Bu protokol, klamidyanın değiştirilmiş gelişimsel profillerle üretimi ve izolasyonu için benzersiz bir araç sağlar ve sonuçta gelişim döngüsünü düzenleyen genlerin tanımlanmasına olanak sağlar. Bu yöntemin başlıca avantajları, klamidya hücre tipi gelişimini gerçek zamanlı olarak takip edebilme yeteneği ve klamidyayı izole edebilme yeteneğidir. Bir klamidya trachomatis muhabirini susturmak için, yedinci temel bedenlere yaklaşık üç kez 10.'yu içeren bir klamyan stoğu gördüm.
İlgi ve pelet muhabir plazma ile dönüştürülmüş, düşünce santrifüj ile stoklanır. 10 saniye boyunca % 10 güçte sonication kullanın, kazara metabolizma tampon 100 mikrolitre temel organları yeniden askıya almak ve eşit olarak ortaya çıkan temel vücut süspansiyon bölünmüş, iki 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpler arasında. Mutagenez için klamidya aliquots içine taze hazırlanmış EMS metabolizma çözeltisi 50 mikrolitre ve sadece stok mutagenezi için chlamydial aliquot için vaccinic metabolizma tampon 50 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca her iki örnek kuluçka.
EMS kullanım sırasında bilinen bir karsinojen eldiven giymek, ve tüm EMS kontamine ekipman ve orta, bir azı lı sodyum hidroksit için 24 saat boyunca ıslatın. Bir toptan kültür kurmak için, görüntüleme ve mutigenize klamidya trachometers izolasyon için. Tohum altı iyi cam alt plakalar, altı kez 10 beşinci maliyet yedi hücreleri, iyi başına tam orta iki mililitre ve tohum 24 iyi polistiren plaka ile 10 beşinci neden iyi başına tam orta bir mililitre yedi hücre.
Mutagenized inkar klamidya trachomatis enfekte ile konak hücre kültürü enfekte etmek için, yaklaşık altı kez 10 ile cam dipli plaka beş Wells, mutajenize temel organların. Kuyu başına 1,5 mililitre buz gibi HBSS. ve kalan kuyuya yaklaşık iki kez 10 ile beşinci alay mutajenize ilköğretim organları ile 1.5 iyi başına buz soğuk HBSS mililitre, 37 santigrat derece bir 15 dakikalık kuluçka sonra, sallanan ile, 37 derece Santigrat HBSS heparin mililitre başına bir miligram ile takviye ile enfekte hücreleri yıkayın, hemen bir HBSS durulama takip.
tekrar heparin ile hücreleri yıkayın, hemen sonra sadece HBSS ile iki durulama tüm heparin kaldırılır emin olmak için. Son yıkamadan sonra, her kuyuya 37 santigrat derece görüntüleme ortamıdört mililitre ekleyin. Ve 37 santigrat derece deiyonize su ile inter kuyu boşluklarını doldurun sonra 10 saat boyunca hücre kültürü kuluçka plakaları yerleştirin.
Kuluçka sonunda mikroskop evresi kuluçka makinesini %5 karbondioksit ve 37 santigrat dereceye ayarladı. Ve altı kuyu cam alt plaka, sahne kuluçka içine yerleştirin. Görüntüleme yazılımında, altı kuyu plakası şablonunu seçmek için yüksek içerik tarama eklentisini kullanın ve otomatik görüntüleme için odaklamayı ayarlamak için otofokus seçeneğini kullanın ve GFB kanalında %4 yoğunlukta 250 milisaniyeye ve RFP kanalında yoğunluğu %18'e ayarlamak için iyi görüş başına 12 alandan oluşan bir görüntüleme konum listesi oluşturun.
Yani 24 saat boyunca görüntüleme döngüsünde, 30 dakikalık aralıklarla, gelişim döngüsünün kinetik yakalamak ve inFocus dilimin her iki tarafında sona eren odak aralığı ile birden fazla Z yığınları içerecek şekilde görüntü yakalama ayarlamak için, sonra görüntüleme için göreli Z seçin, edinme penceresinde birden fazla dilim ve görüntü yığını dosyasını kullanın. görüntüleri TIFF yığın dosyaları olarak kaydedilecek şekilde ayarlamak için. Geliştirme profillerini değiştirerek dahil etme parçalarını belirlemek için, EMS ekranındaki alma hücresini, Python not defterini işaretlemeyi kullanarak izleme istatistiklerindeki noktalardan, CSV dosyalarını Panda'nın veri çerçevesine aktarın.
Her parça için hem erken hem de geç muhabirler için maksimum ifadeye sahip olmak için zamanı hesaplamak için hesap hücresini kullanın ve yarım max plot hücresindeki bokeh çizim paketini kullanarak hctB baloya karşı iki yarım max ifadeden yarım maksimal ifadeye kadar görselleştirin. Sahte işlenmiş dağılım bulutunun dışında kalan mutant popülasyonundan gelen eklemeleri belirlemek için bokeh etkileşimli parça ID Explorer'ı kullanın. Animasyonlu kan hücresi grafiğinde organizatör ekspresyonu kinetiğindeki değişiklikleri dinamik olarak görselleştirmek için HCTB balosuna karşı EOU balosundaki ifade yoğunlukları.
Ardından, ekletme bulucu hücresindeanimasyon grafiğinden anlık görüntü alın. Gelişimsel Newton'ları, ilginin dahil edilmesinden izole etmek için, görüş alanını tanımlanmış bir dahil etme ile bir kuyunun üzerine yerleştirin ve iğneyi faz diferansiyel girişim kontrastı beyaz ışık kanalı ışık kaynağının üzerinden geçirin, iğneyi görselleştirmek için, 595 nanometreyi, uyarma kanalını kullanarak temel gövdeleri ekstraksiyon için görselleştirin. Ve ince ayarı ve mikro manipülatör kullanın, dahil kılcal iğne manevra, iğne ile dahil rüptür, ve kılcal iğne ucu içine temel organları çizmek için mikro enjektör kullanın.
Çıkarılan temel cisimleri, kılcal iğneden tek bir kuyuya, 24 kuyu polistiren plakada hazırlananlardan dışarı atın ve bir sonraki ekstraksiyon için yeni bir kılcal iğne kullanın. Her izole yeterli bir genişleme sonra, bir mililitre likit mikropipet ucu ile enfekte monolayer bozmak ve orta hücre enkaz transferi ve yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine klamidya serbest. Pelet santrifüj tarafından hasat klamidya, ve buz soğuk 75 mikrolitre pelet resuspend, sakaroz fosfat glutamat tampon, sonra eşit dahil süspansiyon bölünmüş, üç yeni 1.5 mililitre vidalı kapak mikro santrifüj tüpler arasında, ve eksi 80 santigrat okumak için tüpleri saklayın.
Mutajen ISED görüntüleme için bir konak hücre kültürü kurmak için tohum izole 1.6 kez 10 ile dördüncü maliyet yedi hücreleri, kuyu başına tam orta 100 mikrolitre. Konak hücre monolayer bilgili mutant klonlar ve buz üzerinde yabani tip klamidya stokları çözülme ulaştıktan sonra ve gerçekleştirmek için izole başına bir sütun kullanın, her mutant izole iki kat seri seyreltme. Enfekte, yabani tip klamidya ile kalan sütun, yaklaşık 0,5 enfeksiyon çokluğu, ve kuluçka sonunda 10 saat boyunca hücre kültürü kuluçka bir plaka yerleştirin, az bir enfeksiyon çokluğu karşılık gelen mutant izole başına üç kuyu seçin, ve bir görüntüleme konum listesi oluşturmak.
her kuyu için iki görüş alanından oluşur. Bu scatterplot, EOU ve hctB organizatörleri bireysel chlamydial izole gelen yarım maksimal ifade zamanı, eou organizatörü ve daha uzun kez dört hctB maksimal ifade için daha kısa kez üretilen olarak izolasyon için seçildi klonlar görülebilir. Değiştirilmiş kinetik içeren eklemeler, iki promotörün dinamik gen ekspresyonunun görselleştirilmesine, iki promotörün dinamik gen ekspresyonuna dayalı olarak tanımlanabilir ve ilgi nin dahil edildiğinin yerini belirlemek için animasyonlu grafiğin anlık görüntüsü kullanılabilir.
Bu temsili görselleştirmelerde, 10'u diferansiyel kinetik sergilenen izolasyon için toplam 24 dahil lik tespit edilmiştir, üç farklı fenotipik kategoride yeniden test edildikten sonra, sekiz izole, yaklaşık 24 saat sonrası enfeksiyon sonrası azalmış EOU promotör ekspresyonu sergilenmiştir. A3667 klon tarafından gösterildiği gibi, B3858 izole, ayrıca azalmış bir EOU promotör ifadesi sergiledi, yaklaşık 24 saat sonrası enfeksiyon. Ama hctB promotör ekspresyonunda genel bir artış, B3662 izole ise, EOU organizatörü floresan artan düzeyde ifade her iki promotörler ifade ani bir kayıp izledi.
Mutant B3662 için canlı hücre mikrograflarının analizi, konak hücre lisisinin bu mutantla enfekte olmuş hücrelerde, yabani tip enfekte hücrelerden çok daha erken meydana geldiğini ortaya koymaktadır. Hücre tipi gelişimi eksik klamidya kurtarma, bu hücreler konak reinfect olamaz gibi, mümkün olmayabilir. Genom geniş ilişki çalışmaları izolasyondan sonra, gelişimsel genleri tanımlamak için, istatistiksel korelasyon yoluyla, alternatif organizatör muhabirlerin dahil edilmesi yle birlikte kullanılabilir.
Bu yöntem, çok sayıda genetik yolların araştırılması, genetik devre mekanizmalarının diseksiyon içine, ve diğer hücre içi patojenler genişletilebilir.
