Yazarlar Otterbein Üniversitesi Lisans öğrenci araştırma bursu ve öğrenci araştırma fonu Ödülleri GVK ve SGK kabul etmek istiyorum; ve dini Program Ödülü Otterbein Profesör Gilbert E. Mills Memorial donatılmış ve Biyoloji bölümü ve yer Bilimleri Fakültesi Araştırma ve burs ödülü aşı için donatılmış. Bert ve Jane boynuz donatılmış öğrenci araştırma fonu Bilimleri GVK ve SGK verildi. Yazarlar ayrıca minnetle Duquesne Üniversitesi Lisans Araştırma Programı Bursu finanse GVK ve SGK için kabul etmek istiyorum. Eski Juniata üniversite lisans araştırma öğrencileri, Ryan Johnson ve Lindsey Draper mikroskobu görüntüleri resimler 2 ve 3, için sırasıyla bulunmuştur.

1. aletleri, Kültür medya, çözümleri ve Petri yemekler hazırlayın
<ol><li>Otoklav kürdan bir 50 mL ölçek steril tutmak için alüminyum folyo ile kaplı.</li>
	<li>-Ecek var olmak bütün kuru mallar sterilize kullanılan (ipuçları, sopa, Züccaciye, vb) bir Otoklav içinde. Not: dikkat! Kullanılan basınçlı kap modeli için tüm güvenlik yönergelerini izleyin. Basınçlı kaplar, patlama ve Buhar ve sıcak yüzeyler, malzemeler ve medya ile temas yanıkları için bir riski. Otoklav güvenliği için "Uygun kullanımı, basınçlı kaplar"34görüntüleyin.</li>
	<li>
MS kültürler büyümeye agar (Mannitol Soya unu (SFM))14 hazırlayın.
	<ol>
<li>5 g soya unu ve agar 5 g 1 L şişesi için ekleyin.</li>
		<li>Doz mannitol musluk suyu 250 ml 5 g dağıtılması ve soya unu ve agar içeren balonun dağıtmak.</li>
		<li>121 ° c, en az 30 dk 15 psi bir köpük Tak ve folyo balon ve basınçlı kap açılması için ekleyin. Dikkat: Bu orta kolayca kaynar. En az dört kez MS agar autoclaved olmak gerçek hacmiyle tutabilir bir şişesi kullanın. Standart bir düdüklü tencere benzer güvenlik konuları ile bir otoklav yerine kullanılabilir. Alternatif olarak, bir mikrodalga fırın bir otoklav erişimin mümkün35,36değilse kitle iletişim araçları ve malzemeleri sterilize etmek için kullanılabilir. Lise öğretmeni de yerel kolej veya üniversiteler autoclaved malzemeleri erişmek için birlikte çalışmak isteyebilirsiniz.</li>
		<li>Serin ortam rahat kadar yeterince işlemek. 50 ° c altındaki sıcaklıklarda agar katılaşır çünkü çok uzun süre sakin değil dikkatli olun</li>
		<li>Her Petri kabına dibinde yaklaşık yarısı kadar MS agar balonun üzerinden steril Petri yemekler dökün tam (medya Petri kabına başına yaklaşık 25 mL). Ağar kaplamalar kullanmadan önce kuvvetlendirmek için izin verir. Ağar kaplamalar bir plastik torba gerekinceye kadar oda sıcaklığında saklayın. Not: özellikle antibiyotik medyada gerekirse ağar kaplamalar da bir buzdolabında saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. çizgi Streptomyces yayma için plakalar üzerine
<ol><li>Çizgi Streptomyces suşları üzerine MS ağar kaplamalar çeyreği gibi standart bir yöntem kullanarak tek kolonileri için yöntem Sanders, 201237gösterildiği gibi çizgi. Not: İnoculating bir döngü veya steril kürdan kullanılabilir. İsteğe bağlı: Diğer medya yaygın olarak R2YE ve en az medya14gibi Streptomyces türleri için kullanılır.</li>
	<li>Tabak 30 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Levhalar her 4-6 gün bir koloni seçerek restreak. Rasgele mutasyona eğilimli olurlar kolonileri yaş.</li>
</ol>3. bakteriyel depolanmasında gliserol Mycelial hisse senetleri oluşturun
Not: Mycelial hisse senetleri WHI dahil olmak üzere tüm Streptomyces suşları ve bld suşları ve sporulation tamamlanması mümkün değildir diğer gelişimsel mutantlar için oluşturulabilir.
<ol><li>200-500 µL % 20 gliserol steril ahşap Kavela aplikatör kullanarak, kolonilerde 15-20 macerate.</li>
	<li>Bulamaç kolonileri macerated bir micropipette veya steril transfer pipet kullanarak bir 1,5 mL dondurucu kültür Tüp, aktarın. Not: Başka bir yerde micropipette kullanım temellerini ele alınmıştır38.</li>
	<li>Son hacim yapmak için yeterli % 20 gliserol eklemek 1 mL ve karışımı yavaşça. Örnekleri-80 ° C'de depolayın Not: dikkat! Kullanım kriyojenik Emanet eldiven ve önlük ile aşırı soğuk ilişkiden cildi korumak için. Alternatif olarak, bir-20 ° C-dondurucu potansiyel uzun vadeli depolama süresi azalma ile kullanılabilir. Aşırı soğuk ve canlılığı genişletmek için çözdürme kaçının.</li>
</ol>4. suşları için gliserol Spore stokları oluşturma yeteneğine sahip Sporulation
Not: Spore hisse senetleri için uzun vadeli canlılığı tercih edilir ama sadece sporulation tamamlama özelliği olan suşları için uygulanabilir.
<ol><li>
Maserasyon konfluent çim büyüme37elde etmek için bir agar plaka üzerinde malzeme (Kimden adım 3.1) 100 µL yayıldı. Not: Sanders37 yılında yayılan kaplama gösterilir (değiştirme: bir pikap gerekli değildir.). Plaka tek eliyle yaymak yumuşak içinde ileri geri hareket etmek diğer yandan kullanırken hareket agar medya karşısında kapatılabilir.<ol>
<li>Damlalıklı 100 µL maserasyon miselyum bir MS agar plaka ortasına.</li>
		<li>Bir cam veya metal aracı tarafından kısmen % 70 etanol batış ve etanol buharlaşma hızı yavaş yavaş bir Bunsen burner alev aracılığıyla bir kez yayıcı geçtikten yayılan sterilize. Dikkat: Etanol çok kolay alevlenebilir. Yanan yayıcı etanol yerleştirin veya etanol etanol çanak içine düşmek için yanan damla izin değil. Alternatif olarak, bir tek kullanımlık steril pamuklu çubukla istemek hayır etanol ya da alev plaka üzerinde bakteri yaymak için kullanın.</li>
		<li>MS agar bir el ile bir geri kullanırken plaka ve plaka steril dağıtıcı ile aşılamak için ileri hareket açın.</li>
		<li>Zorlanma iyi sporulated kadar 5-7 gün 30 ° C'de için kuluçkaya. Not: Kuluçka kez türler ve zorlanma bağlı olarak değişir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 mL steril serum fizyolojik ekleyin (% 0.8 NaCl) sporulation uğramıştır konfluent bir çim Streptomyces hücre ortasına.</li>
	<li>Sporlar yavaşça bir kısır döngü (ya da bir pamuk tomurcuğu), yavaş yavaş aşı çim kenarına doğru hareket ile miselyum yüzey sürtünme hasat.</li>
	<li>Serum fizyolojik içeren damlalıklı 15 mL konik tüp içine sporlar. Girdap şiddetle bireysel hücrelere spore zincirleri kırmak için.</li>
	<li>Yaklaşık 2500 x gde 5 min için oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Damlalıklı süpernatant ve atma. Spore pelet tarafından dinç girdap ajitasyon kalan sıvı küçük miktarda dağıtmak.</li>
	<li>Sporlar çözüm yukarı ve aşağı bir pipet ile çizerek 1 mL % 20 gliserol resuspend.</li>
	<li>Gliserol spor stok 1,5 mL dondurucu tüp aktarın. Mağaza-80 ° C'de Uyarı: Kullanım kriyojenik Emanet eldiven ve önlük ile aşırı soğuk ilişkiden cildi korumak için. Alternatif olarak,-20 ° C-dondurucu potansiyel azalma uzun süreli saklama süresi canlılık ile kullanılabilir. Aşırı soğuk ve canlılığı genişletmek için çözdürme kaçının.</li>
</ol>5. Mutagenesis gerçekleştirmek
<ol><li>Başvurulan giriş olarak istediğiniz sonuçlara dayalı ve yakın Baltz, 201639değerlendirme mutagenesis gerçekleştirin. Not: Bazı fenotipleme deneyler mutagenesis, çevreden yeni türler tanımlamak için niyet gibi kullanmanız gerekmez. Rastgele mutagenesis yöntemleri transposon8,9,10,11,12,13, UV radyasyon ya da kimyasal madde14kullanımını içerir. Site yönetmen-mutagenesis15,16,17,18,19,20 teknikleri belirli nokta mutasyonlar, silme, oluşturmak için kullanılan veya diğer türleri mutasyonlar.</li>
</ol>6. karşılaştırmak ve görsel görünümünü kaydetmek
<ol><li>Koloni morfolojisi ile karşılaştırıldığında belgili tanımlık vahşi-tipi üst soy her mutant için adım 2 olduğu gibi tüm suşların çizgiler sonra dikkat edin. Coelicolor S. veya ne zaman yeni Streptomyces türleri karakterize venezuelae, S. gibi iyi çalışılmış bir tür olan için yeni izole karşılaştırmak. Not temel şekli, koloni yüzey gibi özellikleri (Şekil 1) (bulanık, kel, buruşuk, vb), opaklık, yükseklik ve pigmentasyon (ayırt bitkisel miselyum, hava miselyum ve/veya çevredeki orta arasında).</li>
	<li>Bir MS agar plaka ve çizgi vahşi tipi ve mutant suşları kama desen (Şekil 1) etiketleyin. Hiçbir zorlanma çapraz bulaşma önlemek için başka bir soy dokunur dikkat et. Not suşları tabağa çizgili saat ve tarihi. Tabak 30 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Yetişkin Petri yemekler arka homojenize için renkli veya beyaz kağıt yerleştirin. Kağıt soy adı, tarih, inkübasyon sıcaklığı ve süresi üzerinde çizgiler ilk tabaktan yazmak. Plaka dijital resim karışıklık simge durumuna küçültülmüş Kağıt arka plan üzerinde yazılı ikinci bilgi ile alın. Not: Eğer şekil hazırlık için kullanılmak üzere yazılı fotoğraftan daha sonra kırpılmış olarak.</li>
</ol>7. aşama-kontrast mikroskobu gerçekleştirmek
<ol><li>Cımbız % 70 etanol yıkama ve sonra etanol buharlaştırma Bunsen burner alev tarafından sterilize. Soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Coverslips % 70 etanol yıkama ve sonra onları steril Petri kabına içinde kuru izin tarafından sterilize.</li>
	<li>
Coverslip Asansör incelenmesine bakterilerin büyüme hazırlayın.
	<ol>
<li>Steril bir coverslip kadar steril cımbızla almak ve bakteriyel büyüme yoğun nerede coverslip bir MS agar tabağa yerleştirin. Coverslip arkasında cımbızla bakteriyel Sporlar ve hava miselyum yeterli transferini sağlamak için hafifçe bastırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip plaka almak ve hücre malzemesi yanında mikroskop slayt yüzeyinin % 50 gliserol suda montaj için hazırlanan bir 15 µL damla ile doğru bakacak şekilde yerleştirin. Hava kabarcıkları yanında duvar ilanı coverslip slayt 45 ° açıyla azaltmak ve % 50 gliserol düşmesine izin.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Mühür ve netlik slayt korunması için cilası.</li>
	<li>
Frohlich40 yaşam döngüsü sırasında çeşitli zaman aralıklarında açıklandığı faz kontrast mikroskobu gerçekleştirin. Not: Yinelenen görüntüleme için daha kapsamlı bir analiz ve gelişmede gecikmeler algılama yeteneğini sağlar. Bağımsız gözlemler hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlamak için yineleyin.<ol>
<li>Hazırlanmış slayt mikroskop sahnesinde yerini ve kapak notu ortasına doğru bir damla daldırma yağı ekleyin. 100 X faz amacı yerleştirin ve kondansatör taret uygun "eşleştirme" faz ayarına döndürün. Objektif lens yağ ile temas halinde olduğunu bir kez sadece hassas ayar düğmesi kullanarak görüntüyü odaklan.</li>
		<li>Birkaç alanları mutant suşları ve form Sporlar, spor boyutu ve şekli ve genel sayısını (bkz. Şekil 2) Sporlar, yeteneği gibi vahşi türü arasındaki fark ve tutarlı farklılıkları ayırt etmek görüş inceleyin. Not: Faz kontrast mikroskobu alternatifleri fark girişim kontrast (DIC) mikroskopi40 içerir ve kristal violet boyama gibi parlak alan mikroskoplar41, basit boyama teknikleri için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. gerçekleştirmek floresans mikroskobu
<ol><li>Cımbız % 70 etanol yıkama ve Bunsen burner alev çalışan tarafından sterilize.</li>
	<li>Steril bir coverslip kadar steril cımbız ve bakteriyel büyüme belirgin nerede yer bir MS agar plaka üzerinde almak. Coverslip arkası bakteriyel Sporlar ve hava filamentler yeterli transferini sağlamak için cımbız ile hafifçe dokun.</li>
	<li>Coverslip plaka almak ve böylece hücre malzemesi ile yan, coverslip manipülasyon kolaylığı için kartlar üzerinde karşı karşıya olduğu yer.</li>
	<li>Coverslip buz gibi metanol (20 x 20 mm2 coverslip için ~ 300 µL) ile sel ve tamamen kuru hava girsin. Dikkat: Bir alkil metanol var. Cilt ile doğrudan temas önlemek.</li>
	<li>Coverslip yavaşça dağıtımı ve çözüm kaldırma fosfat tamponlu tuz (PBS)42 yılında üç kez yıkayın.</li>
	<li>100 μg/ml Propidium iyodür 15 µL eklemek ve/veya 10 μg/mL buğday-mikrop-Agglutinin % 50 gliserol etiketli mikroskop slayda yapılan floresein isothiocyanate (WGA-FITC) Birleşik. Not: Propidium iyodür DNA WGA-FITC hücre duvarı yeşil lekeleri ise kromozom DNA konum algılamak için kırmızı leke bırakır.</li>
	<li>Coverslip ön yüzü aşağı dönük floresan leke cam slayt üzerinde damla üzerine tersine çevirin. (İsteğe bağlı) slayt korunması için açık oje ile kapatın.  Boya ışığa duyarlı olduğu gibi 15 dakikalığına bir karanlık veya loş odada kuluçkaya.</li>
	<li>Slaytları bir 100 X objektif lens bir faz kontrast veya propidium iyodür (veya 535/617 nm uyarma/emisyon maxima 'Texas Red' filtre kümesi) ve FITC için epifluorescence uyarma küpleri ile donatılmış DIC mikroskop kullanarak altında gözlemlemek (FITC filtre kümesi veya 490/525 nm uyarma/emisyon maxima).</li>
	<li>Slayt üstünde belgili tanımlık sahne ve kaba ve ince ayar düğmeleri kullanarak odak yerleştirin.</li>
	<li>Başka bir yerde43gösterildiği gibi floresan gözlemlemek.</li>
	<li>Sporlar daha düşük floresan yoğunluğu44ile tanımlanmasına yardımcı olabilir bir ücretsiz görüntü analiz yazılım paketi kullanın.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada Streptomyces araştırmacılar çalışmalar suşları yaymak ve hisse senetleri uzun süreli depolama için hazırlamak için gerekli adımları ekleyerek başlatmak için başlangıç için protokolleri mevcut. Biz o zaman Streptomyces suşları görsel ve mikroskopik karakterizasyonu protokollerde tanımlamak. Fenotipleme gelişimsel mutantlar bazı tipik ilk adımlar şunlardır: 1) vahşi türü kolonileri agar ortamdaki; göre mutant kolonileri görsel muayene 2) faz kontrast mikroskobu; ve 3) sporogenic hava hif floresans mikroskobu. Bu üç adımda görüntülenen fenotip dayanarak, çeşitli teknikler daha da belirli bir yük fenotip farketmek için istihdam edilebilir.
İlk fenotipleme deneyler genellikle yeni tür karakterize, mutantlar ilgi tanımlamak, kısmen mutantlar karakterize ve belirli bir gen tespit bir mutant fenotip üzerinde dayalı tipik rolü ayırt etmek başlamak için kullanılır. Yöntem tanımlamak burada zaten belirlemek ve Streptomyces mutantlar, kusurları ile hücre bölünmesi48,49yılında, de dahil olmak üzere çok çeşitli karakterize laboratuvarları öğretim Üniversitesi'nde kullanılmıştır 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulation55,56, hava miselyum oluşumu57,58, antibiyotik üretim59, ikinci haberci sinyal47ve kromozom segregasyon 60. bu teknikler mutantlar fenotip genel olarak belirleyen hayati ilk adımlardır ve ilgi genlerin rolleri hakkında önemli bilgi büyük miktarda açığa vurmak. Yöntemleri kolayca Streptomyces diğer türler için uzatılabilir ve zaten S. griseus, S. venezuelae, S. uyuzve birçok diğer streptomycetes suşların açıklamak için kullanılmıştır. Burada açıklanan video protokolleri Streptomyces araştırma, alanlar gibi ilaç keşif alanında girerek yeni araştırmacılar için önemli bir kaynak hizmet bekleniyor. Bu antibiyotik direnci kriz ve yeni lisans öğrencisi araştırmacılar küçük dünya girişimi crowdsourcing çabaları katılmadan sayısız sayıda eğitmek mücadele için çalışan yeni öğretim içerir.
Burada açıklanan teknikler, üniversite ve lise sınıf kullanımı araştırma laboratuvarları, video ve metin içinde açıklanan değişiklikleri kullanarak ek olarak kolayca uyarlanabilir. Küçük liberal sanat Koleji'nde ilk yıl mikroskobu modülde öğrencisiydi suşları çizgi, suşlarının agar ortamında yetiştirilen dijital fotoğraf çekmek ve teslim edilmesini sonuçlandı faz kontrast ve floresan mikroskopi gerçekleştirmek güçlü bir Portföy-laboratuar 15 h temsil eden 3 hafta modülün sonundaki çok panelli şekiller. Yaklaşık 160 ilk yıl öğrenciler için 320 roman transposon mutant fenotipleme ilk sorumlu olduğunu. Lisans'da araştırma öğrencileri üç kurumlarında ek mutant ilk fenotipleme ve suşlarının birçoğu sonraki karakterizasyonu'na katılmıştır. Nispeten kısa sürede elde edilen kapsamlı veriler burada açıklanan protokoller değerini göstermektedir. Ek mutantlar yüzlerce gelecekteki karakterizasyonu için gliserol mycelial hisse senedi olarak depolanmıştır.
Burada açıklanan ilk deneyler çeşitli yöntemler için ilgi suşları ile ilgili bilgilerin kalitesi genişletmek için istihdam edilebilir. Mutasyon bilinmiyorsa, Genotipleme yöntemi türü ve/veya mutasyon konumunu belirlemek için istihdam edilmelidir. Örneğin, rastgele transposon mutagenesis vahşi-türü kromozom6,7,8,9,10,11,12,13 sonuçları ilk fenotipik ekranlar yukarıda açıklananlar gibi geçmesi kolonilerde. O zaman transposon konumunu ters polimeraz zincir reaksiyonu (iPCR)61gibi bir teknik kullanarak tespit edilmelidir. Yeni keşfedilen mutantlar genotip belirleme ilk karakterizasyonu takip önemli bir adımdır.
Sınıfta belirtilen veya daha fazla araştırma yoluyla araştırdı sonraki fenotipleme analiz için yaygın olarak kullanılan bazı gelişmiş yöntemleri protein ilgi için yerelleştirme desenleri belirlemek için etiketleme yeşil flüoresan protein (GFP) dahil, gen ifade analizleri gibi gerçek zaman kantitatif PCR (qPCR) ve küresel gen ifade desenleri vahşi-türü mutant RNA sıralama (RNA-seq) üzerinden karşı. Fenotipleme becerileri de genetik uluslara analiz için gereklidir. Uluslara deneyde bir gen vahşi tipi kopyasını bir mutasyona uğramış yeni eklenen alleli kaybı-in-fonksiyonu için mutasyona uğramış alleli telafi edebilirsiniz olup olmadığını belirlemek için girmiştir. Hem özgün mutant ve ebeveyn için çıkarılan zorlanma fenotip karşılaştırarak, vahşi tipi zorlanma gereklidir.

Streptomycetes yeteneklerini sekonder metabolitler, ticari olarak mevcut antibiyotikler de gibi anti-tümör üçte dahil olmak üzere çeşitli üretmek için anti-HIV ve anti-paraziter ilaçlar bilinen gram-pozitif, ipliksi toprak bakteri vardır 1. S. coelicolor cins2,3 en genetik olarak karakterize üyesidir ve yöntem tanımlamak burada kullanılan türü. S. coelicolor agar orta büyür bir kapsamlı, dallanma bitkisel miselyum ilerliyor tek bir spor çimlenmesi ile başlar karmaşık bir yaşam döngüsü var. Yaşam döngüsü devam ettikçe, hava filamentler substrat miselyum yüzey gerilimi kırmak ve nihayet olgun, gri pigmentli Sporlar sonuçta dönüştürülen hücrelerin uzun zincirli ayrılır oluşur. Yeni kurulan bu sporlar dağılım sonraki yaşam döngüsü4başlangıcı kabul ettiğiniz anlamına gelir.
Farklılaşma onun karmaşık desen nedeniyle, S. coelicolor bakteriyel geliştirme çalışma için mükemmel bir model olarak hizmet vermektedir. Tarihsel olarak, mutasyonlar bloklar halinde iki büyük gelişimin için neden ve farklı görsel fenotipleri üretmek. Bld (kel) mutantlar hava miselyum oluşumu ve bulanık bir hava miselyum "kel" koloni görünüm imparting eksikliği sonucu için engellenir. Mutantlar spore oluşumunda inhibe ve olgunlaşma kabul edilir WHI (beyaz) mutantlar olarak çünkü onlar genellikle vahşi-türü düzeyleri gri spor pigment üretmek başarısız ve hava miselyum beyaz kalır. Diğer ilginç mutantlar antibiyotik üretim, hücre bölünmesi, kromozom segregasyon veya diğer önemli işlemleri4,5inhibe.
Streptomyces türleri birçok gelişimsel genlerin keşfi rağmen orada çok daha var doygunluk mutant ekranlarının eksikliği dayalı inanıyordu. Laboratuarlarımızda biz inşa ettik bir mini transposon sistemini kullanarak yeni gelişimsel genlerin tanımlamak devam edin. Rastgele mutagenesis deneylerde bizim transposon ile izole roman mutant suşları her yeni keşfedilen gen6,7olası rolü tanımlamak için fenotipik tarama geçmesi. Bakteriyel fenotipleme burada anlatılan yöntemleri transposon mutagenesis8,9,10,11,12'izole Streptomyces mutantlar alakalı, 13 ve kimyasal ve ultraviyole (UV) mutagenesis14, hem de recombineering15,16 kullanarak gen silme gibi mutasyonların yönlendirilmiş inşaat gibi rastgele diğer yöntemleri veya CRISPR-Cas9 (kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik tekrarlar) genom teknoloji17,18,2019 ve nokta mutasyonlar düzenleme.
Antibiyotik direnci patojenler arasında giderek yaygın hale geldikçe, yeni antibiyotikler için ihtiyaç giderek daha acil21,22olur. "Küçük dünya girişimi" (veya SWI) bir etkili bilim, teknoloji, mühendislik ve matematik (kök) antibiyotik direnci crowdsourcing üniversite öğrencileri ve daha fazlası ile mücadele etmek için23 ve araştırma stratejisi24 öğreniyor Geçenlerde Lise öğrencileri. Desteklenen kurslar roman antibiyotik (http://www.smallworldinitiative.org) üretmek yeni toprak mikroplar belirleme çalışmaları içermektedir. Bu önemli bir kaynağı keşfedilmemiş antibiyotik Streptomyces türleri toprak geniş bir alanda bulundu ve habitatların25,26,27,28su olmaya devam edecektir inanılıyor, 29,31. Son zamanlarda, bizim laboratuvar ve başkalarının çalışmalarını keşfetti ve Morfoloji ve antibiyotik üretim7,32dahil olmak üzere gelişimi, düzenleyen Streptomyces türleri sinyal genler ile karakterize, 33. Değişiklikler bu genlerin ifadesinde bir değişim miktarı ve zamanlama üretilen antibiyotik neden. Yeni tür ve yeni mutantlar antibiyotik üreten yetenekli fenotipleme önemli olmaya devam edecektir. Yeni öğretim elemanları ve öğrencileri büyük katkıda bulunan ilaç keşif alanında olmak gibi bakteriyel fenotipleme eğitimde bu acemi bireylerin başarısı için gereklidir. Ayrıca, bu deneyler yüksek okul kök veya Üniversitesi Mikrobiyoloji eğitim laboratuvarları için uysal vardır. Temel mikrobiyal genetik ilkeleri ayarlama bir öğretim laboratuvarda bir gösteri temsil ederler.

<table><tbody><tr><td>50% Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil (Type DF)</td><td>Cragille&amp;nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Lens Paper</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks (flat)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1,250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Applicators 6&#039;&#039;</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour&amp;nbsp;</td><td>Bob&#039;s Red Mill&amp;nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>VWR amresco life science&amp;nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (Saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL freezer tube</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low (-80 &amp;deg;C) freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Safety Gloves</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Contrast Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Carolina Biological</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Carolina Biological</td><td>706706</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffer saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Free Software</td><td></td></tr><tr><td>100 mL beaker</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L beaker</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L flask</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL flask</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL graduated cylinder</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>500 mL graduated cylinder&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Camera for Microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Examination Gloves (Med)</td><td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

Streptomycetes dünya çapında bulunur ve antibiyotik ve diğer ikincil metabolit geniş bir dizi üretmek evvel türe ait ipliksi toprak olan bakterilerdir. Streptomyces coelicolor laboratuvarda analizler çeşitli mükellef iyi karakterize, patojenik olmayan bir türdür. Fenotipleme yöntem tanımlamak burada S. coelicolor bir modeli streptomycete kullanın; Ancak, yakından ilgili bazı Aktinomiçes yanı sıra tüm üyeleri bu büyük cins, uygun yöntemlerdir. Fenotipleme yeni bir tür ortamda tespit Streptomyces karakterize gereklidir ve mutant suşları yeni izole Streptomyceskarakterize çok önemli bir ilk adım da. Fenotipleme yeterlilik bakteriyel geliştirme, hücre bölünmesi, kromozom segregasyon ve ikinci haberci sinyal çalışma içerir Streptomyces araştırma alanında giren birçok yeni araştırmacılar için önemlidir. Yeni toprak mikroplar yalıtım ile antibiyotik keşif son crowdsourcing öğrenciler için fenotipleme eğitim öğretim elemanları Streptomyces araştırma ve kendi üniversite veya yüksek okul alanına yeni için artan bir ihtiyaç sonuçlandı. Bu el yazması bakteriyel zorlanma yayma, depolama ve görsel ve mikroskobik açmasıyla karakterizasyonu için yöntemler açıklanır. Bu makale okuduktan sonra yeni araştırmacılar (Mikrobiyoloji eğitim laboratuvarları ve vatandaş bilim adamları) Streptomyces suşları işlemek ve görsel karakterizasyonu deneyler başlamak gerekir.

İlk fenotipleme deneyler yeni türler ve suşların karakterize için gerekli olan ve filogenetik ve yeni tür karakterize için kullanılan DNA-DNA hibridizasyon deneyleri için ücretsiz bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Streptomyces mutantlar gibi kimyasal, UV, rastgele mutagenesis yöntemleri kaynaklanan veya transposon mutagenesis genellikle ağar kaplamalar doğrudan, görsel ekranlarda aracılığıyla tanımlanır. Streptomyces kolonileri değişiklikleri fenotip ile karşılaştırıldığında vahşi-tipi, ebeveyn zorlanma için incelenir. Örneğin, bir daha açık renkli hava miselyum gri pigment sporulation bir üründe neden daha düşük düzeyde gösterebilir veya bulanık bir görünüm eksikliği bir blok (Şekil 1) hava miselyum oluşumunda göstergesidir. Birçok streptomycetes bitkisel miselyum veya çevredeki agar pigmentli antibiyotik üretmek. S. coelicolor iki pigmentli antibiyotik gibi iki sigara pigmentli üretir. Actinorhodin mavi pigmentli antibiyotik ve undecylprodigiosin bir kırmızı pigmentli antibiyotik45. İlk görsel koloni ekranlar uğramıştır suşları için tek kolonileri streaking tarafından yayılır.
Potansiyel olarak mutantlar ilginç görsel kimlik suşları için mikroskobik inceleme tabi tutulmaktadır. Faz kontrast mikroskobu vahşi tipi zorlanma bir denetimi (Şekil 2) olarak kullanarak Streptomyces mutantlar için gelişimsel kusurlar, incelenmesi için özellikle uygun. Vahşi türü S. coelicolor kolonileri genellikle bir hava miselyum büyüme MS agar üzerinde 30 ° C'de yaklaşık iki gün ve sporlar uzun zincirleri tarafından büyüme tarafından üç gün üretmek. Yaşam döngüsü biraz daha yavaş veya diğer medya türleri üzerinde daha hızlı ilerleme olacaktır. Bu mutantları vahşi türü olarak aynı büyüme koşullarda gelişimsel kusurlar ve gecikmeler hakkında kararınızı zaman analiz edilecek zorunludur. Kel mutantlar Sporlar agar medyada uzun süreli büyüme sonra neden olabilir. Bir beyaz mutantlar da spor oluşumu için gecikmiş olarak anılacaktır mutantların saygılı bir azalma Sporlar üretmek Sporlar şekli ve/veya boyutu kusurları ile üretilen, bolluk veya sadece üretmek daha düşük düzeyde Olgun, gri spor pigment46 . Başka mutantlar bugüne araştırıldı gecikmiş ya da sinyal molekülleri (Örneğin, döngüsel-di-GMP47) birikimi için etkilenen mutantlar gibi yaşam döngüsü ilerleme hızlandırılmış.
Yukarıda açıklanan ışık mikroskobu tekniği basit bir takip sporulation septa hücre duvarına leke leke kromozom DNA nucleoids ve fluorescently etiketli buğday tohumu agglutinin propidium iyodür kullanılarak floresans mikroskobu olduğunu. Bir kromozom eksik Sporlar, boyama (Şekil 3) boyama azalma görünüyorsa normal tanımlanan daha az DNA içeren sporlar kırmızı propidium iyodür yoksun olacak. Buğday tohumu agglutinin hücre duvarı leke için kullanılabilir ve hücre duvar boyama desenleri (yani, hücre bölünmesi kusurları) farklılıklar görülmektedir. S. venezuelae, son zamanlarda başka bir model olarak kullanılan bir tür suşu Şekil 4 vahşi türü içinde streptomycete daha hızlı yaşam döngüsü ve sıvı45', sporulate yeteneği nedeniyle lekeli WGA-FITC ile aydınlatmak için genellikle erken sporulation sırasında görülür bölünme septa merdiven benzeri dizisi.
Burada açıklanan ilk fenotipleme stratejileri aşağıda sonuçlanmalıdır: 1) için daha fazla çalışma; ilgi mutant suşları tanımlaması 2) yeni tanımlanan mutant ve mutasyona uğrattı genin potansiyel rolü hakkında edinilen bilgi; 3) daha fazla söz konusu gen rolünü netleştirmek için kullanılan sonraki deneysel adımlar izleyen bir dizi formülasyonu. Çevre yeni saptanan streptomycete durumunda araştırmacı bilgi zaten karakterize Streptomycestürleri karşılaştırıldığında potansiyel yeni türlerin kazanacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> Resim 1: S. coelicolor, makroskopik koloni fenotipleri gösteren bir temsilcisi agar plaka fotoğrafı. Agar plaka bulanık, gösterir gri görünümünü hava miselyum vahşi tipi S. coelicolor için zorlanma MT1110 (WT) çeşitli rastgele transposon ekleme gelişimsel fenotipleri mutantlarla ile karşılaştırıldığında. Mutantlar da bir hava miselyum [kel (bld)] veya azaltılmış spore pigmentasyon [Beyaz (WHI)] ile bir hava miselyum eksik vardır. Transposon mutantlar ekleme mutagenesis6,7için mini-Tn5 kullanarak oluşturulan. Suşları MS agar üzerinde 30 ° C'de 5 gün boyunca yetiştirilmiştir Petri kabına çapı, 100 mm.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> Resim 2: bir temsilcisi hava gösterilen faz kontrast filmler filaman için S. coelicolor beyaz mutant suşları içeren rasgele transposon ekleme mutasyonlar. (A)gösterildi olduğu zaman uyumlu, düzenli aralıklı hücre bölünmeler, eşit olarak üreten uğramıştır bir temsilcisi vahşi tipi hava filament şeklinde ve Sporlar (MT1110) boyutlu. (B-F) Kalan panel çok farklı mikroskobik fenotipleri rasgele transposon mutagenesis yolu ile izole edildi çeşitli beyaz mutantların göster. Panel B sporulation uğramıştır değil, ancak bunun yerine filaman içinde şişkin alanlarda üretti bir hava filaman gösterir. C, Dve F uzun oklar mutantlar MIC42, MIC43 ve TH49 karakteristik anormal derecede büyük Sporlar gösterir. D panelinde kısa ok lysed spor bölmesi örneği gösterir. Panel E tipik mutant TH10 tarafından üretilen spor zincirlerinin kısmen dar küçük bölmeleri gösterir. Suşları MS agar üzerinde 30 ° C'de 5 gün boyunca yetiştirilmiştir Bu Şekil 1' de gösterilen alakasız mutantız. Bir vahşi türü spor yaklaşık 1.1 µm uzun ekseni üzerinde olduğunu. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> Şekil 3: S. coelicolor mutant kromozom segregasyon fenotipleri gösterilen temsilcisi filmler. (A) A diyagramı temsil gösterir (her spor kromozom DNA içeren) Sporlar zinciri için tipik vahşi-tipi, düzenli aralıklı boyama görünümü bir kromozom görüntüler bir mutant için aralıklı boyama deseni ile karşılaştırıldığında segregasyon kusur. (B) panelleri her çifti aynı spor diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntü sol tarafından zinciri gözlenen ve propidium iyodür lekeli floresan görüntü sağ tarafta gösterilir gösterir. Vahşi-türü fenotip (a, b) iki rasgele transposon ekleme mutantlar için (c, d ve e, f) karşılaştırılır. Oklar Sporlar DNA yoksun gösterir. Suşları MS agar üzerinde 30 ° C'de 5 gün boyunca yetiştirilmiştir Gösterilen resim 1 ve Şekil 2ilgisiz mutantız. Ölçek çubuğu 1 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> Şekil 4: Floresan test S. venezuelae vahşi tipi baskı lekeli WGA-FITC ile. Bir hava filaman (A) A diyagramı yok girintilerine ile pürüzsüz ve sporulation faz kontrast mikroskobu ile karşılaştırıldığında sporulation erken bir aşamada gösterir hücre duvar boyama merdiven gibi dizi kullanarak görünür belirtisi atanmış WGA-FITC floresans mikroskobu altında kullanma o aynı filaman olarak başladı. Vahşi-türü S. venezuelae(B) Filmler. (bir) düzgün hava filamentler Sporlar zincirleri arasında bulunur. (b) panel gösterilen miselyum içinde bir, bir hava filaman geliştirme erken bir aşamada hücre duvarı yükünün bir merdiven gibi dizi sahiptir. Oklar, çapraz-duvarlar düzenli aralıklı oluşumu WGA-gelişimsel olarak ilişkili sporulation uğrar gibi o zaman uyumlu olarak içinde tek bir hava filament geliştirmek FITC tarafından lekeli gösterir. Zorlanma MYM (Maltose, YDoğu özü, Malt özü) MYM agar 38 h 30 ° C'de için üzerinde büyüdü Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants at JoVE.com

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Burada acemi protokollerde araştırmacılar için farmakolojik önemli bakteriyel cinsi Streptomycesfenotipleme başlatmak için mevcut.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.9K Görüntüleme.  Otterbein University. Burada acemi protokollerde araştırmacılar için farmakolojik önemli bakteriyel cinsi Streptomycesfenotipleme başlatmak için mevcut.

Video: Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genetik

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Biyokimya

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biyoloji

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Oksidatif stres nedeniyle Mitis grubu streptokok Caenorhabditis elegans içinde eğitim

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme<em&gt; S. venezuelae</emBir mikroakışkan Cihaz Kullanımı&gt; Yaşam Döngüsü

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

Bir Memeli Konağında Aktif Enfeksiyon Sırasında Candida albicans Mutant Suşlarında Morfogenez Fenotiplerini Taramak için In Vivo Görüntülemenin Kullanımı

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

S. cerevisiae "adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Oksidatif stres nedeniyle Mitis grubu streptokok Caenorhabditis elegans içinde eğitim

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

Bir Memeli Konağında Aktif Enfeksiyon Sırasında Candida albicans Mutant Suşlarında Morfogenez Fenotiplerini Taramak için In Vivo Görüntülemenin Kullanımı