Manuela Weitkunat film S3 edinimi için teşekkür ederiz. Cömert desteği Reinhard Fässler için sana şükrediyoruz. Bu eser tarafından EMBO Young araştırmacı programı (F.S.), Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP/2007-2013) altında desteklenen / ERC Grant 310939 (F.S.), Max Planck toplum (S.B.L., F.S.), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), mükemmellik girişimi Aix-Marseille Üniversitesi AMIDEX (F.S.) LabEX BİLGİLENDİRMEK (F.S.) ve Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

1. sahne pupa
<ol><li>Bir haç ile 20-40 bakire kadın ve şişe başına yaklaşık 20 erkek sinek gıda (şekil 1A) ayarlayın. Alternatif olarak, her hisse senedi hisse senetleri kullanılacaksa yeni şişe ters çevirin. Yeterli pupa elde etmek için iki şişe başına genotip kurmaya çalışın.</li>
	<li>25 ° C (ya da deneysel tasarım göre 27 ° C) şişe (şekil 1B) 5-6 gündür kuluçkaya. Not: sinekler her iki veya üç gün aşırı kalabalık önüne geçmek ve pupa sürekli bir tedarik sağlamak için flipping tutmak.</li>
	<li>Beyaz prepupae şişeleri duvarlarından toplamak ve cam slaytlara (şekil 1 c) aktarmak için ıslak bir fırça kullanın. Pupa istediğiniz ulaşmak böyle hazırlama zaman yaş mikroskop altında Imaging canlı başlatma sırasında. Not: Bu prepupae onların şekil açısından büyük pupa gibi görünebilir ama onlar hala larvaları gibi beyaz. Prepupal sahne başlangıcı 0 h puparium oluşumu (0 h APF) sonra tanımlanır.</li>
	<li>Sinek gıda pupa için ıslak bir fırça ile yapışmasını kümeleri kaldırmak ve bir stereomicroscope (şekil 1 d) kullanarak cam slayt doğru pupa ventral tarafına gelecek şekilde yönlendirin. Bu hala hareket ediyor (çok küçük) veya kahverengi açmak başlamıştır pupa atmak (çok eski). Bu tüm pupa aynı yaşta (0 - 1 h APF) elde etmenizi sağlar.</li>
	<li>Slaytlar genotip, Tarih ve saat koleksiyonu ile etiketleyin. Cam slaytlar bir petri kabına için her aktarım ve pupa (şekil 1E) kurumasını önlemek için ıslak mendil ekleyin.</li>
	<li>İstenilen yaş gelinceye pupa bir kuluçka 25 ° C veya 27 ° C saklayın. Böylece pupa istenen görüntüleme önce 1 saat sonraki adımlarla devam yaş canlı görüntüleme (Adım 3), örneğin, 13 h APF şekil 2A-Diçinde gösterilen film için başlatma sırasında. Not: En erken uygun başlangıç zaman baş-eversiyon 8-10 h APF 27 ° C'de meydana gelen pupa, sonra noktasıdır</li>
</ol>2. pupa görüntüleme için hazırlayın
<ol><li>Sadece onlar doğal olarak kalan sinek gıda yüzünden şişeleri duvarlara sopa gibi pupa şimdi cam kaymak için sopa olun. Hiçbir ekstra yapıştırıcı gereklidir. Pupa yeterince yüksek nem nedeniyle sopa değil, petri kabına koyup kuruyuncaya kadar bırakın için birkaç dakika için açın. Alternatif olarak, onları bir cam slayt üzerinde çift taraflı bant aktarım, ama genellikle, bu gerekli değildir.</li>
	<li>
Açık pencere için düşsel dolaylı uçuş kaslarının pupa durumda (1F rakam; Bölüm 2,3 için karın kasları düşsel atlayın.)<ol>
<li>Araştırmacı bir stereomicroscope altında mesafede ön bakan ile cam slayt yapışmasını pupa gelecek şekilde yönlendirin. 2 X zoom ayarlayın.</li>
		<li>Biyoloji bir ucunu kullanarak #5 forseps, yavaşça sınıf bittiği yerde karın kanat dorsal pupa durumda içine bir delik poke ve toraks başlar.</li>
		<li>Pupa durumda açık dilim için hafifçe Toraks ve kanat boyunca anterior sonuna forseps hareket ama savunmasız kanat doku zarar vermemek. Not: Eğer sıvısının pupa akması, hasar gördü; Bu atın ve yeniden farklı bir pupa ile başlamak.</li>
		<li>Forseps ile yukarıda toraks pupa durum bölümünü kaldırın ve sonra bu bölüm dorsal orta hat karşı tarafta ince, keskin makasla kesilmiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Karın kasları görüntüleme için pupa durumda açık pencere (Şekil 1G)<ol>
<li>Araştırmacı bir stereomicroscope altında doğru ön bakan ile cam slayt yapışmasını pupa gelecek şekilde yönlendirin. 2 X zoom ayarlayın.</li>
		<li>Biyoloji bir ucunu kullanarak #5 forseps, yavaşça sınıf bittiği yerde Toraks kanat dorsal pupa durumda içine bir delik poke ve karın başlar.</li>
		<li>Pupa durumda açık dilim için hafifçe forseps karın arka sonuna doğru hareket ettirin. Not: Eğer sıvısının pupa akması, hasar gördü; Bu atın ve yeniden farklı bir pupa ile başlamak.</li>
		<li>Forseps ile karın üzerinde pupa durum bölümünü kaldırın ve sonra bu bölüm dorsal orta hat karşı tarafta ince, keskin makasla kesilmiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mount pupa (Şekil 1 H)<ol>
<li>Islak bir fırça ile bir oluk (özel olarak oluşturulmuş, yeniden kullanılabilir, bkz: tartışma ve malzeme listesi) plastik bir slayt için en çok beş pupa aktarmak için kullanın. Her tarafı oluk derinliği ve pupa kalınlığına bağlı olarak bir veya iki boşluk ekleyici coverslips ekleyin. Küçük bir damla su altında slayt için sopa ve oluk ve spacer coverslips arasında her iki tarafta biraz boşluk bırakın yapmak her yer açıcı coverslip koymak. Not: Çıta coverslips da kalıcı olarak süper yapıştırıcı, içeren önceden iliştirilebilir.</li>
		<li>Öyle ki pupa durumda açılış yukarıya doğru fırça kullanarak yüzleri pupa gelecek şekilde yönlendirin. İyi görüntü kalitesi için doğru açıyla pupa konumlandırma dikkatli olun. Açı her doku ve gelişim süresi noktası için en iyi duruma getirme. Not: Oluk su küçük bir miktar pupa daha kolay konumlandırma yapar. Daha sonra boğulma önlemek için fırça ile aşırı su tahliye.</li>
		<li>Pupa yukarıda bir coverslip (18 x 18 mm) onlara dokunmadan tutun. % 50 gliserol çözüm 20 µL pipet kullanarak coverslip açılış pupa her durumda yukarıda küçük damlacıklar (yaklaşık 0.5 µL) yerleştirin. Not: Bu yordam damlacıkları pupa olarak aynı aralığı elde etmenizi sağlar.</li>
		<li>Coverslip ters çevirin ve pupa el ya da pupa yanında yer açıcı coverslips üzerinde coverslip bir tarafı istirahat ederken forseps (standart #5) kullanarak üzerinde konumlandırın. Sonra yavaşça coverslip pupa üzerine bırakın. Pupa büyük açıklıklar ile % 50 gliserol iyi görüntü kalitesi için ve pupa kurumasını önlemek için düzgün kaplıdır emin olun.</li>
		<li>Yapışkan bant parçası üzerinde bir ucunu katlayın ve forseps (standart #5) o sonunda ile yakala. Öyle ki en iyi coverslip, pul coverslip(s) ve bir tarafta plastik slayt bir kenarına kapsar yavaşça kaset yerleştirin. Teyp henüz bastırmayın. İlk olarak, slayt arkanı dön ve diğer taraf için tekrarlayın.</li>
		<li>Her iki işaret parmakları bant aynı anda her iki tarafta basın için kullanın. Bu yordam pupa değil yerlerinden sağlar.</li>
		<li>Pupa coverslip de temas halinde olup olmadığını kontrol edin. En iyi görüntü kalitesi için pupa yavaşça coverslip altında sıkışmış. Çıta coverslips sayısını ayarlayın.</li>
		<li>Yapışkan bant üzerindeki yazarak Slayt etiket.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. canlı pupa görüntüleme
<ol><li>Montaj yöntemi pupa görüntüleme ters mikroskoplar (1I rakam) ve dik mikroskoplar (şekil 1J) sağlar. Özellikle çoğu canlı görüntüleme tarama için confocal mikroskoplar, İki fotonlu mikroskoplar ve ne olursa olsun ister onlar ters dönen disk confocal mikroskoplar uygundur veya dik. Uzun vadeli filmler için bir ısı kontrollü sahne varsa kullanır.</li>
	<li>Göz ve bir UV lamba veya iletim ışık kullanarak bir pupa ve odak içinde pupa bulun.</li>
	<li>Kamera kullanarak, istenen yapı bulmak ve yakınlaştırma düzeyini ayarlayın.</li>
	<li>Uzun vadeli Filmler, faiz de (örneğin, dolaylı uçuş kasları, onların ek siteler, tendon hücreleri veya bir arada söz konusu) yapısını kapsayan bir z-yığın tanımlamak ve bir zaman aralığı seçin. Daha iyi görüntü kalitesi için ortalama yaptığını düşünün. Yüksek hızlı, kısa vadeli filmler için yüksek kare hızı elde etmek için tek bir z uçağı seçin.</li>
	<li>Lazer güç vermek en iyi olası sinyal ama küçük doygunluk ayarlayın. Ancak, çok yüksek lazer gücü zaman içinde pupa zarar verebilir.</li>
	<li>Görüntüleme başlatın ve zaman zaman filmin denetlemek ve gerekirse z-yığın konumlandırma yeniden düzenlemek için dönün.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı Drosophila pupa kas-tendon morfogenez, canlı görüntüleme için. Ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı bkz:. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).</li><li>Venken, K. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> eLife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+signaling+induces+nautilus+expression+in+the+ventral+mesoderm+of+the+Drosophila+embryo.">Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).</li><li>Roy, S., Raghavan, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeotic+genes+and+the+regulation+of+myoblast+migration,+fusion,+and+fibre-specific+gene+expression+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila.</a> Development. 124 (17), 3333-3341 (1997).</li><li>Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirements+for+Myocyte+Enhancer+Factor-2+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila.</a> Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).</li><li>Gordon, S., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+calcium+in+the+regulation+of+mechanical+power+in+insect+flight.">Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).</li><li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Screens+for+In+Vivo+Tinman+Binding+Sites+Identify+Cardiac+Enhancers+with+Diverse+Functional+Architectures.">Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).</li><li>Chen, E. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisocial,+an+intracellular+adaptor+protein,+is+required+for+myoblast+fusion+in+Drosophila.">Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila.</a> Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).</li><li>Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Tagging+Drosophila+Proteins+at+Their+Native+Genomic+Loci+With+Small+P+Elements.">Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements.</a> Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).</li><li>Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Sch&#246;ck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alp/Enigma+Family+Proteins+Cooperate+in+Z-Disc+Formation+and+Myofibril+Assembly.">Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).</li><li>Klapholz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+for+talin+to+mediate+integrin+function.">Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function.</a> Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).</li><li>Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+protein+Kon-tiki+couples+to+Dgrip+to+mediate+myotube+targeting+in+Drosophila.">The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila.</a> Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).</li><li>Menon, S. D., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+rolling+pebbles:+a+multidomain+protein+required+for+myoblast+fusion+that+recruits+D-Titin+in+response+to+the+myoblast+attractant+Dumbfounded.">Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded.</a> Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).</li><li>Bloor, J. W., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=zipper+Nonmuscle+myosin-II+functions+downstream+of+PS2+integrin+in+Drosophila+myogenesis+and+is+necessary+for+myofibril+formation.">zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation.</a> Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).</li><li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135 (4), 621-626 (2008).</li><li>Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood+brain+barrier+is+maintained+by+GPCR-dependent+dynamic+actin+structures.">The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures.</a> J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Analysis+with+a+Repressible+Cell+Marker+for+Studies+of+Gene+Function+in+Neuronal+Morphogenesis.">Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>F&#246;rster, D., Luschnig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src42A-dependent+polarized+cell+shape+changes+mediate+epithelial+tube+elongation+in+Drosophila.">Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila.</a> Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).</li><li>Weitkunat, M., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+study+Drosophila+muscle+biology.">A guide to study Drosophila muscle biology.</a> Methods. 68 (1), 2-14 (2014).</li><li>Weitkunat, M., Kaya-&#199;opur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+and+force-resistant+attachment+are+essential+for+myofibrillogenesis+in+Drosophila+flight+muscle.">Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle.</a> Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).</li><li>Guirao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+quantitative+characterization+of+epithelial+tissue+development.">Unified quantitative characterization of epithelial tissue development.</a> eLife. 4, e08519 (2015).</li><li>Etournay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+and+spontaneous+muscle+twitching+precede+the+formation+of+cross-striated+muscle+in+vivo.">Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo.</a> Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).</li><li>Sellin, J., Albrecht, S., K&#246;lsch, V., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+heart+differentiation,+visualized+utilizing+heart+enhancer+elements+of+the+Drosophila+melanogaster+bHLH+transcription+factor+Hand.">Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand.</a> Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).</li><li>Lemke, S. B., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+during+muscle+development.">Mechanical forces during muscle development.</a> Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).</li><li>Classen, A. -. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+of+Drosophila+with+the+CRISPR+RNA-guided+Cas9+nuclease.">Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease.</a> Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).</li><li>Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+two-step+CRISPR-+and+RMCE-based+strategy+for+efficient+genome+engineering+in+Drosophila.">A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila.</a> G3. 4 (12), 2409-2418 (2014).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan Protokolü kas-tendon morfogenez yaşayan görüntü açıklar Drosophila pupa fluorescently tagged proteinler çeşitli kullanarak. Bu strateji Imaging vivo içinde gelişimsel süreçleri tüm organizmanın doğal ortamda eğitim için kullanılabilir.
Bu analiz etmek için doğru gelişim süresi noktası bulmak başarılı bir deneme için çok önemlidir. Örneğin, karın kasları daha sonra geliştirirken ve sadece 30 ve 40 h APF26arasında her iki ucundaki eklemek dorsolongitudinal dolaylı uçuş kasları tendon hedeflerine ≈16 h APF23 eki başlatın. Sonuç olarak, önceden yayınlanmış edebiyat geliştirme analiz etmek için doğru zaman noktaları bulmak için kullanılması gereken veya doku veya faiz yapısını ayrıntılı önce araştırılmamıştır, genel geliştirme ilk karakterize edilebilir vardır.
Özel olarak oluşturulmuş plastik slaytlarda başarıyla montaj pupa için bu oluklar uygun boyutlara sahip önemlidir: 1.0-1.5 mm geniş ve 0.3 - oluklar gerek 0.4 mm derin. Bu derinliği ile gerektiği gibi yer açıcı coverslips üst coverslip kesin Uzaklik ayarlama sağlar. Ancak, en az bir boşluk ekleyici coverslip % 50 gliserol örnek uzak boşaltma önlemek için kılcal kuvvetler tarafından kullanılmalıdır. Oluk içinde pupa doğru konumlandırma bazı deneyim ve faiz yapısı coverslip için mümkün olduğu kadar yakın olacak optimize edilmelidir gerektirir.
Pupa, çok sayıda bir mikroskop oturumda yansıması gerekiyordu eğer onlar tüm önceden monte edilebilir ve daha sonra bir kuluçka makinesine uygun gelişim zamanlaması sağlamak için Imaging kadar saklı. Pupa yordamın tamamını hayatta kalmak ve ayrıca en az eclose için slayt üzerinde görüntüleme sonra devam deneyin. Sağkalım oranı bir okuma görüntüleme koşulları pupa zarar olup olmadığını kontrol etmek için kullanılabilir.
Görüntüleme ayarları dikkatle deneysel gereksinimlerine göre seçilmelidir. Kısa süreli filmler için yüksek kare hızı yüksek sinyal gürültü oranı karşı dengeli olabilir nispeten yüksek lazer güç-ebilmek var olmak kullanılmış pupa çok fazla zarar vermeden süre gerekiyor. Ancak, uzun vadeli Filmler, lazer gücü makul ses seviyelerinde tutulmalıdır ve pupa sürekli ziyade belli zaman noktalarda, örneğin, her 20 dk yansıması değil. Faiz yapısını görüş alanı dışında hareket etmez emin olmak için z-yığın zaman puan arasında konumlandırılması yeniden düzenlemek gerekli olabilir. Bilgimizi, Pupa dava açılması gelişimsel zamanlama başına etkilemez. Ancak, ısı kontrollü bir sahne uzun vadeli filmler için uygun gelişim zamanlaması sağlamak için kullanılmalıdır. Bu noktalar göz önünde tutulduğunda, son derece bilgilendirici Filmler elde edilebilir.
Sunulan protokolü hem de diğer gelişmekte olan dokular, örneğin, kanat epitel29kas-tendon morfogenez görselleştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü yalnızca üç değişiklikler gereklidir: (1) yerine göğüs veya karın kanat yukarıda pupa davanın açılması, (2) pupa en iyi coverslip ve (3) doğru kanat ile farklı floresan marker proteinler kullanımı konumlandırma. Drosophila30,31 yılında endojen loci hedeflemek daha basit hale gelmiştir çünkü CRISPR/Cas9-teknoloji ilerlemesi ile daha fazla endogenously tagged floresan proteinler, kullanılabilir , 32. gelecekte, bu çok sayıda proteinler, hücre ve fizyolojik çevreleri ayrıntılı olarak tüm dokularda dinamikleri elucidating izin verir.

Kas-tendon aparatı insanlar kendi vücut parçaları taşımak için de dahil olmak üzere hayvan sağlar. Moleküler yapı taşları olan kas-tendon sistemi son derece korunmuş. Bu nedenle, kas-tendon geliştirme için insan kas biyoloji, örneğin kas morfogenez, kas-tendon eki ve myofibril kendi kendine organizasyon, ilgili kavramları Drosophila melanogaster bir kolayca erişilebilir kullanarak okudu modeli sistemi. Drosophila pupa sistem çeşitli deneysel avantajları vardır. Ne zaman yetişkin kasları oluşur-ilk olarak, Pupa-organizma sesil ve bu nedenle basit-e doğru mikroskop üzerinde bir süre içinde saatler ya da günler görüntü aşamasındadır. İkinci olarak, birçok kasları formu kapatmak yeterli pupa yüzey altında böylece sağlam, kısmen saydam organizma içinde yansıma. Üçüncü olarak, kasları nerede tendon hücreleri ile şekillendirme exoskeleton bağlı oldukları ve doku gerilim inşa kendi doğal ortamlarında soruşturma olmaktır. Bu kas hücre kültürü sistemlerinde mümkün değildir. Ve son olarak, genetik araçları bir bolluk Drosophilaiçinde kullanılabilir. Bunlar arasında belirli hücre tipleri veya vivo içindegörüntüleme için hücre altı yapıları etiketlerine göre izin birçok fluorescently etiketli işaretleri.
Tablo 1 kas-tendon morfogenez çalışmak için kullanılan en önemli işaretleri özetler. 1 GAL4 UAS sistemi kullanarak overexpressed işaretleri içerir ve protein işaretleri2,3,4endogenously etiketli. GAL4 UAS sistemin avantajı işaretleri genellikle kolayca bütün Dağı pupa görüntüsü güçlü bir sinyal sonuçlanan yüksek düzeyde ifade olmasıdır. Buna ek olarak, doku özgüllük GAL4 sürücüleri dikkatle seçerek elde edilebilir. Füzyon proteinlerin endojen kontrol altında okudu vivo içindeilgili proteinler dinamikleri olabilir iken onlar da işaretleri farklı hücre tipleri veya belirli hücre altı yapıları için kullanılabilir örneğin avantajdır, βps Integrin GFP kas ek siteler için. Birlikte, bu işaretleri deneysel tasarım ve şimdi ve gelecekte çözülebilir araştırma sorunları çeşitli yüksek esneklik sağlar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Etiketli yapısı</td>
			<td colspan="2">Marker</td>
			<td colspan="2">İfade ve yerelleştirme</td>
			<td colspan="2">Sınıf</td>
			<td colspan="2">Stok numarası</td>
			<td colspan="2">Yorum</td>
			<td>Ref.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">Kas</td>
			<td colspan="2">
Mef2-GAL4</td>
			<td colspan="2">Tüm myoblasts ve tüm aşamalarında tüm kasları</td>
			<td colspan="2">GAL4 hattı</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">Yetişkin kas öncüleri ve ≈24 h APF kadar erken myotubes</td>
			<td colspan="2">GAL4 satır, artırıcı tuzak</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">kas farklılaşma üzerine atlamak</td>
			<td colspan="2">GAL4 hattı</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları</td>
			<td colspan="2">GAL4 hattı</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F- Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları</td>
			<td colspan="2">Act88F artırıcı / organizatörü sürüş Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">CA2 + göstergesi</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F-GFP</td>
			<td colspan="2">≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları</td>
			<td colspan="2">GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat)</td>
			<td colspan="2">fTRG78 ve fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Onu- nls GFP</td>
			<td colspan="2">Yetişkin kas öncüleri, nükleer, ≈24 h APF dolaylı uçuş kaslarda kadar</td>
			<td colspan="2">artırıcı/organizatörü nls-GFP reporter ile</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">1,5 kb artırıcı parçası</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
MHC-Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">mikrotübüller DLM şablonlar ve kasları ayırt</td>
			<td colspan="2">artırıcı/organizatörü Tau-GFP reporter ile</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D-GFP</td>
			<td colspan="2">mikrotübüller (örneğin kaslarda dolaylı uçuş ≈14 h AFP, güçlü ≈48 h APF sonra azalan) myotubes içinde</td>
			<td colspan="2">GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MHC-GFP (weeP26)</td>
			<td colspan="2">sarcomeres (kalın filaman) tüm vücut kasları (kaslarda ≈30 h APF başlayan örneğin dolaylı uçuş)</td>
			<td colspan="2">GFP-tuzak</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">heterozigoz kullanın, bir izoformu alt etiketleri</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SLS GFP</td>
			<td colspan="2">sarcomeres (Z-disk) tüm vücut kasları (kaslarda ≈30 h APF başlayan örneğin dolaylı uçuş)</td>
			<td colspan="2">GFP-tuzak (sinekkapanı hat)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53, heterozigoz kullanımı</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disk tüm vücut kasları</td>
			<td colspan="2">GFP-tuzak (sinekkapanı hat)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disk tüm vücut kasları</td>
			<td colspan="2">GFP-tuzak (sinekkapanı hat)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HTS-GFP</td>
			<td colspan="2">aktin bağlama; epitel, myoblasts ve myotubes ifade</td>
			<td colspan="2">GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1-GFP</td>
			<td colspan="2">epitel hücre kavşaklar, myoblasts ve tüm aşamalarında kaslarda membranlar</td>
			<td colspan="2">GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">Kas ek site</td>
			<td colspan="2">βps-Integrin-GFP</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda)</td>
			<td colspan="2">GFP knock</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin GFP ve - mCherry</td>
			<td colspan="2">kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda)</td>
			<td colspan="2">GFP-tuzak (taklit satır)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin GFP</td>
			<td colspan="2">kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda)</td>
			<td colspan="2">GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">İlk-GFP</td>
			<td colspan="2">kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda)</td>
			<td colspan="2">GFP-tuzak (sinekkapanı hat)</td>
			<td colspan="2">Kyoto 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111, ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vinc-GFP ve - RFP</td>
			<td colspan="2">kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda)</td>
			<td colspan="2">GFP-füzyon (transgene)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tendon</td>
			<td colspan="2">
SR-GAL4</td>
			<td colspan="2">pupa aşaması boyunca Toraks tendon hücreleri</td>
			<td colspan="2">GAL4 satır, artırıcı tuzak</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">homozigoz öldürücü</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Kas ve Tendon</td>
			<td colspan="2">
Duf-GAL4</td>
			<td colspan="2">kas ve epiteli, erken başlangıçlı</td>
			<td colspan="2">GAL4 hattı</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">kirre-rP298, kurucusu hücre işaretçisi</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">UAS-muhabirler</td>
			<td colspan="2">
UAS- GFP-Gma</td>
			<td colspan="2">aktin bağlama</td>
			<td colspan="2">UAS hattı</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">aktin bağlayıcı etki Moesin, GFP için erimiş</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- mCherry-Gma</td>
			<td colspan="2">aktin bağlama</td>
			<td colspan="2">UAS hattı</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">MCherry için erimiş Gma</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-GFP</td>
			<td colspan="2">aktin bağlama</td>
			<td colspan="2">UAS hattı</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-Ruby</td>
			<td colspan="2">aktin bağlama</td>
			<td colspan="2">UAS hattı</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-GFP</td>
			<td colspan="2">membran bağlama</td>
			<td colspan="2">UAS hattı</td>
			<td colspan="2">çeşitli hisse senetleri, örneğin: BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-mCherry</td>
			<td colspan="2">membran bağlama</td>
			<td colspan="2">UAS hattı</td>
			<td colspan="2">BL 27391 ve 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-palm-mCherry</td>
			<td colspan="2">membran bağlama aracılığıyla palmitoylation</td>
			<td colspan="2">UAS hattı</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
UAS- brainbow</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Fluorescently protein işaretleri kas-tendon morfogenez vivo içindeçalışmak için uygun ekledi.
Burada, kolayca ve başarılı bir şekilde yaşayan pupa kas-tendon morfogenez görüntüleme nasıl yapılabilir biz ayrıntılı olarak tarif (şekil 1). Alternatif olarak, Pupa sabit olabilir, disseke ve aynı zamanda proteinler işaretleri Hayır canlı için etiketlemek için antikorlar kullanarak sağlar immunostained çoğu kullanılabilir22. Bu durumda, hiçbir hareket ve faiz yapısı coverslip yakın yerleştirildiğinden genellikle daha yüksek görüntü kalitesi. Ancak, diseksiyon ve fiksasyon hasar ve moleküler açabilir veya doku dinamikleri, örneğin, kas seğirmesi, sadece canlı organizma okudu olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>product has been replaced by Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fly food in bottles (or vials)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>standard culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paint brush</td>
			<td>da Vinci</td>
			<td>1526Y</td>
			<td>size 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VWR: 631-1303</td>
			<td>76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape (optional)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6651263</td>
			<td>12 mm x 6.3 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632102</td>
			<td>94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper tissues</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7695251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td>straight tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic slides with a groove (reusable)</td>
			<td>custom-built</td>
			<td>-</td>
			<td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107032</td>
			<td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49781</td>
			<td>dilute to 50 % in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adhesive tape</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>57370-02</td>
			<td>1.5 mm x 10 m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

Tendon ve iskelet kasları hayvanlar insanlar kendi vücut parçaları taşımak için de dahil olmak üzere etkinleştirin. Kas morfogenez hayvanlardan insanlara son derece korunmuş. Bu nedenle, güçlü Drosophila modeli sistemi de insan kas Biyoloji için uygulanabilir kas-tendon geliştirme kavramlarını incelemek için kullanılabilir. Burada, biz ayrıntılı olarak nasıl morfogenez yetişkin kas-tendon sistemi kolayca yaşarken, yansıma Drosophila pupa geliştirme tarif. Bu nedenle, yöntemi proteinler, hücre ve fizyolojik çevre dokularda inceleyen sağlar. Yararlı ipuçları ile adım adım protokolüne ek olarak, biz kas-tendon sistemi eğitimi için uygundur fluorescently tagged marker proteinlerin kapsamlı bir genel bakış sağlar. Çok yönlü uygulamalar Protokolü'nün vurgulamak için biz uzun vadeli morfogenetik olayların görselleştirme arasında değişen-saat ve gün-kas seğirmesi gibi kısa süreli dinamik süreçler görselleştirme için zaman ölçeği üstünde meydana gelen örnek Filmler göstermek saniye zaman ölçeğinde meydana gelen. Birlikte ele alındığında, bu iletişim kuralını tasarlayın ve kas-tendon morfogenez olduğu gibi canlı soruşturma için canlı görüntüleme deneyler yapmak için okuyucu etkinleştirmeniz gerekir.

Çeşitli dokularda sinek pupa, yapım onları morfogenez yetişkin organlarının çalışma için bir ideal modeli sistem geliştirme görüntülü vivo içinde olabilir. Bunlar arasında dolaylı uçuş kas, tendon hücreleri de dahil olmak üzere göğüs epitel, kanat epitel, karın kasları ve kalp22,23,24,25,26 . , 27. biz kas ve tendon morfogenez canlı görüntüleme üzerinde odaklanabilir. Dolaylı uçuş kas ve karın kas morfogenez, Drosophilakas biyoloji okuyan için ek yöntemler ayrıntılı açıklaması için okuyucu Weitkunat ve Schnorrer 201422' ye bakın.
Dolaylı uçuş kaslarının Imaging yaşamak
Eğitim için uzun vadeli kalkınma dorsolongitudinal kas (DLMs) ve dorsoventral kas (DVMs), küresel Moesin aktin-bağlayıcı etki öğesini GFP (UAS -GFP-Gma) ile oluşan dolaylı uçuş kaslarının toplamda ifade edildi Myocyte artırıcı faktör 2 (Mef2)kullanılarak kas-GAL4 sürücü (şekil 2A-D, Film S1). Görüntüleme önce şekil 1Fiçinde gösterildiği gibi Toraks pupa durumda bir pencerede açıldı. İki fotonlu mikroskop, z-yığınlar her 20 dk ≈11 s puparium oluşumu (11 h APF) sonra başlayan 21 h için satın alınan. Bu süre içinde DLMs (yeşil şekil 2Abindirmeleri'-D') ilk eki tendon hücrelere (şekil 2A) başlatmak ve kas ekleri (şekil 2B) olgun süre sonra böl. Ardından, son olarak 30 h APF (şekil 2B) sonuna kadar sıkıştırılmış aşamada ulaşana kadar myotubes (şekil 2C) kısaltın. Birlikte ele alındığında, bu film saat zaman ölçeği üzerinde oluşan kas Morfoloji dramatik değişiklikleri vurgular.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> Şekil 2: dolaylı uçuş kas ve tendon morfogenez görüntüleme yaşamak. (A-D) Zaman Mef2kullanarak iki fotonlu Film (film S1) puan-GAL4, UAS- GFP-Gma aktin dorsolongitudinal kasları oluşan dolaylı uçuş kasları için bir işaretleyici olarak (a yeşil vurgulanan DLMs,'-D') ve dorsoventral kasları ( DVMs, mavi a vurgulanmış '-D'). Ölçek çubukları 100 µm. (E-H) zaman nokta Dufkullanarak iki fotonlu Film (film S2) vardır-GAL4UAS-CD8-GFP dolaylı uçuş kas ve tendon hücreleri de dahil olmak üzere göğüs epitel avans olarak. Panelleri E'-H' uzun hücresel uzantıları vurgulayarak kasları (yeşil) ile temas tendon epitel (macenta) tarafından kurulan her zaman noktada bir bindirme bir kas-tendon sistemi modeli ile göstermek. Ölçek barlar 100 µm (Görüntülü yapıları boyutundan tahmini) vardır. (I-L) Puan zaman kas-tendon ek başlatma üzerinde odaklanan bir filmden iki renkli, iplik disk confocal (film S3). Tendon hücreleri srile etiketlenir-GAL4UAS-palm-mCherry (macenta) ve dolaylı dorsolongitudinal uçuş kasları Mhc -Tau-GFP (yeşil) ile. Ölçek çubukları nelerdir 10 µm. zaman belirtilir SS: DD puparium oluşumu (APF) sonra. Tüm filmler ısı kontrollü bir sahnede satın alınan, bu nedenle, gelişimsel zamanlama sapmak dikkat edin. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tendon ve kas morfogenez aynı anda çalışmak için membran bağlı GFP (UAS -CD8-GFP) kullanarak ifade edildi Dumbfounded (Duf)-GAL4 tendon hücreleri ve dolaylı uçuş kasları (şekil 2E hem de ifade edilir bir sürücü olarak -S, film S2). Bir z-yığın üzerinde iki fotonlu mikroskop her 20 dk 16 h APF 20 h için başlayan çekildi. Myotubes kompakt iken ( şekil 2Eyeşil kaplaması'-H'), tendon zamanla uzamış formu uzun hücresel uzantıları hücreleri ( şekil 2Emacenta kaplaması'-H'). Birlikte ele alındığında, bu film tendon ve kas hücreleri içinde vivoarasında yakın Interplay vurgulamaktadır.
Kas-tendon etkileşim daha ayrıntılı araştırmak için iki renkli, yüksek büyütme görüntüleme gerçekleştirildi. Pupa myosin ağır zincir (Mhc)ile-Tau-GFP DLMs ve UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -palm-mCherry) tarafından tahrik Şerit (sr)-GAL4 tendonlar içinde her 5 dk 12 h APF bir iplik disk üzerinde 4.5 h için başlayan görüntüsü confocal mikroskop (şekil 2I-L, film S3). APF 12 h myotubes karşı onların tendon hedef hücreleri uzun filopodia onların İpuçları (şekil 2I) şekillendirme sırasında geçirilir. Daha sonra kas ve tendon dokuları interdigitate (istikrarlı bir eki oluşturmak içinşekil 2J, K). Eki geliştikçe daha az filopodia formu ve kas-tendon arabirimi (Şekil 2 L) smoothens. Böylece, iki renkli, yüksek büyütme görüntüleme ayrıntılı canlı organizma olarak hücre dinamiği ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Karın kaslarının Imaging yaşamak
(Şekil 3film S4), karın kaslarının canlı görüntüleme için Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP bir işareti olarak kullanıldı ve karın içinde pupa durum ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde 1Golarak yukarıda bir pencere açılmıştır. Benzer şekilde şekil 2A-Dtemsil dolaylı uçuş kas film, oluşumu ve gelişmesi karın kasları geliştirme (55 h film S4) birçok saat içinde izlenebilir. Bu süre boyunca, myoblasts myotubes (şekil 3A) büyüyen forma sigorta. Myotube ipuçları tendon hedeflerine geçirin ve tendon hücrelere ekledikten sonra kas, sarcomeres, contractile birimleri oluşur (şekil 3B-D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> Şekil 3: karın kas morfogenez görüntüleme yaşamak. (A-D) Zaman Mef2kullanarak Film (film S4) puan-GAL4UAS-CD8-GFP bir işaretleyici olarak karın kas morfogenez izleyin. Panelleri A'-E' bindirmeleri de novo pupa aşamasında oluşturur bir karın kas set (yeşil) modelleri ile göstermek. Ölçek çubukları vardır 100 µm. zaman APF SS: DD belirtilen. Film oda sıcaklığında satın alınmıştır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Kas seğirmesi görüntüleme yaşamak
Şekil 2 ve şekil 3aksine, şekil 4 saniye zaman ölçeği üzerinde meydana gelen kas dynamics gösterir: canlı kayıt kas kasılma. βps-Integrin-GFP endojen kontrol altında ifade pupa 0.65, saat çözünürlüklü görüntüsü tek z-uçağa confocal mikroskop (Film S5) s. Şekil 4' te gösterilen örnekte, üç DVMs (şekil 4A) ek sitelerin 10 dk 42 h APF başlangıç görüntüsü. Bu sırada, beş seğirme olaylar (şekil 4B-F), tespit edildi sarcomeres zaten yeterince iyi koordine kasılmalar bu zamanda noktada içinde gelişimini desteklemek için monte edilir olduğunu gösteren. Bu nedenle, kas seğirmesi, görüntüleme işlevsel bir okuma sarcomerogenesis için zaten sırasında dolaylı uçuş kas geliştirme28, örneğin yalnızca eclosion sonra gerçekleştirilebilir uçuş testleri yerine kullanılabilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> Şekil 4: kas seğirmesi, görüntüleme yaşamak. (A) ilk kez-noktasından 42 h APF kullanarak dorsoventral dolaylı uçuş kaslarının seğirmesi βPS-Integrin-bir işareti olarak GFP gösteren bir film (film S5). Görüş alanı içinde kas DVM II 2, DVM III 1 ve DVM III 2 eki sitelerdir. (B-F) Bindirmeleri beş bireysel seğirme olayların her biri seğirme (macenta) önce belgili tanımlık çerçevelemek ve seğirme olay (yeşil) ilk karesini gösteren renk. Bireysel kas lifleri birbirinden bağımsız olarak seğirme unutmayın. Oklar tik hareket vurgulayın. Film zaman çözünürlüğü 0.65 s. ölçek çubukları 25 µm. olmasıdır <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Endogenously tagged proteinlerin Imaging yaşamak
βps benzer-Integrin-GFP, geniş bir koleksiyon füzyon proteinlerin Drosophila içinde endojen kontrol altında oluşturulan2,3,4olmuştur. Bu sinek satırları örneğin hücre altı yerelleştirme ya da ilgi proteinlerin ifade profilleri eğitim için kullanılabilir. Koleksiyon belirli antikor kullanılabilir değil veya protein dynamics incelenen vivo içinde fiksasyon olmadan olmak gerekirse özellikle yararlıdır. Şekil 5 gösterir endogenously ifade füzyon protein üç örnek sinek TransgeneOme (fTRG) kütüphaneden Hu li tai shao (Hts)-GFP (şekil 5A, B), Talin-GFP (şekil 5C, D) ve βTubulin60D-GFP ( Rakam 5E, F). Bu proteinler ifade onları doğal olarak ifade tüm dokularda okudu olabilir. İşte, toraks epitel (şekil 5AC, E) ve dolaylı uçuş kasları veya eki sitelerinde (şekil 5BD, F) örnek olarak göstermektedir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> Şekil 5: canlı, endogenously Imaging öğesini proteinler. (a, B) Z-yığınlar Hts-GFP ifade pupa alınan en fazla projeksiyonlar. (C, D) Z-yığınlar Talin GFP ifade pupa alınan en fazla projeksiyonlar. (E, F) Z-yığınları βTubulin60D-GFP ifade pupa alınan en fazla projeksiyonlar. Paneller A, C ve E sırasıyla 18, 24 ve 18 h APF, toraks epitel gösterir ve B, D ve F dolaylı uçuş kasları veya kendi eki sitelerinde de 30 h APF göstermek panelleri. Ölçek barlar vardır 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae at JoVE.com

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Burada, canlı genel ve kas-tendon morfogenez gelişim süreçlerinin özellikle yaşam görüntüleme gerçekleştirmek için kullanımı kolay ve çok yönlü bir yöntem mevcut Drosophila pupa.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Biochemistry. Burada, canlı genel ve kas-tendon morfogenez gelişim süreçlerinin özellikle yaşam görüntüleme gerçekleştirmek için kullanımı kolay ve çok yönlü bir yöntem mevcut Drosophila pupa.

Video: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...