dır.</li>
</ol>5. Konfokal mikroskopi ile ısı stresli embriyolarda görüntü aktivasyon çubukları
<ol><li>Embriyolar ısı stresi altındayken, konfokal mikroskobu açın ve 561 nm lazer kanalını seçin.</li>
	<li>Objektif lensi (25x, 40x veya 63x önerilir) çalışma konumuna getirin.</li>
	<li>Görüntüleme embriyoları ısıtıyorsa, ısıtılmış sahne inkübatörü 32 ° C iç sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın. Hedefteki veya yakınındaki sıcaklığı kontrol etmek için bir nokta ve çekim veya kızılötesi termometre kullanılabilir.</li>
	<li>Kuluçka tamamlandıktan sonra enjekte edilen embriyolarla slaydı nemli inkübasyon odasından çıkarın (Şekil 1, adım 9).</li>
	<li>Hızlı bir şekilde çalışarak, kapak kapağını monte edilmiş embriyolarla slayta yapıştırmak için kullanılan çift taraflı bant parçalarını hafifçe çıkarın (Şekil 1, adım 9). DİkKAT: Çok fazla kuvvet uygulandığında kapaklar kolayca parçalanabileceğinden, bu adımlar sırasında nazik olun.</li>
	<li>İki adet 2,5 cm uzunluğunda çift taraflı bant parçasını birbirine yapıştırın ve bandı 2,5 x 0,5 cm uzunluğunda iki şerit yapmak için iki uzunlamasına kesin (Şekil 1, adım 10).</li>
	<li>Her bant şeridinin uzunluğunun üçte ikisini ilk kapak ucuna yapıştırın, Halocarbon 27 yağında embriyoların her iki tarafını da kuşatın (Şekil 1, adım 10, turuncu), bant şeritlerinin üçte birini embriyoların sıkıştığı ilk kapak kapağının kenarında asılı bırakın. Eldivenli eller kullanın ve bu adım sırasında embriyolara dokunmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Embriyoları kapaklar arasına sandviç yapmak için bant şeritlerinin üzerine hafifçe ikinci bir dikdörtgen örtü yerleştirin(Şekil 1, adım 10, mavi). 25 mm'lik kenarları hizalayın, ancak 50 mm'lik kenarları bir birinden 1 cm genişliğinde tutun. NOT: Bu ikinci coverlip'in tam yüzeyi objektif lense bakacak yeni görüntüleme yüzeyi olacak, bu nedenle bu ikinci kapaklı yüzeyde parmak izi veya Halocarbon 27 yağı almamaya dikkat edin. Embriyoları eşit şekilde batırmak için ekstra Halocarbon 27 yağı eklenebilmesi için ofset gereklidir. Gerekirse, iki örtünün sandviçin üst kısmında buluştuğu dikişe Halocarbon 27 yağı ekleyin ve embriyoları kılcal etki ile kaplayacaktır (Şekil 1, adım10'dakikesik çizgilere bakın).</li>
	<li>Kapak kapağının banta yapışmasını sağlamak için bir jiletin künt tarafıyla doğrudan bant şeritlerinin üzerinde olan kapak zarının alanlarına hafifçe dokunun.</li>
	<li>Kapaklı sandviçi ters çevirin ve görüntüleme yüzeyini temiz tutmak ve konfokal mikroskopa taşımak için bir laboratuvar doku silecek üzerine yerleştirin (Şekil 1, adım 11). Görüntülemeden önce bandın her iki kapak kapağına da tamamen yapıştığından emin olun.</li>
	<li>Isıtılmış aşamanın sıcaklıkta olduğunu onaylayın ve ters bir mikroskop kullanıyorsanız, seçilen objektif lense daldırma sıvısı ekleyin.</li>
	<li>Yeni görüntüleme yüzeyinin (2nd coverlip) daldırma sıvısına dokunan yüzey olduğundan emin olmak için kapaklı sandviçi dikkatlice sahneye yerleştirin (Şekil 1, adım 11). NOT: Gerekirse, kapaklar ısıtılmış aşamaya iyi uymuyorsa görüntüleme sırasında gereksiz hareketi önlemek için kapaklı sandviçi iki küçük çift taraflı bantla sahneye yapıştırın.</li>
	<li>Bulaşan ışık veya floresan kullanarak hücreselleşme (Bownes evre4a 30)veya istenen gelişim aşamasında olan bir embriyoya odaklanın.</li>
	<li>Bir embriyo odak noktasına getirildikten sonra, konfokal mikroskopta lazer alma moduna geçin ve lazer gücünü ve kazancını, çerçeve boyutunu, döşemesini ve projeksiyon ayarlarını istediğiniz gibi ayarlayın.</li>
	<li>intranükleer aksin çubuklarını bulmak için embriyo çekirdeğinin odak düzlemlerinden yüzey görünümü görüntüleri alın. Çubuklar, nispeten koyu çekirdeklerin içinde parlak çizgiler veya noktalar olarak birden fazla yönde görünmelidir (Şekil 2A, 2C).</li>
</ol>6. Alternatif görüntüleme deneyleri
<ol><li>Hücreselleşme sırasında plazma zarı oluklarının uçları gibi intranükleer aktin çubuklarının uzunluğu boyunca veya sitoplazmik aktin yapılarında aktin cirosunu araştırmak için FRAP gerçekleştirin.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımında, deneyi elde etmek için oluk uçlarının veya akran çubuklarının etrafında dikdörtgen bir bölge seçin.</li>
	<li>Beyazlatmak için dikdörtgen alım bölgesi içindeki bir aksin çubuğunun merkezinin küçük bir kare bölgesini seçin. Aksin çubuğunun uçlarının görünür olduğundan emin olun ve çekirdeğin içindeki çubuğun doğru bir şekilde izlenmesine izin vermek için deney sırasında ağartılmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Çamaşır suyu lazerini 50x yineleye ve çamaşır suyu lazer gücünü maksimuma ayarlayın.</li>
	<li>Maksimum piksel bekleme hızında toplam 120 sn'ye kadar her saniye görüntü elde etmek için bir zaman kursu seçin ve görüntü alımının ilk iki saniyesi sonra lazeri ağartacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Floresan kurtarmanın devre arasını belirlemek için verileri ölçün1.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos.">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li><li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/cofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion.">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li><li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies.">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li><li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF/cofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function.">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li><li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases.">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li><li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease.">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li><li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+actin-ADF/cofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons.">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li><li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress.">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li><li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells.">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li><li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin.">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li><li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein,+cofilin.">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li><li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods.">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li><li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+development,+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons.">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li><li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus.">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li><li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells.">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li><li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells.">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li><li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage.">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li><li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuf,+a+Rab11+effector,+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization.">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li><li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation.">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li><li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos.">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).</li><li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos.">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).</li><li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila.">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo.">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).</li><li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers.">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).</li><li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology.">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li><li>Mollinari, C., Gonz&#225;lez, A., Cid-Arregui, A., Garc&#237;a-Carranc&#225;, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+and+transgenesis.">Microinjection and transgenesis.</a> Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos.">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).</li><li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li><li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster.">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li><li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing.">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li></ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Bu yöntemin önemi, ASR ve eşlik eden akin çubuk montajı ile ilgili yeni araştırmalara olanak sağlamak için Drosophila embriyoları21,22,23,24,25,26,27'de iyi kurulmuş mikroenjeksiyon protokolünü kullanmasıdır. G-actinRed'i canlı embriyolara enjekte etmenin ...

Bu protokol, indükleyici bir Actin Stres Yanıtı (ASR)1geçiren ısı stresli embriyolarda intranükleer akin çubuklarının montajını görselleştirmek için G-actinRed'in nasıl enjekte edildiğini açıklar. Bu protokolü, embriyolarda morfogenezin bozulmasına ve canlılığın azalmasına yol açan ASR çalışmalarına yardımcı olmak için geliştirdik ve yetişkin insan hücre tiplerinde böbrek yetmezliği2, kas miyopatileri3ve Alzheimer ve Huntington Hastalığı 4 ,5,6,7,8gibi patolojilerle ilişkilidir. Bu ASR, ısı şoku 9 , 10 ,11,oksidatif stres4,6,azaltılmış ATP sentezi12ve anormal Huntingtin veya β-amiloid oligomerizasyon 4 , 5 , 6 ,7,9,13,14,15,16dahil olmak üzere çok sayıda hücresel stres tarafından indüklenmiştir. ASR'nin ayırt edici özelliği, etkilenen hücrelerin sitoplazmasında veya çekirdeğinde anormal aktin çubuklarının montajıdır, bu da aktin etkileşime giren bir proteinin stres kaynaklı hiperaktivasyonu ile tahrik edilir, Cofilin 1,5,6,10. Ne yazık ki, ASR ile ilgili önemli bilgi boşlukları devam etmektedir. Örneğin, akin çubuklarının işlevi bilinmemektedir. Çubukların neden bazı hücre tiplerinin sitoplazmasında, ancak diğerlerinin çekirdeğinde oluştuğunu anlamıyoruz. ASR'nin strese giren hücreler veya embriyolar için koruyucu mu yoksa uyumsuz mu olduğu da açık değildir. Son olarak, Cofilin hiperaktivasyonu veya aktüer çubuk tertibatını temel alan ayrıntılı mekanizmaları hala bilmiyoruz. Bu nedenle, bu protokol, canlı meyve sineği embriyosunun son derece çekişli deneysel sisteminde akin çubuğu oluşumunu ve dinamiklerini görselleştirerek ASR'yi araştırmak için hızlı ve çok yönlü bir test sağlar.
G-actinRed'i canlı Drosophila embriyolarına mikroenja alma protokolü başlangıçta doku oluşturma olayları sırasında normal sitoplazmik aktin yapıların17 dinamiklerini incelemek için geliştirilmiştir. Bu çalışmalarda, G-actinRed enjeksiyonunun sitokinoz veya gastrülasyon dahil olmak üzere embriyodaki erken gelişim süreçlerini olumsuz etkilemediğini bulduk17,18. Daha sonra protokolü değiştirdik, embriyo işleme ve G-actinKırmızı enjeksiyonu, ASR1'dengeçen ısı stresli embriyolarda akin çubuklarının görüntülenmesine izin vermek için uyarladık. Embriyolarda aksini görselleştirmek için G-actinRed enjeksiyonu dışında başka yöntemler de kullanılabilir. Bu yöntemler, Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP ve Moesin-GFP(19'daincelenmiştir) gibi aktivin bağlayıcı proteinlerin etki alanlarına veya aktivin bağlayıcı proteinlerin etki alanlarına etiketlenmiş floresan proteinleri (FPs) ifade etmeye dayanır. Bununla birlikte, bu FP problarını kullanmak dikkatli olmayı gerektirir, çünkü bazı aksin yapılarını stabilize edebilir veya bozabilirler, tüm akin yapılarını eşit olaraketiketlemezler 20ve akin-GFP durumunda, son derece fazla ifade edilir - sadece strese bağlı değil, aynı zamanda aksin konsantrasyonuna bağımlı olan çubuk tertibatının analizi içinsorunludur 1. Bu nedenle, G-actinRed sinek embriyolarında çubuk çalışmaları için tercih edilen probdur ve embriyonun büyüklüğü kolay enjeksiyonunu sağlar.
Bu protokolün iş akışı, Drosophila embriyolarına proteinler, nükleik asitler, ilaçlar ve floresan göstergeler enjekte etmek için kullanılan diğer köklü mikroenjeksiyon tekniklerine benzer21 , 22,23,24,25,26,27. Bununla birlikte, burada G-actinRed'in mikroenjeksiyonunun ardından embriyolar ASR ve intranükleer aksin çubuk tertibatını teşvik etmek için hafif ısı stresine maruz kalırlar. Sineklere erişimi olan laboratuvarlar ve enjeksiyon teçhizatı için, bu yöntem, farklı stresler tarafından indüksiyonu veya farklı genetik geçmişlerde modülasyon da dahil olmak üzere ASR ile ilgili belirli çalışma hatları için kolayca uygulanabilir ve uyarlanabilir olmalıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A23835G</td>
			<td style="width:299px;">Component of G buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Apple juice, Mott&#39;s, 64 fl oz</td>
			<td style="width:195px;">Mott&#39;s</td>
			<td style="width:121px;">014800000344</td>
			<td>Component of apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">214010</td>
			<td>Component of apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:195px;">KIK International</td>
			<td style="width:121px;">059647210020</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C1016500G</td>
			<td>Component of G buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell strainer, 70 &#956;m</td>
			<td style="width:195px;">Falcon</td>
			<td style="width:121px;">352350</td>
			<td>For collecting dechorionated embryos</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">0000001994956</td>
			<td>For imaging intranuclear actin rods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Desiccant</td>
			<td style="width:195px;">Drierite</td>
			<td style="width:121px;">24001</td>
			<td>For desiccating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4350649000000</td>
			<td>For arranging embryos on agar wedge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dissecting needle, 5 in</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">08965A</td>
			<td>For arranging embryos on agar wedge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">BP1725</td>
			<td>Component of G buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in</td>
			<td style="width:195px;">3M</td>
			<td>021200010323</td>
			<td>For making embryo glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Embryo collection cage</td>
			<td style="width:195px;">Genessee Scientific</td>
			<td style="width:121px;">59100</td>
			<td>For housing adult flies and collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">72701D</td>
			<td>For arranging embryos on agar wedge</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm</td>
			<td style="width:195px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW1004</td>
			<td>For microneedles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Halocarbon oil 27</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H8773100ML</td>
			<td>For hydration of embryos</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:223px;">Heated stage incubator</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:223px;">Lab Tissue Wipers, KimWipes</td>
			<td style="width:195px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:121px;">34155</td>
			<td>Lab tissue wipers</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">Discontinued</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methyl-4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H36471KG</td>
			<td>Component of apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microinjector, FemtoJet4x</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td>5253000025</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 &#956;L</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:121px;">5242956003</td>
			<td>For loading microneedles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment</td>
			<td style="width:195px;">Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td>
			<td style="width:121px;">Custom</td>
			<td>For performing microinjections</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:121px;">P97</td>
			<td>For pulling capillary tubes to make microneedles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Microscope cover glass 24x50-1.5</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12544E</td>
			<td>For mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">22037081</td>
			<td>For mounting embryos for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">n-Heptane</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">H3601</td>
			<td>Component of embryo glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Objective, 10x</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">Discontinued</td>
			<td>10x objective for injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4217679971711</td>
			<td>40x water objective for confocal</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4208529871000</td>
			<td>25x mixed immersion objective for confocal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4207829900799</td>
			<td>63x oil objective for confocal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2</td>
			<td style="width:195px;">Daler-Rowney</td>
			<td style="width:121px;">038372016954</td>
			<td>For transferring embryos</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white</td>
			<td style="width:195px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:121px;">884266344845</td>
			<td>For blotting cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pasteur pipette, 5 3/4 in</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1367820A</td>
			<td>For covering embryos with oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Petri dish, glass, 100 x 20 mm</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">3160102</td>
			<td>For humid incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Petri dish, plastic, 60 x 15 mm</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">25384092</td>
			<td>For apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 &#956;L</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:121px;">2231000604</td>
			<td>For loading the microneedle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pipette tip, xTIP4 250 &#956;L</td>
			<td style="width:195px;">Biotix</td>
			<td style="width:121px;">63300006</td>
			<td>For adding embryo glue to coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Razor blade</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">55411050</td>
			<td>For cutting agar wedge, tape, pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 &#956;g)</td>
			<td style="width:195px;">Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">APHR-A</td>
			<td>G-actin^Red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">033377</td>
			<td>For making embryo glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Screw top jar, 16 oz</td>
			<td style="width:195px;">Nalgene</td>
			<td style="width:121px;">000194414195</td>
			<td>For desiccating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Stage micrometer</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">602104PG</td>
			<td>For calibrating volume of G-actin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sucrose</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">840971KG</td>
			<td>Component of apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trizma base</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T15031KG</td>
			<td>Component of G buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz</td>
			<td style="width:195px;">Lesaffre Yeast Corporation</td>
			<td style="width:121px;">117929157002</td>
			<td>Component of yeast paste</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos

Bu protokolün amacı, ısı stresinden sonra canlı Drosophila melanogaster embriyolarında bir araya gelen intranükleer akin çubuklarını görselleştirmektir. Aktiin çubukları, nörodejeneratif hastalık da dahil olmak üzere insan patolojilerine eşlik eden korunmuş, indüklenen Bir Aktün Stres Yanıtı'nın (ASR) ayırt edici özelliğidir. Daha önce, ASR'nin morfogenez başarısızlıklarına ve gelişmekte olan embriyoların canlılığının azalmasına katkıda bulunduğunu gösterdik. Bu protokol, görüntüleme, genetik ve biyokimyaya son derece uygun bir model sisteminde aktin çubuk montajının ve ASR'nin altında bulunan mekanizmaların sürekli incelenmesini sağlar. Embriyolar toplanır ve enjeksiyona hazırlamak için bir kapak kapağına monte edilir. Rhodamine konjuge globüler aktilin (G-actinRed)seyreltilir ve bir mikroneedle yüklenir. Her embriyonun ortasına tek bir enjeksiyon yapılır. Enjeksiyondan sonra embriyolar yüksek sıcaklıkta inkübe edilir ve intranükleer aksin çubukları daha sonra konfokal mikroskopi ile görselleştirilir. Aktüer çubuklarında fotobleaching (FRAP) deneyleri yapıldıktan sonra floresan iyileşmesi yapılabilir; ve sitoplazmdaki diğer aktin bakımından zengin yapılar da görüntülenebilir. G-actinRed'in endojen G-actin gibi polimerize olduğunu ve kendi başına normal embriyo gelişimine müdahale etmediğini görüyoruz. Bu protokolün bir sınırlaması, embriyonun ciddi yaralanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında dikkatli olunması gerektiğidir. Bununla birlikte, pratikte, G-actinRed'i Drosophila embriyolarına enjekte etmek, aktivin çubuklarını görselleştirmenin hızlı ve güvenilir bir yoludur ve herhangi bir genotip sinekle veya hipoksi ve oksidatif stres de dahil olmak üzere diğer hücresel streslerin girmesiyle kolayca kullanılabilir.

Şekil 1'deembriyo işlemenin şematik iş akışı gösterilmiş ve Tablo 1'detipik bir deney için bir zaman çizelgesi sunulmuştur. İyi bir deneysel sonuç için bir tahmin, enjekte edilen her 10 embriyo için, görüntülenen embriyoların en az yarısının doğru gelişim aşamasında olacağı, hasarsız olacağı ve 32 ° C'de ısı stresi olan sağlam bir ASR sergileyeceğidir. Bu ASR, Şekil 2A'da (sağ panel) bir embriyonun temsili...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos at JoVE.com

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

3.4K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.

Video: Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Drosophila'da Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Yazar Spotlight: Drosophila Embriyolarında Epitel Gerginliğinin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...