Yazarlar, Sokac laboratuvarında bu tekniğin öncülükine yardımcı olan Liuliu Zheng ve Zenghui Xue'nun yanı sıra analize yardımcı olan Hasan Seede'nin çalışmalarını minnetle kabul ediyorlar. Bu çalışma nih (R01 GM115111) tarafından bir hibe ile finanse edilir.

1. Embriyo toplama kapları ve elma suyu agar tabakları hazırlayın
<ol><li>Enjeksiyon deneyinden beş gün önce,28 tane inşa edin veya en az iki küçük embriyo toplama bardağı temin edin. Küçük toplama bardakları ile kullanılmak üzere taze 60 mm elma suyu agar tabakları yapın28. Tabakları 4 °C'de nemli kağıt havlularla kaplı plastik kutularda saklayın. NOT: Adım 1.3'te açıklandığı gibi sinek sayılarıyla doldurulan küçük embriyo toplama bardakları, deney başına yeterli embriyo sayısı sağlarken, embriyo elleçleme ve enjeksiyonunun erken gelişim evrelerinin görüntülenmesine izin verecek kadar kısa sürede yapılabilmesini sağlayacaktır.</li>
	<li>18 °C'ye kadar ılık elma suyu tabakları ve tabağın ortasına bir dab maya ezmesi ekleyin. Maya macunu, aktif maya ve damıtılmış suyun basit bir macunudur.</li>
	<li>En cömert yumurtlamayı teşvik etmek için, deneyden 2 gün önce sinekli toplama bardakları kurun. Toplama bardaklarına en az 100 dişi ve 50 erkek sinek ekleyin ve hazır bir elma suyu tabağı ile üst üste koyun (Şekil 1, adım 1). Enjeksiyon deneyine kadar geçen günlerde elma suyu plakalarını her gün en az iki kez, sabahları bir kez ve akşamları bir kez değiştirin. NOT: En iyi enjeksiyon ve görüntüleme sonuçları, embriyo toplama bardakları 12 saat ışık açma/kapama döngüsü ile 18 °C'de tutulduğunda elde edilir.</li>
</ol>2. Mikroenjeksiyon için G-actinRed'in çalışan bir stok çözeltisi hazırlayın
NOT: Bu hazırlık sadece 5 mg / mL çalışma stoğunun 2 μL'sini yapar G-actinRed, bu nedenle kullanıcılar mikroenjeksiyon tekniğine alışık değilse, 3. Satıcıdan alınan 10 μg G-actinRed stoğu, orijinal ambalajında 6 aya kadar 4 °C'de ~500 g kurutuculu 16 oz vidalı üst kavanozda saklanabilir.
<ol><li>Önceden bir G-tampon stok çözeltisi hazırlayın: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Oda sıcaklığında filtreleyin ve saklayın.</li>
	<li>Enjeksiyon gününde, belirtilen son konsantrasyonlarda aşağıdakilerle birlikte G-tampon stoğunu kullanarak buz üzerinde taze bir snap kapağı mikrosantrifüj tüpünde 1 mL G-tampon çalışma çözeltisi hazırlayın: 1 mM dithiothreitol (DTT) ve 0.2 mM ATP, pH 8.0. NOT: 1 mL'lik G-buffer çalışma çözümü, bir deney için gerekenden daha fazladır, ancak hazırlığı kolaylaştırır. Fazlalık denemeden sonra atılabilir veya kullanıcılar tercihlerine göre ölçeklendirilebilir.<ol>
<li>10 μg G-actinRed stoğunu buzda tutarak, önce tüpün içindeki G-actinRed'in pembe damlacığı üzerine 1 μL filtrelenmiş, damıtılmış su ekleyin.</li>
		<li>Ardından, adım 2.2'den 1 μL soğuk, taze hazırlanmış G-tampon çalışma çözeltisi ekleyin. Pipet hacmi 1 μL'ye ayarlanmışken iyice karıştırmak için ~20 kez yukarı ve aşağı borulayın. G-actinRed stoğu artık 5 mg/mL'lik son seyreltmede olacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazırlanan G-actinRed'i buz üzerinde bozulmadan 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hazırlanan G-actinRed'i 16.000 x g'da 4 °C'de 20 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjle kırarak herhangi bir çökeltmeyi çıkarın.</li>
	<li>Süpernatantın 1,5 μL'lik kısmını buz üzerinde taze bir kapak mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice borulayarak koyu pembe peletten kaçının.</li>
	<li>Hazırlanan G-actinRed supernatant'ı bir mikroneedle yüklenmeye hazır olana kadar 6 saate kadar buzda saklayın. NOT: Mikroneedles, bir mikropipette çekme makinesinde peşin olarak kılcal borulardan çekilebilir, daha sonra oda sıcaklığında 100 x 20 mm Petri kabındaki modelleme kil şeridinde saklanabilir. Mikroneedle çekme için önerilen parametreler Pipet Yemek Kitabı29'da bulunabilir.</li>
</ol>3. Embriyoları toplayın ve enjeksiyon için monte edin
<ol><li>Sineklerin 18 °C'de maya macunu ile elma suyu plakalarına 30 dakika boyunca embriyo bırakmasına izin verin.</li>
	<li>Sinekler döşenirken, maya ezmesi olmayan bir elma suyu agar tabağını oda sıcaklığına önceden ısıtın, jiletle elma suyu agarının 4 cm x 1 cm dikdörtgen kamasını kesin ve 25 mm x 75 mm'lik bir cam kaydırağa yerleştirin.<ol>
<li>30 dakikalık toplamadan hasat plakası ve28'de açıklandığı gibi damıtılmış su ile 1:1 seyreltilmiş taze çamaşır suyu dökülerek ve plakayı 1 dakika döndürerek embriyoları kaynatın (Şekil 1, adım 2). NOT: Farklı çamaşır suyu markaları farklı konsantrasyonlarda satılmaktadır. Burada kullanılan çamaşır suyu şişeden% 6 sodyum hipoklorittir ve% 3 sodyum hipoklorit nihai konsantrasyonuna seyreltilir. Biraz daha düşük konsantrasyonlardaki diğer çamaşır suyu markaları eşit derecede iyi çalışacaktır.</li>
		<li>Çamaşır suyu ve dekonsiyone embriyoları bir toplama sepetine (70 μm hücre süzgeci) dökün ve tabağı bir fışkırtma şişesinden damıtılmış su ile iki kez durulayın ve bu yıkamaları toplama sepetine ekleyin.</li>
		<li>Kafeinsiz embriyoları, maya kümeleri görünmeyene ve sepet bir kağıt havluya şişirildiğinde fazla çamaşır suyundan pembe iz bırakmayana kadar damıtılmış su ile toplama sepetinde kuvvetlice durulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Damıtılmış su ile nemlendirilmiş kıllı bir boya fırçası kullanarak, dekonsiyone edilmiş ve yıkanmış embriyoları toplama sepetinden cam slayttaki hazırlanan elma suyu agar kamasına aktarın.</li>
	<li>Dikdörtgen agar kamasının uzun ekseni boyunca on embriyoyu düz bir çizgide düzenlemek için bir çift ince uçlu cımbız veya bir diseksiyon iğnesi kullanın (Şekil 1, adım 3). Embriyoları, ön kutupları sağa bakacak ve dorsal tarafı araştırmacıya bakacak şekilde baş döndürücü olarak düzenleyin(Şekil 1, adım 3, büyütülmüş).</li>
	<li>Bir P200 pipet ucunun ucunun 0,5 cm'lik kısmını jiletle kesin ve "embriyo tutkalına" daldırın(28'deaçıklanmıştır). 24 mm x 50 mm dikdörtgen kapak ucunun uzun kenarı boyunca 5 mm genişliğinde bir bölgeyi cömertçe kaplayın (Şekil 1, adım 4) ve kuru, tutkal tarafını yukarı bırakın. Kurutma ~ 30 s alacaktır ve tutkal kaplı bölgenin tamamı ıslak veya parlak değil mat göründüğünde tamamlanır. NOT: "Embriyo tutkal" ı en az 48 saat önceden hazırlayın. 28'deaçıklandığı gibi bir scintillation şişesinde çift taraflı bant şeritlerine n-Heptane ekleyin.</li>
	<li>"Embriyo tutkalı" kuruduktan sonra, kapak germe tutkal tarafını agar üzerindeki hizalanmış embriyo sırasının üzerine hafifçe yerleştirin ve kapak ucunun kenarı ile embriyo sırası arasında 2-3 mm boşluk bırakın. NOT: Embriyoları kapak ucunun kenarına çok yakın yapıştırmak, deney sırasında embriyoların çok fazla kurumasına neden olabilir.</li>
	<li>Kapak kapağını ters çevirin, böylece embriyolar şimdi yukarı bakacaktır. Kapak çizgisinin uzun bir kenarı boyunca bir çizgide sıkışıp kalmalıdırlar ve ventral bölgeleri kapak çizgisinin en yakın kenarına bakmalıdır(Şekil 1, adım 4, büyütülmüş).</li>
	<li>16 oz vidalı üst kavanozda saklanan 150 g taze mavi kurutucunun üzerine embriyolarla kapak kapağını hafifçe yerleştirerek embriyoları kurulayın. Kapağı sıkıca vidalayın ve 8-10 dk boyunca kuluçkalayın(Şekil 1,adım 5).</li>
	<li>Tahliyeden sonra, kapak kapağını kurutucu kavanozdan çıkarın ve kapakçığın her kısa tarafını bir mikroskop kaydıramasına bantlayın, embriyo tarafı yukarı, iki adet 4 cm2 çift taraflı bantla, böylece embriyo kapak kapağı enjeksiyon aşamasına sığar (Şekil 1, adım 6).</li>
	<li>Hizalanmış embriyoları örtmek ve daha fazla dehidrasyondan korumak için Pasteur pipetli 2-3 damla Halocarbon 27 yağı ekleyin (Şekil 1, adım 6).</li>
</ol>4. Aktüer çubuk oluşumunu teşvik etmek için enjeksiyon ve ısı stresi embriyoları
NOT: Tüm enjeksiyonlar 18 °C'de sıcaklık kontrollü bir odada yapılır.
<ol><li>Cam petri kabından en az 100 mm x 20 mm boyutunda nemli kuluçka odaları hazırlayın ve odayı damıtılmış su ile nemlendirilmiş laboratuvar doku sileceklerinin bükümleriyle hizalayın (Şekil 1, adım 8). Embriyo enjekte etmeden önce kuluçka odalarını 32 °C'de veya istenen kuluçka sıcaklığında önceden ısıtın.</li>
	<li>Mikroenjektör için hava akımı vanasını açın ve mikroenjektörü açın (en az 90 psi basınçlı basınçlı basınçlı hava veya ev havası uygundur).</li>
	<li>Embriyolar kururken, daha önce hazırlanan G-actinRed süpernatantı mikro yükleyici ucu kullanarak mikroneedle geri yükleyin. Pipet 1-1,5 μL çekecek şekilde ayarlayın. NOT: Akinin viskozitesi nedeniyle, yükleme hacimleri doğru olmayabilir ve en az bir ila iki mikroneedle daha yüklemek için yeterli aksini kalmış olabilir. Mikroneedle uygun şekilde kalibre edilirse ve deney sırasında tıkanmazsa, yüklenen mikroneedle başına 60 embriyo enjekte edilebilir.</li>
	<li>Mikroneedle iğne tutucuya takın ve vidayı sıkın. Hava tüpünü mikroenjektöre bağlayın ve mikroneedle üzerindeki geri akış basıncının 30 hPa'ya kadar dengede olduğundan emin olun.</li>
	<li>Bir slayt mikrometresine 100 μm çapında bir G-actinKırmızısı (~500 pL) kabarcık püskürtmek için mikroenjektör ayarlarını kalibre edin. Doğru kabarcık boyutunu elde etmek için basınç düğmesini (500-1500 hPa) ve enjeksiyon darbe zaman düğmesini (0,1-0,5 s) mikroenjektör üzerinde döndürün. Aktüer viskozitesi ve mikroneedle uç boyutundaki değişkenliği hesaba katmak için her yeni mikroneedle yüklendiğinde bu ayarları yapın. NOT: Hazırlanan G-actinKırmızısı viskozdur ve mikroneedlenin ucunda embriyo enjekte etmeden önce atılması gereken hava olabilir. G-actinRed mikroneedle ucundan kolayca dışarı atmazsa, mikroneedle ucunu slayt mikrometresinin kenarına doğru hafifçe kırın.</li>
	<li>Slaydı monte edilmiş embriyolarla mikroskop aşamasına yerleştirin. NOT: Kurulan her enjeksiyon farklı olacaktır, bu nedenle araştırmacılar enjeksiyon yöntemini buna göre ayarlamak zorunda kalacaktır. Burada embriyolar sabit bir mikroneedle göre hareket ettirilir ve embriyoyu mikroneedle çalıştırarak her embriyoyu enjekte eder.</li>
	<li>10x hedefinin mikromanipülatör aşamasını ve odak noktasını, embriyoların görünür olması için ışık mikroskobuna ayarlayın. Vitelline zarının ana hatları en keskin olduğunda ve embriyo en büyük göründüğünde embriyolar doğru odak düzlemindedir. Doğru gelişim aşamasında olan enjekte etmek için embriyoları seçin, böylece enjeksiyon sonrası inkübasyon tamamlandığında, debriyajın çoğu istenen gelişim aşamasına ulaşır (örneğin, 32 ° C'de ısı stresinden sonra hücreselleştirmede çubukları gözlemlemek için Bownes'un2-3 30 aşamasında embriyo enjekte edin).</li>
	<li>İğneyi embriyolarla aynı odak düzlemine getirmek için mikroneedle kontrollerini kullanın. NOT: Aşamayı veya mikroneedleyi hareket ettirirken mikroneedle kapakta yakalanırsa, mikroneedle slayta çok yakındır ve doğru odak düzleminde değildir. Mikroneedle kapak ucuna paralel olmalı ve önemli bir açıda olmamalıdır (Şekil 1, adım 7).</li>
	<li>Mikroneedleyi embriyoya yerleştirin, böylece embriyoyu ventral bölgesinin ortasında, embriyo "ekvatorunda" vurur. Mikroneedle ucu embriyonun ortasında göründüğünde ayak pedalı veya "enjekte" düğmesi ile enjeksiyonu tetikleyin (Şekil 1, adım 7).</li>
	<li>G-actinRed'i bir kez enjekte edin ve mikroneedleyi yavaşça çıkarın. Sahneyi hareket ettirin ve uygun gelişim aşamasının her embriyosu için tekrarlayın. NOT: G-actinRed enjekte edildiği ve embriyodan biraz sitoplazma sızabileceği için embriyonun genişlemesi normaldir.</li>
	<li>Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, slaytı embriyolarla birlikte hazırlanan nemli inkübasyon odasına yerleştirin ve kapağı kapatın (Şekil 1, adım 8). Hücreselleşmeye ulaşan embriyolar elde etmeye çalışıyorsanız, nemli inkübasyon odasında 60-75 dakika boyunca embriyoları 32 °C'de ısı stresine sokun. NOT: Isı stresli embriyoların hücreselleştirilmesinde çubukların görselleştirilmesine izin veren kuluçka sürelerine dikkat edilir. İnkübasyon süresi ısı stres kontrolü olmayan embriyolar için daha uzun olacaktır, çünkü gelişim daha düşük bir sıcaklıkta daha yavaş olacaktır31. Bu kontrol embriyoları, belirli bir deneyin tasarımına ve sorulacak soruya bağlı olarak 18 °C veya 25 °C gibi sıcaklıklarda nemli odalarda inkübe edilebilir. G-actinRed'in embriyo boyunca yayılması için gereken minimum kuluçka süresi 30 dk'dır.</li>
</ol>5. Konfokal mikroskopi ile ısı stresli embriyolarda görüntü aktivasyon çubukları
<ol><li>Embriyolar ısı stresi altındayken, konfokal mikroskobu açın ve 561 nm lazer kanalını seçin.</li>
	<li>Objektif lensi (25x, 40x veya 63x önerilir) çalışma konumuna getirin.</li>
	<li>Görüntüleme embriyoları ısıtıyorsa, ısıtılmış sahne inkübatörü 32 ° C iç sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın. Hedefteki veya yakınındaki sıcaklığı kontrol etmek için bir nokta ve çekim veya kızılötesi termometre kullanılabilir.</li>
	<li>Kuluçka tamamlandıktan sonra enjekte edilen embriyolarla slaydı nemli inkübasyon odasından çıkarın (Şekil 1, adım 9).</li>
	<li>Hızlı bir şekilde çalışarak, kapak kapağını monte edilmiş embriyolarla slayta yapıştırmak için kullanılan çift taraflı bant parçalarını hafifçe çıkarın (Şekil 1, adım 9). DİkKAT: Çok fazla kuvvet uygulandığında kapaklar kolayca parçalanabileceğinden, bu adımlar sırasında nazik olun.</li>
	<li>İki adet 2,5 cm uzunluğunda çift taraflı bant parçasını birbirine yapıştırın ve bandı 2,5 x 0,5 cm uzunluğunda iki şerit yapmak için iki uzunlamasına kesin (Şekil 1, adım 10).</li>
	<li>Her bant şeridinin uzunluğunun üçte ikisini ilk kapak ucuna yapıştırın, Halocarbon 27 yağında embriyoların her iki tarafını da kuşatın (Şekil 1, adım 10, turuncu), bant şeritlerinin üçte birini embriyoların sıkıştığı ilk kapak kapağının kenarında asılı bırakın. Eldivenli eller kullanın ve bu adım sırasında embriyolara dokunmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Embriyoları kapaklar arasına sandviç yapmak için bant şeritlerinin üzerine hafifçe ikinci bir dikdörtgen örtü yerleştirin(Şekil 1, adım 10, mavi). 25 mm'lik kenarları hizalayın, ancak 50 mm'lik kenarları bir birinden 1 cm genişliğinde tutun. NOT: Bu ikinci coverlip'in tam yüzeyi objektif lense bakacak yeni görüntüleme yüzeyi olacak, bu nedenle bu ikinci kapaklı yüzeyde parmak izi veya Halocarbon 27 yağı almamaya dikkat edin. Embriyoları eşit şekilde batırmak için ekstra Halocarbon 27 yağı eklenebilmesi için ofset gereklidir. Gerekirse, iki örtünün sandviçin üst kısmında buluştuğu dikişe Halocarbon 27 yağı ekleyin ve embriyoları kılcal etki ile kaplayacaktır (Şekil 1, adım10'dakikesik çizgilere bakın).</li>
	<li>Kapak kapağının banta yapışmasını sağlamak için bir jiletin künt tarafıyla doğrudan bant şeritlerinin üzerinde olan kapak zarının alanlarına hafifçe dokunun.</li>
	<li>Kapaklı sandviçi ters çevirin ve görüntüleme yüzeyini temiz tutmak ve konfokal mikroskopa taşımak için bir laboratuvar doku silecek üzerine yerleştirin (Şekil 1, adım 11). Görüntülemeden önce bandın her iki kapak kapağına da tamamen yapıştığından emin olun.</li>
	<li>Isıtılmış aşamanın sıcaklıkta olduğunu onaylayın ve ters bir mikroskop kullanıyorsanız, seçilen objektif lense daldırma sıvısı ekleyin.</li>
	<li>Yeni görüntüleme yüzeyinin (2nd coverlip) daldırma sıvısına dokunan yüzey olduğundan emin olmak için kapaklı sandviçi dikkatlice sahneye yerleştirin (Şekil 1, adım 11). NOT: Gerekirse, kapaklar ısıtılmış aşamaya iyi uymuyorsa görüntüleme sırasında gereksiz hareketi önlemek için kapaklı sandviçi iki küçük çift taraflı bantla sahneye yapıştırın.</li>
	<li>Bulaşan ışık veya floresan kullanarak hücreselleşme (Bownes evre4a 30)veya istenen gelişim aşamasında olan bir embriyoya odaklanın.</li>
	<li>Bir embriyo odak noktasına getirildikten sonra, konfokal mikroskopta lazer alma moduna geçin ve lazer gücünü ve kazancını, çerçeve boyutunu, döşemesini ve projeksiyon ayarlarını istediğiniz gibi ayarlayın.</li>
	<li>intranükleer aksin çubuklarını bulmak için embriyo çekirdeğinin odak düzlemlerinden yüzey görünümü görüntüleri alın. Çubuklar, nispeten koyu çekirdeklerin içinde parlak çizgiler veya noktalar olarak birden fazla yönde görünmelidir (Şekil 2A, 2C).</li>
</ol>6. Alternatif görüntüleme deneyleri
<ol><li>Hücreselleşme sırasında plazma zarı oluklarının uçları gibi intranükleer aktin çubuklarının uzunluğu boyunca veya sitoplazmik aktin yapılarında aktin cirosunu araştırmak için FRAP gerçekleştirin.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımında, deneyi elde etmek için oluk uçlarının veya akran çubuklarının etrafında dikdörtgen bir bölge seçin.</li>
	<li>Beyazlatmak için dikdörtgen alım bölgesi içindeki bir aksin çubuğunun merkezinin küçük bir kare bölgesini seçin. Aksin çubuğunun uçlarının görünür olduğundan emin olun ve çekirdeğin içindeki çubuğun doğru bir şekilde izlenmesine izin vermek için deney sırasında ağartılmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Çamaşır suyu lazerini 50x yineleye ve çamaşır suyu lazer gücünü maksimuma ayarlayın.</li>
	<li>Maksimum piksel bekleme hızında toplam 120 sn'ye kadar her saniye görüntü elde etmek için bir zaman kursu seçin ve görüntü alımının ilk iki saniyesi sonra lazeri ağartacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Floresan kurtarmanın devre arasını belirlemek için verileri ölçün1.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos.">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li><li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/cofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion.">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li><li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies.">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li><li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF/cofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function.">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li><li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases.">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li><li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease.">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li><li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+actin-ADF/cofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons.">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li><li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress.">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li><li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells.">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li><li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin.">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li><li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein,+cofilin.">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li><li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods.">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li><li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+development,+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons.">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li><li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus.">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li><li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells.">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li><li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells.">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li><li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage.">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li><li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuf,+a+Rab11+effector,+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization.">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li><li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation.">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li><li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos.">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).</li><li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos.">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).</li><li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila.">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo.">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).</li><li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers.">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).</li><li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology.">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li><li>Mollinari, C., Gonz&#225;lez, A., Cid-Arregui, A., Garc&#237;a-Carranc&#225;, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+and+transgenesis.">Microinjection and transgenesis.</a> Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos.">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).</li><li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li><li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster.">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li><li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing.">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li></ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Bu yöntemin önemi, ASR ve eşlik eden akin çubuk montajı ile ilgili yeni araştırmalara olanak sağlamak için Drosophila embriyoları21,22,23,24,25,26,27'de iyi kurulmuş mikroenjeksiyon protokolünü kullanmasıdır. G-actinRed'i canlı embriyolara enjekte etmenin ...

Bu protokol, indükleyici bir Actin Stres Yanıtı (ASR)1geçiren ısı stresli embriyolarda intranükleer akin çubuklarının montajını görselleştirmek için G-actinRed'in nasıl enjekte edildiğini açıklar. Bu protokolü, embriyolarda morfogenezin bozulmasına ve canlılığın azalmasına yol açan ASR çalışmalarına yardımcı olmak için geliştirdik ve yetişkin insan hücre tiplerinde böbrek yetmezliği2, kas miyopatileri3ve Alzheimer ve Huntington Hastalığı 4 ,5,6,7,8gibi patolojilerle ilişkilidir. Bu ASR, ısı şoku 9 , 10 ,11,oksidatif stres4,6,azaltılmış ATP sentezi12ve anormal Huntingtin veya β-amiloid oligomerizasyon 4 , 5 , 6 ,7,9,13,14,15,16dahil olmak üzere çok sayıda hücresel stres tarafından indüklenmiştir. ASR'nin ayırt edici özelliği, etkilenen hücrelerin sitoplazmasında veya çekirdeğinde anormal aktin çubuklarının montajıdır, bu da aktin etkileşime giren bir proteinin stres kaynaklı hiperaktivasyonu ile tahrik edilir, Cofilin 1,5,6,10. Ne yazık ki, ASR ile ilgili önemli bilgi boşlukları devam etmektedir. Örneğin, akin çubuklarının işlevi bilinmemektedir. Çubukların neden bazı hücre tiplerinin sitoplazmasında, ancak diğerlerinin çekirdeğinde oluştuğunu anlamıyoruz. ASR'nin strese giren hücreler veya embriyolar için koruyucu mu yoksa uyumsuz mu olduğu da açık değildir. Son olarak, Cofilin hiperaktivasyonu veya aktüer çubuk tertibatını temel alan ayrıntılı mekanizmaları hala bilmiyoruz. Bu nedenle, bu protokol, canlı meyve sineği embriyosunun son derece çekişli deneysel sisteminde akin çubuğu oluşumunu ve dinamiklerini görselleştirerek ASR'yi araştırmak için hızlı ve çok yönlü bir test sağlar.
G-actinRed'i canlı Drosophila embriyolarına mikroenja alma protokolü başlangıçta doku oluşturma olayları sırasında normal sitoplazmik aktin yapıların17 dinamiklerini incelemek için geliştirilmiştir. Bu çalışmalarda, G-actinRed enjeksiyonunun sitokinoz veya gastrülasyon dahil olmak üzere embriyodaki erken gelişim süreçlerini olumsuz etkilemediğini bulduk17,18. Daha sonra protokolü değiştirdik, embriyo işleme ve G-actinKırmızı enjeksiyonu, ASR1'dengeçen ısı stresli embriyolarda akin çubuklarının görüntülenmesine izin vermek için uyarladık. Embriyolarda aksini görselleştirmek için G-actinRed enjeksiyonu dışında başka yöntemler de kullanılabilir. Bu yöntemler, Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP ve Moesin-GFP(19'daincelenmiştir) gibi aktivin bağlayıcı proteinlerin etki alanlarına veya aktivin bağlayıcı proteinlerin etki alanlarına etiketlenmiş floresan proteinleri (FPs) ifade etmeye dayanır. Bununla birlikte, bu FP problarını kullanmak dikkatli olmayı gerektirir, çünkü bazı aksin yapılarını stabilize edebilir veya bozabilirler, tüm akin yapılarını eşit olaraketiketlemezler 20ve akin-GFP durumunda, son derece fazla ifade edilir - sadece strese bağlı değil, aynı zamanda aksin konsantrasyonuna bağımlı olan çubuk tertibatının analizi içinsorunludur 1. Bu nedenle, G-actinRed sinek embriyolarında çubuk çalışmaları için tercih edilen probdur ve embriyonun büyüklüğü kolay enjeksiyonunu sağlar.
Bu protokolün iş akışı, Drosophila embriyolarına proteinler, nükleik asitler, ilaçlar ve floresan göstergeler enjekte etmek için kullanılan diğer köklü mikroenjeksiyon tekniklerine benzer21 , 22,23,24,25,26,27. Bununla birlikte, burada G-actinRed'in mikroenjeksiyonunun ardından embriyolar ASR ve intranükleer aksin çubuk tertibatını teşvik etmek için hafif ısı stresine maruz kalırlar. Sineklere erişimi olan laboratuvarlar ve enjeksiyon teçhizatı için, bu yöntem, farklı stresler tarafından indüksiyonu veya farklı genetik geçmişlerde modülasyon da dahil olmak üzere ASR ile ilgili belirli çalışma hatları için kolayca uygulanabilir ve uyarlanabilir olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Apple juice, Mott&#039;s, 64 fl oz</td><td>Mott&#039;s</td><td>014800000344</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;mu;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>For collecting dechorionated embryos</td></tr><tr><td>Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>For imaging intranuclear actin rods</td></tr><tr><td>Desiccant</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>For desiccating embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Dissecting needle, 5 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>For making embryo glue</td></tr><tr><td>Embryo collection cage</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>For housing adult flies and collecting embryos</td></tr><tr><td>Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701D</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>For microneedles</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>For hydration of embryos</td></tr><tr><td>Heated stage incubator</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>For confocal imaging</td></tr><tr><td>Lab Tissue Wipers, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Lab tissue wipers</td></tr><tr><td>Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>Injection microscope</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Microinjector, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>For loading microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Custom</td><td>For performing microinjections</td></tr><tr><td>Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>For pulling capillary tubes to make microneedles</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 24x50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>For mounting embryos</td></tr><tr><td>Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>For mounting embryos for injection</td></tr><tr><td>n-Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Component of embryo glue</td></tr><tr><td>Objective, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>10x objective for injection microscope</td></tr><tr><td>Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>40x water objective for confocal</td></tr><tr><td>Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x mixed immersion objective for confocal</td></tr><tr><td>Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x oil objective for confocal</td></tr><tr><td>Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>For transferring embryos</td></tr><tr><td>Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>For blotting cell strainer</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 5 3/4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>For covering embryos with oil</td></tr><tr><td>Petri dish, glass, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>For humid incubation chamber</td></tr><tr><td>Petri dish, plastic, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>For apple juice plates</td></tr><tr><td>Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>For loading the microneedle</td></tr><tr><td>Pipette tip, xTIP4 250 &amp;mu;L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>For adding embryo glue to coverslip</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>For cutting agar wedge, tape, pipette tips</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 &amp;mu;g)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>For making embryo glue</td></tr><tr><td>Screw top jar, 16 oz</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>For desiccating embryos</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>602104PG</td><td>For calibrating volume of G-actin injection</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Component of yeast paste</td></tr></tbody></table>

imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos

Bu protokolün amacı, ısı stresinden sonra canlı Drosophila melanogaster embriyolarında bir araya gelen intranükleer akin çubuklarını görselleştirmektir. Aktiin çubukları, nörodejeneratif hastalık da dahil olmak üzere insan patolojilerine eşlik eden korunmuş, indüklenen Bir Aktün Stres Yanıtı'nın (ASR) ayırt edici özelliğidir. Daha önce, ASR'nin morfogenez başarısızlıklarına ve gelişmekte olan embriyoların canlılığının azalmasına katkıda bulunduğunu gösterdik. Bu protokol, görüntüleme, genetik ve biyokimyaya son derece uygun bir model sisteminde aktin çubuk montajının ve ASR'nin altında bulunan mekanizmaların sürekli incelenmesini sağlar. Embriyolar toplanır ve enjeksiyona hazırlamak için bir kapak kapağına monte edilir. Rhodamine konjuge globüler aktilin (G-actinRed)seyreltilir ve bir mikroneedle yüklenir. Her embriyonun ortasına tek bir enjeksiyon yapılır. Enjeksiyondan sonra embriyolar yüksek sıcaklıkta inkübe edilir ve intranükleer aksin çubukları daha sonra konfokal mikroskopi ile görselleştirilir. Aktüer çubuklarında fotobleaching (FRAP) deneyleri yapıldıktan sonra floresan iyileşmesi yapılabilir; ve sitoplazmdaki diğer aktin bakımından zengin yapılar da görüntülenebilir. G-actinRed'in endojen G-actin gibi polimerize olduğunu ve kendi başına normal embriyo gelişimine müdahale etmediğini görüyoruz. Bu protokolün bir sınırlaması, embriyonun ciddi yaralanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında dikkatli olunması gerektiğidir. Bununla birlikte, pratikte, G-actinRed'i Drosophila embriyolarına enjekte etmek, aktivin çubuklarını görselleştirmenin hızlı ve güvenilir bir yoludur ve herhangi bir genotip sinekle veya hipoksi ve oksidatif stres de dahil olmak üzere diğer hücresel streslerin girmesiyle kolayca kullanılabilir.

Şekil 1'deembriyo işlemenin şematik iş akışı gösterilmiş ve Tablo 1'detipik bir deney için bir zaman çizelgesi sunulmuştur. İyi bir deneysel sonuç için bir tahmin, enjekte edilen her 10 embriyo için, görüntülenen embriyoların en az yarısının doğru gelişim aşamasında olacağı, hasarsız olacağı ve 32 ° C'de ısı stresi olan sağlam bir ASR sergileyeceğidir. Bu ASR, Şekil 2A'da (sağ panel) bir embriyonun temsili...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos at JoVE.com

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

3.4K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.

Video: Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Gelişim Biyolojisi

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Nörobilim

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Biyoloji

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Drosophila Nöromüsküler Kavşaklarda ve Kas Hücrelerinde Mikrotübül Ağlarının Görüntülenmesi

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Yazar Spotlight: Drosophila nöromüsküler kavşaklarında mikrotübül ağını anlamak 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dik Görüntüleme

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Görüntüleme Kalsiyum

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma