Conpokal, örnek yüzeyini dürtmek için bir sonda kullanarak konfokal mikroskopi ile atomik kuvvet mikroskobu yla birleştirir. Her iki teknik de bireysel olarak etkili olmasına rağmen, Conpokal mekanik karakterizasyon ile floresan ko-lokalizasyonu kolaylaştırır. Conpokal tekniğinin en büyük avantajı, yakın eşzamanlı çift mikroskopi olduğunu.
Konfokal, alana özgü mekanik özellikler sağlayan AFM sondası öncesi ve sonrası sitoskeletve diğer hücresel süreçleri inceler. Bu teknik, örneğin, beyin hücreleri elektriksel impulslar ve kuvvet hareketi incelemek için fizyolojik koşullar altında incelenmiş olabilir gibi mekanobiyoloji alanında etkili. Analize başlamadan önce, istenilen veri toplama için uygun bir AFM kantili seçin ve eldiven, AFM yonga montaj aşaması, cımbız ve talaşı cam bloğa monte etmek için küçük bir tornavida kullanın.
AFM çipini cam bloğun ortasına dikkatlice yerleştirin. Cantilever artı AFM çipçok küçük bir kısmı cam bloğun görünür, opak olmayan kısmında olmalıdır. Talaş cam blok karşı rahat olana kadar vida sıkmak için tornavida kullanın ve çip doğru odaklı olup olmadığını kontrol etmek için bir lens kullanın.
Talaş düzgün bir şekilde yönlendirildiğinde, cam bloğu AFM kafasına uygun yönde yerleştirin ve cam bloğu yerine kilitleyin. Kalibrasyon kabının alt kısmını parlak alan mikroskobu yla tespit ettikten sonra, AFM cantilever 2000 mikronlarını numunenin üzerine taşımak için AFM sistemi Z step motor kontrol panelini kullanın. Parlak alan aydınlatması ve Z step motor kontrol paneli kullanarak, AFM ucunu Petri kabına çarpmamak için AFM çipini 100 ila 200 mikron arasında cam kabın dibine kadar yavaşça indirin.
X Y'yi kontrol eden manuel mikrometreleri veya AFM kafasının düz harekethalinde cihaz platformunda bulun. AFM'nin gölgesi karardınve şekil keskinleştikçe, AFM kafasını düzeltmek ve AFM cantilever'in görüş alanı içindeki konumunu ayarlamak için manuel mikrometreleri kullanın. Şu anda, arama tablolarının ayarlanması gerekebilir.
AFM ucunun yemeğin altına yaklaştığını gösteren mikroskop yazılımı görünümünde bir gölgenin görünmesini izleyin. Uç çoğunlukla odak ta ki AFM ucunu düşürmek için küçük adımlar kullanmaya devam edin. Lazer konumalırken, lazer hizalama kadranlarını kullanarak lazeri afm ucunun bulunduğu yerin arka tarafına yerleştirin.
Lazer hizalama paneli sıfır volttan daha büyük bir toplam sinyali göstermelidir. AFM ucunda kalırken maksimum toplam sinyali elde edilene kadar lazeri, AFM kantilinin tüm yönlerinde küçük bir mesafeyi hareket ettirin. Lazer konumu ayarlandıktan sonra, dikey ve yanal sapma sıfır manuel olarak kontrol sapma kadranları kullanın.
Hedefin ortalanması ve lazer hizalama panelinde dikey veya yanal sapma olmaması için dedektörü hizalamak için dikey ve yanal sapma düğümlerini kullanın. Kalibrasyon penceresini açın ve tüm deneylere özel bilgileri girin. Lazer ışık filtresini değiştirin.
Kalibre etmeden önce, konfokal mikroskop ışık kaynağını kapatın ve oda ışık veya titreşimlerinden kaynaklanan olası gürültüyü azaltmak için AFM kasasını kapatın. Sistemin ucu otomatik olarak kalibre etmesine izin vermek için Kalibrasyon düğmesine basın. Kalibrasyon tamamlandığında, kantilever sertliği ve hassasiyeti Kalibrasyon panelinde görüntülenir.
Ardından, tarama başlatma düğmesine basmadan önce, ipucunu örnek yemeğin altına düşürmek ve cilt alanının boyutunu, çözünürlüğü, ayar noktasını, Z uzunluğunu ve piksel süresini ayarlamak için Otomatik Yaklaşım Komutu düğmesini kullanın. Mikroskop yazılımında konfokal mikroskop görüntülemeiçin konfokal yetenekleri etkinleştirin ve numuneleri lekelemek için kullanılan boyalara uygun lazer çizgilerini seçin. Örnekteki bu özellikleri heyecanlandırmak ve görüntülemek için bir veya birden çok lazer çizgisi seçin ve kazancı örnek floresanını optimize eden ancak gürültü miktarını sınırlayan bir değere ayarlayın.
Dinamik aralığı en üst düzeye çıkarırken doymuş pikselleri önlemek için lazer gücünü ayarlayın ve optik kesit çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği boyutunu bir alan birimine ayarlayın. Gerekirse, değerleri örnek parlaklığına göre ayarlayın. Piksel çalışma süresini ayarlamak için yaklaşık iki mikrosaniyelik bir yaşam süresiyle başlayın ve gerektiğinde örnek parlaklığını yansıtacak şekilde ayarlayın.
Seçili hedef için piksel boyutunu seçmek için, enstrümanın Nyquist seçeneği düğmesi ve görüntüdeki seçilen piksel sayısını kullanarak piksel boyutunu hesaplamasına izin verin. Ardından, Tscan seçeneğini seçin ve veri toplamaya başlayın. Örnek özelliklerini en net formunda temsil eden odak düzlemini, veri toplamaya başlamak için Scan düğmesini ve iki boyutlu bir görüntü yakalamak için Yakalama düğmesini bulmak için odak düğmesini kullanın.
Nyquist seçeneği ile piksel boyutunu kontrol eden paneli kullanarak, yalnızca tek bir hücreyi saran tarar'ın alan boyutunu küçültün. Toplama aracını etkinleştirin ve yalnızca örnekteki bir özelliği en net şekilde aydınlatan lazer çizgisiyle altseçeneğini kullanarak, düzlemler arasında önerilen boşluk kullanılarak ölçülecek ses düzeyi için başlangıç ve bitiş düzlemlerini ayarlayın. Dosyayı adlandırın ve ilişkili klasöre kaydedin.
Alternatif olarak, numune kalınlığı hakkındaki priori bilgimiz varsa, sesi tanımlamak için odağı ayarlayarak en parlak, en keskin, orta düzlemi seçin ve orta düzlemin üzerinde örnek kalınlığına sahip olacak şekilde üst kısmı, orta düzlemin altındaki kalınlığa sahip alt kısmı ayarlayın, ardından uygun adım boyutunu seçin. Şimdi Çalıştır düğmesine basarak satın almayı çalıştırın. Edinme bittiğinde, dosyayı uygun klasöre kaydedin.
Deneyin sonunda, cam bloğu çıkarırken eldiven giyin ve montaj istasyonuna yerleştirin. AFM çipini dikkatlice çıkarmak için kauçuk kulplu cımbız kullanın ve kullanılmış ucu, kullanıldığını belirtmek için erişimkapalı olarak yönlendirilen depolama kutusunun konumuna geri yerleştirin. İleride başvuru için, denemede hangi ipucunun kullanıldığını not edin.
Burada, yaşayan bir HEK hücresi üzerinde temsili bir AFM tonu gösterilir. Bu hek hücresinin yüksekliği, hat tararcının gösterdiği gibi yaklaşık 10 mikron civarındaydı. Burada, uygun olmayan bir AFM ipucu seçimi nedeniyle kötü bir tarama örneği görülebilir.
Bu resimde, afm PA bölgesinin büyük hücre yüksekliği nedeniyle kapsama alanı dışında olduğunu gösteren hücrenin en tepesinde siyah pikseller belirdi. AFM kantilinin ucu, hücre yüksekliğine göre yetersiz uç yüksekliğiyle birleşen uç ofset nedeniyle görüntüde de görünür. AFM görüntüdeki bu yapılar, hücreyi görüntülemek için farklı bir AFM ipucunun seçilmesi gerektiğini gösterir.
Üç renk konfokal görüntüleme yapılabilir. Örneğin, hücre çekirdeğini, mikro tübülleri ve lipophilic membranı görselleştirmek için. Nano mekanik model ile birlikte uç girintilerinin analizi, yüzeyin bir modül haritası nın üretimine olanak sağlar.
Burada lazer konfokal Z yığınının karşılık gelen 3Boyutlu projeksiyonu gösterilmiştir. Streptococcus mutans bakterisinin bu temsili analizinde gözlendiği gibi, AFM taramaları ve ölçülen modül haritaları mikroplar için de elde edilebilir. Gösterildiği gibi, geleneksel konfokal mikroskopi ile daha iyi bir çözünürlük AFM ile bu ölçekte elde edilebilir.
Yapıştırıcı kuvvet haritalama moleküler etkileşimleri görselleştirmek için conpokal ile yapılan bir tekniktir. Örneğin, bağlayıcı kinetik gözlemlemek için hücre yüzey moleküllerinin modülasyon çalışma. Conpokal, tıbbi mikrobiyolojide yapı fonksiyon ilişkilerini keşfetmek için yeni bir yol açmaktadır.
Örneğin, fiziksel ve kimyasal olaylar ve peptidoglikan tabakası, antibiyotik direnci ile bağlantılı olabilir.
