1. Kimyasal Mutajenez Not: Biz replikatif RB formu EB formu daha kimyasal mutagenez için daha uygun olduğunu buldu. Orta döngüsü (hpi 18 ile 20 arasındadır arasında), RBS önce RB-EB geçiş için en büyük numaraları altındadır. Chlamydia trachomatis, zorunlu hücre içi patojen olduğu için, ana sağlık mutajen etkileri bakteriyel kurtarma sınırlayabilir. Vero hücreleri, test edilen diğer hücre hatları EMS daha yüksek düzeyde yan etkilerine daha dayanıklı olduğu bulunmuştur. Rekombinasyon yoluyla mutasyonlar ayrılması antibiyotik dirençli rekombinant soyu için seçimi gereklidir. Biz rekombinant analiz ve izogenik suşları izole etmek yeteneği mutantlar oluşturmak için ilaca dirençli suşlar (örneğin rifampin, spectinomycin veya trimetoprim) kullanmanızı öneririz. Antibiyotik dirençli suşlar basamaklı bir seçme işlemi (15, 16) tarafından oluşturulmuştur. DeğilE: Chlamydia trachomatis (gerginlik L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) BSL2 patojendir. Bu patojenler işlemek için kurumsal standart işletim prosedürleri (SOP) bakın. <ol><li> Kültür hücrelerinin ve enfeksiyon hazırlanması: <ol><li> 25 cm 2 (T25) Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş, 3 ml tohum şişesi başına yaklaşık olarak 1 x 10 6 Vero hücreleri (ATCC CCL-81). 37 ° ° C,% 5 CO 2. Hücreler 24 saat içinde bir konfluent tek tabaka oluşturmalıdır. </li><li> Orta aspire. Orta 3 ml&#39;lik bir toplam hacim içinde 5 (14 x 10 ~ 6) &#39;lik bir enfeksiyon çokluğu (mol) (DMEM, 200 ng / ml&#39; cyclohexamide,% 10 FBS) da Chlamydia Vero hücreleri konfluent T25 şişeleri Infect. </li></ol></li><li> 18 saat sonrası enfeksiyon (hpi) de mutasyon başlayın: <ol><li> Fosfat içinde 20 mg / ml, EMS (etil metansülfonat) hazırlayın tuzlu su (PBS) 0.9 mM kalsiyum ile tamponlanmışEMS gibi kimyasal bir güvenlik kabini klorür ve 0.49 mM magnezyum klorür, uçucu bir sıvıdır. Not: EMS güçlü bir mutajen ve kanserojen. EMS atık ve 1 M sodyum hidroksit ile dökülmeler, plastik, kağıt ve cam dezenfekte nötralize. </li><li> Ortamı aspire ve PBS / MgCl2 / CaCl2, 3 ml ile bir kez yıkama hücreleri. Oda sıcaklığında davlumbaz bir saat süreyle PBS / MgCl2 / CaCl2, 20 mg / ml &#39;EMS 3 ml&#39; si ile inkübe hücreleri. Vero hücreleri kısa bir süre için inkübatör dışında EMS ve bu koşullar konsantrasyonu hayatta edebiliyoruz. Mutajenize henüz bir kontrol örneği eklemeyi unutmayın. </li><li> EMS içeren orta çıkarın ve mutajen inaktive 1 M NaOH bir kaba koyun. Kalıntı mutajen çıkarmak için 3 ml PBS + MgCI2 / CaCl2, enfekte hücreleri 3 kez yıkayın. 200 ng / ml cyclohexamide ve 25 mg / ml gentamisin ile DMEM/10% FBS 6 ml ve% 5 CO inkübe <sub&gt; 2, 48-72 saat boyunca 37 ° C dereceye kadar. Kapanımlar mutagenez sonra 36 saat hakkında bakteri yoksun görünür. Geri kalanı boş kalır ise 72 saatte kapanım yaklaşık% 10 bakteri ile doldurulur. </li><li> Hipotonik lizis tarafından EBS Özü: Tamamen orta aspire. 10 dakika boyunca hücreleri çıkarmak için 1.0 mL H2O ve kaya ekleyin. En az 10 kez ve aşağı yukarı pipetleme hücreleri lyse. Bir mikrofuge&#39;ye lizat ve 1x son konsantrasyon getirmek için 0.250 ml 5x sakaroz fosfat glutamat tamponu (SPG) ekleyin toplayın. -80 ° C de saklayınız Not: mutagenez seviyesi rifampisin direnç indüksiyonu ile değerlendirilebilir. Rifampisin direnç testi sıklığı, plak 1 x 10 8 ve 7 x 200 ng / ml &#39;si arasında rifampin varlığında bakteri 10 kat seri dilüsyonları. Rifampisin direnç sıklığı kaplama bakteri sayısına bölünmesiyle rifampisin dirençli plak sayısı olarak tanımlanır. Plak talimatlar için aşağıdaki bölüme bakın. </li></ol></li></ol> 2. Plak Arıtma tarafından Chlamydia trachomatis Mutant Suşlarının klonal izolasyonu <ol><li> 6 kuyucuğu Vero hücrelerinin konfluent mono tabakaları ayarlayın: Tohum ~ 0,4 de başına 3 ml DMEM/10% FBS x 10 6 hücre. Hücreler ve sonraki 24 saat boyunca homojen bir tabaka oluşturur izin verin. </li><li> Buz üzerinde mutajenize Chlamydia stok solüsyonu çözülme. DMEM/10% FBS seyreltme başına 200 ul toplam hacim içinde 6 x 10 kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve buz üzerinde ayarlayın. Not: dahil oluşturan birimlerde Bakteriyel titresi (IFU) plak oluşturan birim bir iyi bir tahmin (pfu) &#39;dir. Plak 10, 100 Amaç ve 1000 pfu. </li><li> Oyuk başına 3 ml PBS ile iki kez Vero hücreleri yıkayın. </li><li> 6-delikli plakalardaki ve iki kopya halinde bakteriyel seyreltmelerinden 100 ul için her bir oyuğa 3 ml DMEM ekleyin. Swirl bile karışım sağlamak için plaka. </li><li> 15 C&#39;de 30 dakika boyunca 2700 x g&#39;de enfekte plakaları Spin ° C&#39;de daha sonra bir nemlendirilmiş 37 ° C&#39;de inkübe edilir,1-2 saat% 5 CO 2 inkübatör. </li><li> 0.54% DMEM agaroz (6 kuyu için) hazırlayın: <ol><li> 18.9 ml soğuk 2x DMEM, 4.2 ml FBS, 0.42 ml 100x NEAA, 0.042 ml 200 ug / ml cyclohexamide, 0.021 ml gentamisin 50mg/ml: Aşağıdaki maddeleri ekleyin. İyice karıştırın. </li><li> Kümeleri önlemek için karıştırarak, sıcak steril% 1.2 agaroz / H 2 O 18.9 ml karıştırın. Karışım dokunmak sıcak olmalıdır. Enfekte hücreler ilave edilmeden önce 55 ° C&#39;de bir sıcak su banyosunda tutun. </li></ol></li><li> Yemekleri bakteriyel süspansiyon aspire ve 6 ml 0.54% agaroz / DMEM başına iyi geçerlidir. Agaroz 15 dakika kaput dışında oda sıcaklığında tamamen katılaşmaya izin verin. Kapaklar 15 dakika için biyo-güvenlik kaputu, kaldırılmış olan plakalar kurutun. Not: biyolojik çevreleme Kukuletadan Titreşim sertleĢtirme agaroz bozabilir. </li><li> 7-10 gün boyunca CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. Plaklar bir mikroskop yardımı ile görünür olmalıdır. (Replaklar tipik bir görüntü için Şekil 3 fer). </li><li> Önce izole mutant bir gün önce, tohum, 1 x 10 100 ul içinde kuyu başına 96 oyuklu bir plaka içinde 4 Vero hücreleri. Hücreler 24 saat içinde birleşik olacaktır. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak işaretleyiniz plaklar alınmayı. Steril bir 1.0 ml bariyer pipet kullanarak plakların fişleri toplayın. </li><li> 100 ul DMEM içinde süspanse plaklar,% 10 FBS, 400 ng / ml &#39;cyclohexamide, 50 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiş. </li><li> Mutant suşlar genişletmek için, Vero hücrelerinin konfluent mono tabakaları üzerine süspansiyon kaplaması. 30 dakika için 2,700 xg, 15 ° C&#39;de plakaları Spin. </li><li> Nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin. 48 hpi gibi erken ve 14 gün kadar geç ortaya çıkabilir hücrelerin&gt;% 50 bulaşmış hasat EBS,. Enfekte olmuş hücreleri Bu miktar, canlı bakteri depolanmasını sağlar. Mutant suşlar büyüme oranları ve enfeksiyon farklıdır. Natura büyüyen suşları yavaş izin veryeterli hücre enfekte kadar Lly komşu hücreleri yeniden enfekte. </li><li> Enfekte hücrelerin hipotonik lizis ile EBS Özü: <ol><li> Tamamen orta aspire. </li><li> Steril su 160 ul ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Tam parçalama sağlamak için birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve hücreleri bozabilir, çapraz bulaşmayı önlemek için bariyer ipuçlarını kullanın. </li><li> Mikrofüj tüplerine lizatları 160 ul aktarın. </li><li> 5x SPG 40 ul karıştırın. -80 ° C de saklayınız </li></ol></li><li> Ilgi fenotip (ler) için Testi ve ekran mutantlar. </li></ol> 3. Seçilen Chlamydia Mutants Genom Dizileme <ol><li> Ev sahibi DNA kirlenmesine büyük ölçüde ücretsiz degrade-saflaştırılmış EBS, genomik DNA ayıklayın. EBS, Chlamydia ve saflaştırılması büyük ölçekli kültür protokolleri ref bulunabilir. (17). Ext ticari genomik DNA arıtma kitleri (örneğin Qiagen kat. 69.504) kullanınüretici yönergeleri izleyerek 2 x 10 9 bakteri DNA ract. </li><li> Doğru DNA miktarını ölçmek için bir flüorometre (Qubit, Invitrogen kedi. Q32866) kullanın. Arıtılmış DNA 1-5 ug Illumina sekanslama platformu için gereklidir. Not: Birkaç platformlar Illumina/Solexa- ve katı bazlı sistemler de dahil olmak üzere bakteriyel genom sekansı, için kullanılabilir. Biz kısa yüksek yoğunluklu üretir gibi HiSeq (Illumina) kullanmayı seçti, ama kaliteli sıralama okur. Bu IonTorrent (Life Technologies) ve MySeq (Illumina) gibi daha küçük ölçekli genom sequencer, çok uygun ve yeterli genom montaj için 25X en az kapsama aşan bir zamanda, 4 Chlamydia genom kadar bu quencing çoğullama için fazlasıyla yeterli. Illumina platformu için DNA sekanslama kütüphanelerinin hazırlanması aşağıda tarif edilmiştir. </li><li> Içinde S220 bir Adaptif Odaklı Akustik kullanarak uygun boyuta parçası DNA (Illumina dizi için 300-400 baz çifti)üreticinin önerilen ayarlarına göre (Covaris) hususta. Not: Örnek aerosol nedeniyle örnek daha fazla kaybına nebülizasyon sonuçları DNA parçalanması. </li><li> Üreticinin yönergeleri izleyerek, ticari inşaat kitleri (Illumina FC-102-1001) kullanılarak genomik sıralama kütüphaneleri hazırlayın. Kütüphaneler çok örnekleri toplanmış ve aynı anda sıralı olabilir böyle barkodlu primer (Illumina FC-121-1003) kullanılarak endeksli olabilir. </li><li> Örnekleri sıralama çalıştırın. Bu adım, genellikle ticari hizmetleri veya özel teknik personel tarafından işletilen çekirdek tesisleri tarafından gerçekleştirilir. Kendi prosedürleri ve önerileri uygulayın. </li><li> Illumina okuma (fastq formatında) da SNP / mutasyon tanımlanması için kullanılabilecek, bu (Biomatters) Geneious olarak, kullanıcı dostu grafik kullanıcı arayüzü yazılımı kullanarak bir referans genom için monte edilebilir. Haritayı mutasyonlar için, en az varyant frekans ve minimum kapsama alanı için 50X için% 90 parametrelerini ayarlamak. Açık sourcBu tür MTÖ&#39;nin (18) ve İKD&#39;nin (19), e genom birleştiriciler, aynı zamanda kullanılabilir. </li><li> Sanger sekanslama yoluyla mutasyonlar tekrarlayın: Sanger sekanslama ile arıtılmış veya (1:20) kullanılarak PCR ürünler, seyreltilerek tanımlanan mutasyonlar ve dizi komşu 300-500 bp&#39;lik bölgelerin PCR amplifikasyonu için şablon olarak genomik DNA testi. </li></ol> 4. Chlamydia rekombinantlar üretimi Not: Chlamydia enfeksiyonu sırasında DNA alışverişi yapabilir, bu rekombinant soylarının üretimi (12, 13, 20) izin verir. Sonra iki eşsiz antibiyotik dirençli suşlar, rekombinant &quot;soy&quot; ile hücre ko-enfeksiyonu (12, 13), çift antibiyotik direnç için seçilebilir. Biz mutasyonlar ayırmak ve ortak izogenik suşları oluşturmak için bu olay yararlandı. Bu nedenle, mutant suşlar (CTL0567 (rpoB) örneğin rifampisin direnci (rif R) H471Y) antibiyotik dirençli arka planda oluşturulan onlar vahşi bir suşu bearin için geçti olabilir böylega farklı antibiyotik dirençli alel (örneğin spectinomycin direnci (spc R), r01/r02 içinde G1197A (16SRNA 1 ve 2 kopya)). Chlamydia DNA alışverişi ve rekombinasyon ile ilgili ayrıntılı bilgi için, referanslar (12, 13) bakınız. <ol><li> 24 kuyulu bir levha üzerinde büyütülen Vero hücreleri konfluent tek tabaka üzerine her suşundan centrifuging6 x 10 5 bakteriler tarafından vahşi tip ve mutant klonal Co-enfekte. Buna paralel olarak, tek başına her bir suş ile tek katmanlarını enfekte. </li><li> 44 de hpi, enfekte hücrelerin hipotonik lizis ile hasat EBS: <ol><li> Tamamen orta aspire. </li><li> Steril su, 0.4 ml eklenir ve 10 dakika boyunca bekletilir. </li><li> Güçlü en az 10 kez aşağı yukarı pipetleme hücreleri lyse. Transfer mikrofuge&#39;de tüp lizatları. </li><li> 1x SPG arasında son bir konsantrasyon için 5x SPG 0.1 ml olarak karıştırın. </li><li> Ham lizatları hemen kullanılabilir veya -80 saklanabilir ° C </li></ol></li><li> Ham EB Plaketi 50 ul bir Hazırlık sınıflarıd 5 agaroz / DMEM x 01:10 seri seyreltme rekombinantlar seçmek için uygun antibiyotik ile desteklenmiş. (Rekombinantlar seçimi için tipik bir antibiyotik konsantrasyonları için tabloya bakınız.) </li><li> Plak arındırmak ve yukarıda rekombinant suşlar zenginleştirmek. İstenen fenotip varlığı ya da yokluğu için puan rekombinantlar. Mutasyonların varlığı veya yokluğu için genotipleme amacıyla DNAzol tedavisinde (bir sonraki bölüm) ile rekombinant DNA suşu çıkarın. </li><li> Haçlar daha mutasyonlar ayırmak ve izogenik suşları oluşturmak için diğer antibiyotik direnç işaretleri taşıyan suşları ile tekrar edilebilir. Farklı bir antibiyotik işaretleyici taşıyan başka vahşi bir suşu için seçilen rekombinantlar Co-enfekte. </li></ol> Tablo 1: rekombinantlar seçilmesi için antibiyotik konsantrasyonları: <table border="1"><tbody><tr><th> Final Konsantrasyon </th><th> Hazırlık talimatları </th></tr><tr><td> 200 ng / ml &#39;rifampisin </td&gt; <td> 25 mg / dimetil sülfoksit (DMSO) içinde depolama ml stok yapmak. H 2 O ile depolama stok seyreltilmesi ile 200 mg / ml çalışma çözüm Makyaj Karanlıkta -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td> 200 mg / ml trimetoprim </td><td> DMSO içinde 100 mg / ml &#39;lik stok olun. -20 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> 200 ug / ml spektinomisin </td><td> 100 ul hacimde su içinde bir 100 mg / ml &#39;lik stok olun. -20 ° C&#39;de saklayın Tekrarlanan donma çözülme kaçının. </td></tr></tbody></table> 5. Genotipleme için rekombinant soylarından genomik DNA ekstraksiyonu Not: Kolon tabanlı arıtma kitleri de kullanılabilir. DNAzol tedavi ile DNA izolasyonu bir avantajı maliyetidir. <ol><li> 12 oyuklu plakalar üzerinde büyütülen Vero hücrelerinin tek katmanlarını üzerine, 1.2 x 10 5 klamidyalar Infect. </li><li> 36-48 hpi de, orta aspire ve DNAzol (Invitrogen 10.503-027) içinde 0.375 ml ekleyin. Yavaşça hücreleri ve pipet lysa ajitasyon1.5 ml mikrofüj tüpüne TES. </li><li> % 100 etanol içinde 0,188 ml ilave edilerek çökelti DNA. Tersine çevirerek karıştırın. </li><li> Bir pipet ile biriktirme DNA ayıklamak ve temiz bir tüp yerleştirin. Alternatif olarak, pelet, oda sıcaklığında 2 dakika ya da 4 ° C arasında ve süzün süpernatant boyunca en yüksek hızda santrifüj ile DNA. </li><li> Yıkama DNA% 75 etanol içinde 1.0 ml &#39;si ile iki kez hızlandırabilir. </li><li> 15 saniye için etanol kaldırılmasından sonra açık havada kurumaya DNA. </li><li> 0.2 ml 8 mM NaOH&#39;tır daha sonra 0.1 M HEPES, 20.2 ul ile pH 8.0 &#39;a nötralize ile DNA çözünürleştirilir. Su ya da TE 0.5 ml &#39;lik bir son hacme kadar getir. Alternatif olarak, TE tampon tekrar süspansiyon DNA (DNA pelet tamamen çözünür olmayacaktır.). </li><li> Tanımlanan mutasyonlar yan 300-500 bp bölgelerin PCR amplifikasyonu için şablon olarak DNAzol-edilen DNA kullanın. Dizi arıtılmış veya Sanger sekanslama ile (1:20) kullanılarak PCR ürünleri seyreltilmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Haggerty, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+sequelae+after+Chlamydia+trachomatis+genital+infection+in+women.">Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women.</a> J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).</li><li>Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+mechanisms+of+Chlamydia+entry.">Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry.</a> Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).</li><li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Chlamydia+trachomatis+entry+into+nonphagocytic+cells.">Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells.</a> Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).</li><li>Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+intractable+-+approaching+the+genetics+of+Chlamydiales.">Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales.</a> Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).</li><li>Stephens, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+an+obligate+intracellular+pathogen+of+humans,+Chlamydia+trachomatis.">Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis.</a> Science. 282 (5389), 754-759 (1998).</li><li>Thomson, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis,+genome+sequence+analysis+of+lymphogranuloma+venereum+isolates.">Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates.</a> Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).</li><li>Harris, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+diverse+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+phylogenetic+relationships+masked+by+current+clinical+typing.">Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing.</a> Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).</li><li>Somboonna, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypervirulent+Chlamydia+trachomatis+clinical+strain+is+a+recombinant+between+lymphogranuloma+venereum+(L(2))+and+D+lineages.">Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages.</a> MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).</li><li>Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydia+psittaci+genome,+a+comparative+analysis+of+intracellular+pathogens.">The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens.</a> PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).</li><li>Jeffrey, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+recent+clinical+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+loci+associated+with+tissue+tropism+and+regions+of+apparent+recombination.">Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination.</a> Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).</li><li>Gomes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Chlamydia+trachomatis+diversity+occurs+by+widespread+interstrain+recombination+involving+hotspots.">Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots.</a> Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).</li><li>DeMars, R., Weinfurter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+gene+transfer+in+Chlamydia+trachomatis+in+vitro,+mechanism+and+significance.">Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance.</a> J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).</li><li>Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+gene+transfer+in+vitro+in+the+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis.">Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis.</a> J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).</li><li>Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches.">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li><li>Tipples, G., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+initial+characterization+of+a+series+of+Chlamydia+trachomatis+isolates+selected+for+hydroxyurea+resistance+by+a+stepwise+procedure.">Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure.</a> J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).</li><li>Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+trimethoprim-+and+sulphisoxazole-resistant+Chlamydia+trachomatis.">Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis.</a> Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).</li><li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Laboratory+Maintenance+of+Chlamydia+trachomatis.">Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).</li><li>Li, H., Ruan, J., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+short+DNA+sequencing+reads+and+calling+variants+using+mapping+quality+scores.">Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores.</a> Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+transfer+of+tetracycline+resistance+among+Chlamydia+spp.+in+vitro.">Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).</li><li>Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incision+by+UvrABC+excinuclease+is+a+step+in+the+path+to+mutagenesis+by+psoralen+crosslinks+in+Escherichia+coli.">Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis,+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Bu genotipleri ve fenotipleri arasında bağlantı kurar gibi bu yöntem genetik analiz için temel gereksinimlerini karşılar. Önemli olarak, bu rekombinant DNA dönüşümü ve sık olmayan modeli mikroplar gen fonksiyonu analizinde bir oran-sınırlayıcı bir adımdır bakteri genleri girmeyle inaktivasyonu için geleneksel moleküler araçlar yardımı olmaksızın elde edilir. Kritik bir adım plak-saf mutantlar klonalitesi sağlamaktır. Vahşi tip veya &quot;tesisatçı&quot; mutan...

Ilişkili olan ABD&#39;de yılda yaklaşık 2.8 milyon genital sistem enfeksiyonları (Hastalık Kontrol Merkezi) sekel gibi pelvik inflamatuar hastalık, ektopik gebelik ve infertilite (1) olarak için zorunlu hücre içi bakteri Chlamydia trachomatis hesapları. Chlamydia spp benzersiz var bulaşıcı ama olmayan kopyalayan temel vücut (EB) ve bulaşıcı olmayan ama replikatif ağsı vücut (RB): iki şekilde oluşan bifazik gelişim döngüsü ile fizyolojisi. Enfeksiyon endoctyotosis (2) takip epitel hücrelerine EBS eki ile başlar. Bir membran-bağlı vakuol bir dahil olarak adlandırılan içinde, EBS sonra ikili fisyon tarafından çoğaltır RB formu, içine ayırt. Orta döngüsü olarak, RBS geçişler sonra tekrar enfeksiyon yeni tur başlatmak için hücre dışı boşluğa atılırlar EBS içine zaman konakçı hücre lysis oluşumunu (3). C. trachomatis olanBu bakteri genetiği en çalışmalara merkezi olmuştur hedeflenen gen değiştirme, transpozonlar ve iletici faj, gibi standart moleküler genetik araçları ile rutin manipülasyon dirençli, tek tek Chlamydia genlerin doğuştan gelen bağışıklık kaçırma katkıda ölçüde belirsizdir , besin satın alma, gelişim geçişleri ya da ökaryotik ev sahibi içinde (4) patojen hayatta kalması için önemli diğer işlemler. Sonuç olarak, bu patojen klinik önemi rağmen kötü karakterize kalır. Chlamydia spp genom. Yeni Nesil sıralama teknolojileri kullanarak sıralı birden fazla tür ve biyotipe ile (5) (~ 1 Mb) nispeten küçük. WGS tarafından Karşılaştırmalı genom analizi virülans faktörlerinin potansiyel fonksiyonu (9, 10) gibi bazı bilgiler sağlamıştır klamidya türleri ve insanlar (6-8) ve bir ölçüde kendi uyum evrimi içine benzersiz bir bakış açısı sağlamıştır. Tklinik izolatlar tarafından görüntülenen o genetik çeşitlilik, genlerde mutasyonlar kolayca karşı seçilmiş olurdu muhtemelen çünkü, sistematik en virülans faktörleri fonksiyonu eşleştirmek için gerekli çözünürlüğü sağlamaz. Virülans ölçü hataları, anket edilebilir mutasyon spektrumu genişletmek olabilir tanımlanan deneyleri ile birlikte doğal seleksiyon, mutajen bağlı gen varyasyonu, gelen karıştırıcı etkisi olmadan. Kimyasal mutajen, özellikle, onlar boş, koşullu, hypomorphic (azaltılmış fonksiyonu) oluşturabilir olarak yararlı ve hypermorphic (fonksiyon kazanç) allel vardır. Sağlam nesil genom dizileme teknolojileri gelişiyle birlikte, bu mutasyonlar kolayca tespit ve eşlenebilir. Bu şekilde, güçlü bağlantılar ileri genetik yaklaşımlar uygulama sağlayan bir gen ya da genetik mutant ve yaygın bir fenotip arasında yapılabilir. Klinik suşlarının genom dizileri mozaik b ortayaetween serovarlar ve sık rekombinasyon (11) lokusların. Rekombinasyon ampirik kanıtlar her iki suşları genetik katkı (12, 13) için ortaya çıktı çift dayanıklı rekombinant döl, iki farklı antibiyotik dirençli suşlar ve seçim bir arada enfeksiyon ile gösterilmiştir. Böylece, bir ko-enfeksiyonu ortamda vahşi tip ve mutant suşları arasında genetik değişimi kimyasal kaynaklı mutasyon ayrılması gözlenen fenotipe yol açar etkilenen genin belirlemekte sağlar. Burada kimyasal mutasyon, WGS ve enfekte hücre içinde DNA değiş tokuşu (14) (Şekil 1) için bir sistemine dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif.

<table border="0" cellspacing="0" cols="4">
	<colgroup width="291">
	</colgroup>
	<colgroup width="123">
	</colgroup>
	<colgroup width="144">
	</colgroup>
	<colgroup width="84">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate (EMS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile, tissue culture grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td>
			<td>Lonzo</td>
			<td>50070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA purification kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10503-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mM NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer (Qubit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, cinsel yolla bulaşan hastalıklar ve göz enfeksiyonlarının etiyolojik ajan, rekombinant DNA ile kötü nedeniyle deneysel dönüşümü olan inatçılık için karakterize kalır. Biz C. genetik analiz gerçekleştirmek için bir yaklaşım geliştirdi moleküler genetik araçları olmamasına rağmen trachomatis. Bizim yöntemi içerir: i) hızla farklı fenotipleri ile genetik olarak tanımlanmış mutantlar kapsamlı kütüphaneleri oluşturmak için kimyasal mutagenez ii) tam genom dizileme (WGS) altta yatan genetik lezyonlar eşleştirmek için ve mutasyona uğramış gen (ler) arasındaki ilişkiyi bulmak için ve.. yaygın bir fenotip;. mutant ve yabani tip bakteri, memeli hücrelerinin ko-enfeksiyon yoluyla rekombinant suş iii) üretimi. Buna göre, genotipler ve fenotip arasındaki nedensel ilişkileri kurmayı başardık. Kimyasal kaynaklı gen varyasyonu ve WGS bir bağlantı karşılıklı genotip-fenotip ilişkilerini site kurmakld genetik analiz etmek, inatçı tıbbi ve çevre önemli mikroorganizmaların büyük listesine geniş uygulanabilir.

Mutajene maruz kalma bakteriyel hücre ölümü nedeniyle muhtemelen, bakteri yoksun görünür inklüzyonlar yol açar. Tipik olarak, serovar LGV-L2 tamamen enfeksiyondan 48 saat içinde enfekte hücreleri lize, ancak mutajen ile muamele&gt; 90 saat için bu döngü uzatabilir. Kapanım yaklaşık% 10 kurtarmak bekleniyor. Deneylerde, enfekte edilen Vero hücrelerinde tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında bulaşıcı döl kurtarma% 99 azalmaya neden 20 mg / ml EMS ile muamele edildi. Mutajen tedavi...

Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA&#39;nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

12.8K Görüntüleme.  Duke University Medical Center.  Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir. 

Video: Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Amoebal kokültürü ve Amoebal Zenginleştirme Yaklaşımlar New hücre içi patojenlerin keşif

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.