Dr. Clem Jones AO'nun Mülkünün, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi'nin [GNT1145580, GNT1176326], Metal Vakfı'nın ve Queensland Eyalet Hükümeti'nin (DSITI, Bilim, Bilgi Teknolojisi ve İnovasyon Bakanlığı) desteğini kabul ediyoruz.

Tüm hayvan deneyleri, Queensland Üniversitesi hayvan etik komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Şirket içi mikrokabarcık hazırlama
<ol><li>1,2-distearoil-sn-glycero-3-fosfokolin ve 1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polietilenglikol)-2000] (amonyum tuzu) 9: 1 molar oranını tartın. 1 mL mikrokabarcık çözeltisi başına 0.5 mg lipit karışımı gereklidir. Alternatif olarak, önceden çözünmüş lipitler kullanılarak adım 1.3'e devam edilirse, lipitler zaten kloroformda satın alınabilir.</li>
	<li>Lipiti bir cam beherde küçük bir kloroform hacminde çözün.</li>
	<li>Kloroformu bir evaporatör veya azot akışı ile buharlaştırın.</li>
	<li>Kurutulmuş lipit filmini, 0.22 μm filtreden süzülmüş 10 mL PBS +% 10 gliserol +% 10 propilen glikol çözeltisi ile rehidre edin.</li>
	<li>Rehidrate lipit çözeltisini 55 ° C'ye (lipitlerin erime sıcaklığının üstünde) ayarlanmış bir su banyosu sonikatörüne yerleştirin ve tamamen çözünene kadar sonikat yapın.</li>
	<li>Otoklavlanmış 1.5 mL HPLC şişelerine Aliquot lipit çözeltisi ve septa kapaklarına vida.</li>
	<li>Şişedeki tüm havayı 27 G'lik bir iğne ile donatılmış 5 mL'lik bir şırınga ile aspire edin ve şişede bir vakum oluşturun.</li>
	<li>Birlikte verilen şırınga ile şişeye oktofloropropan ekleyin ve gazı teneke kutudan çekin. Şırıngadaki hacmi okuyarak şişeyi 1-2 mL oktafloropropan ile doldurun.</li>
	<li>Her şişeyi parafin film ile kapatın ve soğutun.</li>
	<li>Deney gününde, şişeyi oda sıcaklığına getirin, şişeye 0,5 mL% 0,9 NaCl çözeltisi ekleyin, ardından şişeyi bir birleştiriciye yerleştirin ve mikrokabarcıkları üretmek için 45 s (önceden ayarlanmış süre) çalkalayın.</li>
</ol>2. Bir coulter sayacı kullanarak mikrokabarcık kalite kontrolü
<ol><li>Mikrokabarcık çözeltisini birleştiriciden çıkarın ve septayı 19 G'lik bir iğneyle delerek gazı şişeden boşaltın.</li>
	<li>19 G iğneli 1 ml'lik bir şırınga kullanarak 5 mL filtrelenmiş akış çözeltisine 100 μL mikrokabarcık çözeltisi ekleyerek iki adımlı 1:5.000 seri seyreltme gerçekleştirerek mikrokabarcık çözeltisini seyreltin ve ardından 100 μL seyreltilmiş mikrokabarcık çözeltisini alarak ve pipet kullanarak bir küvette 10 mL filtrelenmiş akış çözeltisine pipetleyin.</li>
	<li>Elektrolit tankının yeterli akış çözeltisine sahip olduğunu ve atık tankının boş olduğunu kontrol edin.</li>
	<li>Küvet tezgah platformuna yerleştirin ve yerine kilitleyin. Örnek almak için 30 μm'lik bir açıklık kullanın.</li>
	<li>Yazılımda, standart çalışma yöntemini (SOM) yükleyin ve ardından konsantrasyon | SOM Düzenle'yi seçin. 5000x seyreltme girin.</li>
	<li>Yazılımda, uygun bir dosya adı seçin. Örneğin, microbubble_1_date.</li>
	<li>Küvetleri platforma yükleyin ve sabitleyin.</li>
	<li>Yazılımda Çalıştır'ı seçin| Numune konsantrasyonunun% 10'dan az olduğunu önizleyin ve doğrulayın. Bu sayı% 10'dan yüksekse, mikro kabarcıkların daha yüksek bir seyreltme faktörü ile yeni bir seyreltme işlemini gerçekleştirin.</li>
	<li>İlk okumayı elde etmek üzere numuneyi almaya başlamak için 'Başlat'ı seçin.</li>
	<li>Her ölçümden sonra Coulter sayacının açıklığını filtrelenmiş akış çözeltisi ile durulayın. 3 çoğaltma elde etmek için 2.2-2.9 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Seyreltilmiş mikrokabarcık çözeltisi içeren bir küveti bir sonicator su banyosuna yerleştirin ve 30 s boyunca sonikat yapın.</li>
	<li>Çözümü sonikleştirilmiş mikro kabarcıklarla ölçün ve boş olarak etiketleyin.</li>
	<li>Yazılımda, son okumayı ilk okumadan çıkarın. Bu, mikro kabarcık olmayan ve gaz içermeyen parçacıkları çıkarır.</li>
	<li>Mikro kabarcık konsantrasyonunu, boyut dağılımını, ortalama boyutu ve hacim konsantrasyonunu görüntülemek için yazılımda Sonuçları Görüntüle'yi seçin.</li>
</ol>3. Floresan antikor etiketleme
<ol><li>Herhangi bir katkı maddesi olmadan PBS'de 1 mg/mL'lik bir fare IgG çözeltisi elde edin.</li>
	<li>Kitte bulunan üreticilerin talimatlarını izleyerek AlexaFluor 647 ile 0,1 M sodyum bikarbonat tamponunda 1 mg fare IgG etiketleyin. Bu floresan olarak etiketlenmiş IgG miktarı, 5 mg / kg antikor dozunun uygulandığı 5-7 yetişkin farede bu prosedürü gerçekleştirmek için yeterlidir.</li>
	<li>Boyayı 0,1 M sodyum bikarbonat tamponunda IgG çözeltisine ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Antikor çözeltisini bir spin kolonuna pipetleyerek ve 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yaparak floresan etiketli antikoru saflaştırın. Serbest boya sütun yatağında kalacaktır.</li>
	<li>Protein konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Konjugat çözeltinin emiciliğini 280 nm ve 650 nm'de (A280 ve A650) ölçün. Denklemi kullanarak numunedeki protein konsantrasyonunu hesaplayın: Protein konsantrasyonu (M) = [A280 - (A650 x 0.03)] x seyreltme faktörü / 203.000.</li>
	<li>Denklemi kullanarak etiketleme derecesini hesaplamak için bir spektrofotometre kullanın: mol proteini başına mol boyası = A650 x seyreltme faktörü / 239 000 x protein konsantrasyonu (M). NOT: Kabul edilebilir bir etiketleme derecesi, mol proteini başına 3-7 mol boyadır ve tipik olarak elde edilen etiketleme derecesi yaklaşık 6'dır.</li>
</ol>4. Ultrason kurulumu
<ol><li>Fokuslu ultrason sistemini kullanarak, ultrason odağını su bolusunun tabanının 9 mm altına konumlandırmak için 5 mm'lik ara parçayı su bolusuna ekleyin.</li>
	<li>Su bolusunu, 20 dakika boyunca bir inline degazör ile gazdan arındırılmış yaklaşık 300 mL deiyonize su ile doldurun (oksijen içeriği 3 ppm'nin altında olmalıdır). Dairesel diziyi doldurulmuş su bolusuna yerleştirin ve yüzeyde hava kabarcığı olup olmadığını kontrol etmek için bir diş aynası kullanın. Yüzeyde varsa, dairesel diziyi çıkarın ve su bolusunda değiştirin.</li>
	<li>Uygulama yazılımını başlatın. Dalga formu menüsünde, Dalga formu görev döngüsünü ayarla'yı seçin. Ayarlar PRF (Hz) 10, görev döngüsü% 10, odak 80 mm, merkez frekansı 1 MHz, genlik (MPa tepe negatif basıncı) 0.65 MPa, mekanik indeks = 0.65'tir. Dalga formunu tanımlamak ve bellekte saklamak için Set tuşuna basın. NOT: Fokuslu ultrason sistemi, kalibre edilmiş bir hidrofon tarafından alınan ölçümlerden üretici tarafından önceden kalibre edilir.</li>
	<li>Fokuslu ultrason sistemi yazılımında, bir tedavi planı tanımlayın. Bu, birden fazla bireysel tedavi bölgesinden oluşan bir tedavi bölgesi tanımlamayı ve bu tedavi bölgelerinin her birinde alınacak eylemleri tanımlamayı gerektirir. Bu durumda, tedavi bölgesi fare beyninin bir yarımküresidir.</li>
	<li>Hareket denetleyicisi penceresinde, Tara sekmesine gidin ve x boyutunda hareket için başlat, durdur ve artır değerini girin ve y yönünde hareket için değeri başlatın, durdurun ve artırın. X: start -4, stop 3.50 ve Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1 değerlerini girin.</li>
	<li>Tedavi bölgeleri için eylemleri tanımlayın. Hareket denetleyicisi penceresinde, Olay düğmesini seçin. Komut Dosyası Düzenleme Penceresinde, her tedavi yerinde seçilen sırada yürütülecek eylemlerin bir listesini seçin. Hareket Türü'nü komut dosyası penceresinin üst kısmındaki raster ızgarası olarak ayarlayın. Olaylar sekmesinde, bunları komut dosyası paneline taşımak için Eylemler Ekle'yi seçin ve Senkron Olarak Taşı, Tetikleyici arb'yi başlat , bekle, Tetikleyici arb'yi durdur'u ekleyin. Bekle eylemine tıklayın ve 6.000 ms'lik bir bekleme süresi seçin. NOT: Bu ayarlar, tedaviyi 1,5 mm aralıklı 6 x 5 ızgaralı bir tedavi noktası ızgarası haline getirecek ve her bir noktanın tedavi süresi 6 sn'dir. Bir fare beynini sonikleştirmek için toplam süre yaklaşık 3 dakikadır. Bu boyuttaki arıtma ızgarası, yaklaşık 30 g ağırlığındaki yetişkin C57/Bl6 fareler için uygundur. Tedavi noktaları ızgarasının boyutu, farenin boyutuna bağlı olarak yukarı veya aşağı ayarlanabilir.</li>
</ol>5. Hayvan hazırlığı
<ol><li>Fareyi 0,1 g'a kadar hassas bir teraziyle tartın.</li>
	<li>Fareyi intraperitoneal olarak 90 mg/kg ketamin ve 6 mg/kg ksilazin ile anestezi altına alın. Bir ayak parmağı sıkışması ile reflekslerin yokluğunu test edin. Alternatif olarak, fareler uygun bir yüz maskesi ile uygun bir inhalasyonel anestezik aparat kullanılarak izofluran ile uyuşturulabilir. İzofluran kullanılıyorsa, hipotermiyi önlemek için ultrason sırasında fare bir ısı yastığına yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Saçları hayvanın kafasından tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı kullanın, ardından pamuklu bir tomurcukla epilasyon kremi uygulayın, 2-3 dakika veya saçlar nemli bir gazlı bezle temizlenene kadar bırakın. Epilasyon kreminin farenin gözüne girmemesine dikkat edin.</li>
	<li>Farenin kafasının merkezini kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin. Dönüştürücünün merkezinde bir delik vardır ve dönüştürücü odağı ve odak noktası görsel olarak hizalanabilir.</li>
	<li>Daha önce tabanı kesilmiş ve yerine tartım teknesinin tabanına yapıştırılmış plastik bir ambalajla ultrason jeli ile değiştirilmiş küçük bir tartım teknesini doldurun. Bu, 8 mm'lik bir ara parça görevi görür ve farenin kafasına iyi bir bağlantı sağlar ve farenin kafasıyla hizalanmış dönüştürücünün odağının görsel olarak incelenmesini sağlar.</li>
</ol>6. Mikrokabarcık hazırlama
<ol><li>Bir mikrokabarcık şişesini oda sıcaklığına ısıtın. Etkinleştirmek için, şişeye 0,5 mL% 0,9 NaCl çözeltisi ekleyin ve mikro kabarcıkları üretmek için 45 s çalkalamak için bir birleştiriciye yerleştirin.</li>
	<li>Septayı 27 G'lik bir iğneyle delerek şişeyi havalandırın.</li>
</ol>7. Ultrason tedavisi
<ol><li>Mikrokabarcıkların şişesini ters çevirin ve çözeltinin 1 μL / g vücut ağırlığını yavaşça çekin. Buna floresan olarak etiketlenmiş antikor çözeltisi ekleyin ve şırıngada hafifçe karıştırın. Enjekte edilen maksimum hacim 150 μL'dir. NOT: Şirket içinde hazırlanan mikro kabarcıklar, klinik olarak kullanılandan yaklaşık 60 kat daha az konsantredir (örneğin, Definity mikrokabarcıkları). Ses seviyesini veya konsantrasyonu, enjekte edilen mikrokabarcıkların sayısı klinik olarak kullanılanlara benzer olacak şekilde ayarlayın (örn. Belirlilik 1.2 x 108 mikrokabarcıklar / kg vücut ağırlığı).</li>
	<li>Mikrokabarcık ve antikor çözeltisini retroorbital olarak enjekte edin, nazikçe ve yavaşça enjekte etmeye özen gösterin. Ardından, farenin gözlerine oftalmik merhem uygulayın.</li>
	<li>Fareyi baş tutucuya yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve farenin burnunu sabitleyin. Ardından ultrason jeli dolu küçük tartım teknesini başın üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Su bolusunu, tartım teknesindeki ultrason jelinin üzerine oturana kadar indirin.</li>
	<li>Dönüştürücü odağını başın merkezine taşımak için joystick'i kullanın. Hareket sekmesinde Kaynağı Sıfırla'yı seçin.</li>
	<li>7.3-7.6 arası adımlar 2 dakika sürecektir.</li>
	<li>Tutarlılık için, mikro kabarcıkların enjekte edilmesi ile tam taramanın seçilmesi arasında 2 dakikalık bir gecikme olmasını sağlamak için bir zamanlayıcı ayarlayın.</li>
	<li>Tedavi tamamlandıktan sonra, gözlere oftalmik merhem uygulayın ve fareyi ısıtılmış bir iyileşme odasına yerleştirin. İşlem sırasında hipotermi gözlenirse, işlem sırasında ek ısı sağlamak için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirilebilir.</li>
</ol>8. Doku toplama ve işleme
<ol><li>Ultrason uygulamasından sonra ilgilenilen zaman noktasında (beyindeki yüksek antikor seviyelerini tespit etmek için en az 1 saat), fareyi aşırı dozda Pentobarbiton çözeltisi (100 mg / kg) ile derinlemesine anestezi altına alın ve fareyi 30 mL PBS ile transkardiyal olarak perfüze edin. Beyne verilen floresan etiketli antikorları spesifik olarak tespit etmek için iyi bir perfüzyon gereklidir.</li>
	<li>Beyni toplayın ve 4 ° C'de 24 saat boyunca% 4 PFA'ya daldırarak sabitleyin, ardından PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Beyni tepsiye yerleştirerek ve 700 nm kanalda bir görüntü elde ederek beyni kızılötesi bir tarayıcıda görüntüleyin. NOT: Fiksasyondan sonra, beyin PFA'dan çıkarılır, PBS'de yıkanır ve bölümlere ayrılır. Alternatif olarak, 4 ° C'de veya suya batırılana kadar 24 saat boyunca etilen glikol kriyoprotektan çözeltisine yerleştirilebilir ve daha sonra şişe içeren yeni bir kriyoprotektana taşınabilir ve uzun süreli depolama için -20 ° C'ye yerleştirilebilir.</li>
	<li>PBS'de beyin soğuğunu bir vibratom kullanarak kesitleyin. Beyni platforma yapıştırın ve 30-40 μm kesitleri kesin ve PBS'ye toplayın. NOT: Lizozomal otofloresan (yaklaşık 12 aydan daha eski hayvanlardan alınan bölümlerde yaygındır), bakteri üremesini engellemek için bölümlerin bir ışık odası kutusunda, oda sıcaklığında ve azid içeren PBS'de (% 0.02) gece boyunca aydınlatılmasıyla ağartılmalıdır.</li>
</ol>9. Doku boyama ve görüntü alma
<ol><li>Kesitleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke çözeltisine (%0,2 Triton/PBS'de %5 BSA) aktarın, ardından çözeltiyi %0,2 Triton/PBS ile değiştirerek bölümleri 3x yıkayın.</li>
	<li>Iba1 (seyreltme 1:1,000) ve CD68'e (seyreltme 1:500) karşı birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kesitleri inkübe edin,% 0.2 Triton / PBS'de, ardından% 0.2 Triton / PBS ile 3x yıkama.</li>
	<li>Floresan sekonder antikorlarla oda sıcaklığında 2 saat boyunca bölümleri inkübe edin (seyreltme 1:500), ardından sadece% 0.2 Triton / PBS ile 3x yıkama yapın. NOT: Çekirdekler DAPI çözeltisi (0,5 μg/mL) kullanılarak da boyanabilir.</li>
	<li>Bölümleri, sert ayarlı montaj ortamına sahip bir kızağa ve kapak kaymasına aktarın. Görselleştirme ve görüntü alımından önce (gece boyunca) montaj ortamının katılaşması için yeterli zaman tanıyın.</li>
	<li>Konfokal mikroskop ile ultrason hedefli beyin bölgesinin z-yığın görüntülerini (en az 10 μm derinlik ve 0.3 μm adım boyutu, hayvan başına 10 görüntü) konfokal mikroskop ve en az 40x büyütme hedefi kullanarak elde edin. NOT: Sinyal dinamik aralığında görüntü elde etmeye dikkat edin, alt/aşırı pozlamayı önleyin. Görüntü dosyalarını mikroskop tarafından kullanılan ilgili yazılım biçiminde kaydedin.</li>
</ol>10. Görüntü analizi
<ol><li>Görüntü analiz yazılımı dosya içe aktarıcısını kullanarak z-stack mikroskopi dosyalarını dönüştürün.</li>
	<li>Dönüştürülen dosyaları yazılıma açın ve mikroglial hücreleri gözlemlemek için Iba1 kanalının yoğunluğunu ayarlayın.</li>
	<li>Etrafına bir kutu çizerek tek bir mikroglial hücreyi kırpın, 'kırp'ı seçin ve yeni dosyayı kaydedin.</li>
	<li>IBA1 sinyalinin 3B yüzey işlemesini şu şekilde oluşturun:<ol>
<li>Önceki adımda oluşturulan tek hücreli Imaris dosyasını açın.</li>
		<li>Dosyaya bir yüzey ekleyin.</li>
		<li>Iba1 boyamasına karşılık gelen kanalı seçin.</li>
		<li>Iba1 boyamasıyla örtüşmesi gereken bir eşik uygulayın</li>
		<li>Yalnızca ilgilenilen mikroglial hücreyi oluşturan ilgi yapısını seçin</li>
	</ol>
</li>
	<li>İşlemi sonlandırma<ol>
<li>Iba1 boyama hacmini elde edin ve kaydedin</li>
		<li>CD68 boyamasının 3B yüzey işlemesini oluşturun</li>
		<li>IBA1 yüzey alt dosyasının içinde, CD68 kanalını maskeleyin ve IBA1 lekelemesinin dışındaki vokselleri çıkarın</li>
		<li>Dosyaya yeni bir yüzey ekleme</li>
		<li>CD68 boyamasına karşılık gelen kanalı seçin</li>
		<li>CD68 boyama ile örtüşmesi gereken ve boyama hacimleriyle mümkün olduğunca yakından eşleşen bir eşik uygulayın</li>
		<li>Bu dosyada yalnızca intra-mikroglial CD68 yapıları bulunacağından ve bu nedenle başka bir eşik filtreleme adımı gerektirmediğinden işlemi sonlandırın.</li>
		<li>CD68 pozitif yapılarının sayısını ve ortalama hacmini elde edin ve kaydedin</li>
		<li>CD68 yapılarının karşılık gelen IBA1 yapılarına göre göreceli hacmini, fagositik bir durumda mikroglial aktivasyonun bir ölçüsü olarak hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Choi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+and+transient+blood-brain+barrier+opening+in+the+hippocampus+of+Alzheimer's+double+transgenic+mice+using+focused+ultrasound.">Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound.</a> Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).</li><li>Lipsman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+opening+in+Alzheimer's+disease+using+MR-guided+focused+ultrasound.">Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound.</a> Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).</li><li>Pandit, R., Chen, L., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+physiology+and+strategies+for+drug+delivery.">The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).</li><li>Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+questions+for+Alzheimer's+disease+immunotherapy.">Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy.</a> Alzheimers Research &amp; Therapy. 6 (1), 3 (2014).</li><li>Nisbet, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+scanning+ultrasound+and+a+tau-specific+single+chain+antibody+in+a+tau+transgenic+mouse+model.">Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model.</a> Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).</li><li>Janowicz, P. W., Leinenga, G., G&#246;tz, J., Nisbet, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-mediated+blood-brain+barrier+opening+enhances+delivery+of+therapeutically+relevant+formats+of+a+tau-specific+antibody.">Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).</li><li>Leinenga, G., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+ultrasound+removes+amyloid-beta+and+restores+memory+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).</li><li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+neural+stem+cells+to+the+brain+using+MRI-guided+focused+ultrasound+to+disrupt+the+blood-brain+barrier.">Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier.</a> PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-enhanced+intranasal+brain+delivery+of+brain-derived+neurotrophic+factor.">Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor.</a> Scientific Reports. 6, 28599 (2016).</li><li>Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+treatment+of+neurological+diseases+-+current+and+emerging+applications.">Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).</li><li>G&#246;tz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pathogenesis+of+the+Tauopathies.">Molecular Pathogenesis of the Tauopathies.</a> Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).</li><li>Pandit, R., Leinenga, G., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+ultrasound+treatment+of+tau+transgenic+mice+clears+neuronal+tau+by+autophagy+and+improves+behavioral+functions.">Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions.</a> Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).</li><li>Karakatsani, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Focused+Ultrasound-Induced+Blood-Brain+Barrier+Opening+Reduces+Phosphorylated+Tau+from+The+rTg4510+Mouse+Model.">Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model.</a> Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).</li><li>Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+Diffusion+of+Macromolecule+Delivery+to+the+Brain+via+Focused+Ultrasound+using+Magnetic+Resonance+and+Multispectral+Fluorescence+Imaging.">Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).</li></ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Floresan etiketli antikorlar, tarama modunda uygulanan mikrokabarcıklarla birlikte odaklanmış ultrason kullanılarak beyne iletilebilir. Antikor iletimi, mikroglial morfoloji ve lizozomal genişleme, taramalı ultrason sonrası floresan mikroskobu ile saptanabilir. Mikroglia, Fc-reseptör aracılı bir süreçte antikorların bağlandığı lizozom antikorlarını ve antijenlerini alabilir4.
Bu yöntemi kullanarak tekrarlanabilir BBB açıklığı ve antikor iletimi ...

Terapötik ultrason, kısmen terapötik ajanların beyne erişimini kolaylaştırarak, beyin hastalıklarını invaziv olmayan bir şekilde tedavi etmeyi amaçlayan yeni bir teknolojidir1,2,3. Beyin hastalıklarını hedef alan terapötik antikorların sadece küçük bir kısmı beyin4 tarafından alınıp beyinde tutulduğundan, terapötik ultrason bunların alımını ve hedef katılımını artırma imkanı sunar5,6.
Laboratuvarımızda nörodejeneratif hastalıklar için mikrokabarcıklar kullanılarak kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca çeşitli formatlarda bir antikorun verildiği terapötik yaklaşımlar geliştiriyoruz. Bunu başarmak için ultrason, tarama ultrasonu (SUS)7 olarak adlandırdığımız bir tarama modu kullanılarak kafatası yoluyla beyne birden fazla noktada uygulanır. Ultrason enerjisi, intravenöz olarak enjekte edilen mikro kabarcıklar ve beyin vaskülatürü arasındaki mekanik etkileşim, BBB'nin sıkı kavşaklarını belirli bir sonikasyon hacminde geçici olarak ayırır ve antikorların ve terapötik ajanlar da dahil olmak üzere diğer yüklerin bu bariyeri etkili bir şekilde geçmesine izin verir7,8,9 . Dahası, ultrasonun interstisyel beyinden antikorların nöronlar gibi beyin hücrelerine alımını kolaylaştırdığı gösterilmiştir, burada antikor hücre gövdesi boyunca ve hatta nöritik süreçlere dağılır5,10.
Alzheimer hastalığı, amiloid β ve tau patolojisi11 ile karakterizedir ve patojenik mekanizmaları incelemek ve terapötik stratejileri doğrulamak için bir dizi hayvan modeli mevcuttur. Ultrasonun tüm beyinde sıralı bir şekilde uygulandığı bir SUS yaklaşımı, birkaç tedavi seansı boyunca tekrarlandığında, amiloid β biriktiren amiloid öncü protein (APP) mutant farelerin beyinlerindeki amiloid plak patolojisini azaltabilir ve amiloidi alan mikrogliayı aktive ederek bilişsel işlevlerde iyileşmeye yol açabilir7. Ultrason ve mikrokabarcıklarla BBB açıklığı da pR5, K3 ve rTg4510 tau transgenik farelerde tau patolojisini azaltır5,12,13. Önemli olarak, mikroglia hücre dışı protein birikintilerini giderirken, SUS tarafından indüklenen intranöronal patolojiler için altta yatan klirens mekanizmalarından biri nöronal otofajinin aktivasyonudur12.
Burada, floresan olarak etiketlenmiş antikorların hazırlandığı ve daha sonra kurum içi lipit bazlı mikrokabarcıklarla karıştırıldığı, ardından anestezi uygulanan farelere retroorbital enjeksiyonun yapıldığı deneysel bir süreci özetliyoruz. Retroorbital enjeksiyon, aynı derecede etkili ve tekrar tekrar gerçekleştirilmesi daha kolay olduğunu bulduğumuz kuyruk damarı enjeksiyonuna bir alternatiftir. Bunu hemen beyne SUS uygulayarak takip eder. Terapötik antikor alımını belirlemek için, fareler kurban edilir ve beyindeki artan antikor konsantrasyonu daha sonra ölçülür. Beyin homeostazındaki değişimin bir vekili olarak, mikroglial fagositik aktivite histoloji ve hacimsel 3D rekonstrüksiyon ile belirlenir.
Üretilen veriler, antikorların ultrasonla verilmesinin nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde potansiyel olarak çekici bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Protokol benzer şekilde diğer ilaç adaylarına ve tanımlanmış boyutlarda floresan etiketli dextrans gibi model kargolara da uygulanabilir14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880128C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A20186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 antibody</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1957GA</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter (Multisizer 4e)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>head holder (model SG-4N, Narishige Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>#8547008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflow flow solution</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared imaging system Odyssey Fc</td>
			<td>Licor</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octafluoropropane</td>
			<td>Arcadophta</td>
			<td>0229NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIPS (Therapy Imaging Probe System)</td>
			<td>Philips Research</td>
			<td>TIPS_007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of antibodies into the brain using focused scanning ultrasound

Beyin hastalıklarını hedef alan terapötik antikorların sadece küçük bir kısmı beyin tarafından alınır. Fokuslu ultrason, kan-beyin bariyerinin (BBB) geçici olarak açılması yoluyla antikorların alımını ve katılımını arttırma imkanı sunar. Laboratuvarımızda nörodejeneratif hastalıklar için mikrokabarcıklar kullanılarak BBB boyunca çeşitli formatlarda bir antikorun verildiği, kafatası üzerinden birden fazla noktayı hedef alan odaklanmış ultrason uygulamasıyla eş zamanlı olarak terapötik yaklaşımlar geliştiriyoruz, bu yaklaşıma tarama ultrasonu (SUS) diyoruz. Mikrokabarcıkların ve ultrasonun kan damarları üzerindeki mekanik etkileri, sıkı kavşakları geçici olarak ayırarak BBB boyunca parasellüler transportu arttırır ve vezikül aracılı transsitozu arttırır, antikorların ve terapötik ajanların etkili bir şekilde geçmesine izin verir. Dahası, ultrason ayrıca antikorların interstisyel beyinden, antikorun hücre gövdesi boyunca ve hatta nöritik süreçlere dağıldığı nöronlar gibi beyin hücrelerine alımını kolaylaştırır. Çalışmalarımızda floresan etiketli antikorlar hazırlanır, kurum içinde hazırlanan lipit bazlı mikrokabarcıklarla karıştırılır ve beyne SUS uygulanmadan hemen önce farelere enjekte edilir. Beyindeki artan antikor konsantrasyonu daha sonra ölçülür. Normal beyin homeostazındaki değişiklikleri açıklamak için, mikroglial fagositoz hücresel bir belirteç olarak kullanılabilir. Üretilen veriler, antikorların ultrasonla verilmesinin nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde çekici bir yaklaşım olduğunu göstermektedir.

Bu protokolü kullanarak floresan olarak etiketlenmiş antikorlar beyne verilir ve mikroglia aktivasyonu ile birlikte tespit edilebilir. Çıkarılabilecek sonuç, odaklanmış ultrason ve mikrokabarcıkların kullanılması, antikorların beyin alımını belirgin şekilde arttırır ve tarama modunda kullanıldığında bir farenin tüm beynine veya yarımküresine antikorlar verebilir. Şekil 1 , BBB'yi açmak için kullanılan TIPS ultrason uygulama cihazını (etiketli farklı bileşenl...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound at JoVE.com

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Burada sunulan, floresan etiketli antikorları iletmek ve mikroglia'yı aktive etmek için kan-beyin bariyerini (BBB) fokal olarak veya bir fare beyni boyunca geçici olarak açmak için bir protokoldür. Ayrıca histoloji ile antikorların ve mikroglia aktivasyonunun verilmesini tespit etmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

delivery-antibodies-into-brain-using-focused-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.0K Görüntüleme.  The University of Queensland. Burada sunulan, floresan etiketli antikorları iletmek ve mikroglia'yı aktive etmek için kan-beyin bariyerini (BBB) fokal olarak veya bir fare beyni boyunca geçici olarak açmak için bir protokoldür. Ayrıca histoloji ile antikorların ve mikroglia aktivasyonunun verilmesini tespit etmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Video: Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Fare önbeyin içine Ultrason Rehberliğinde Mikroenjeksiyon In Utero E9.5 az

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Nörobilim

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

CNS içine Hedeflenen Madde Teslimat için Fare Mikrocerrahi İnfüzyon Tekniği<i&gt; yoluyla</i&gt; İç Karotis Arter

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

Konveksiyon ile Murine beyin içine antikorların teslimi-gelişmiş teslimat

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Bir Sıçan Modelinde Odaklanmış Ultrason Kullanarak Konuma Özgü Kan Beyin Bariyeri Açılışına Tezgah Üstü Yaklaşım

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Kemirgenlerde Kan-Beyin Bariyeri Açıklığı için Yüksek Verimli Görüntü Destekli Stereotaktik Nöronavigasyon ve Odaklanmış Ultrason Sistemi

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

Beyin Devrelerinin İnvaziv Olmayan Bağlantısının Hedefli Nöronal Yaralanma

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Methods Article

Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi