Biz yazının eleştirel okuma Dr. Grant Sumida teşekkür ederim. Bu çalışma, Beckman Genç Araştırmacı Ödülü (SY), Hellman Aile Yeni Fakülte Ödülü (SY), NIH EUREKA, University of California Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Istikrarlı hücre hattı oluşturma (örneğin MDCK hücreleri) <ol><li> P35 çanak confluency% 80-90 Plaka hücreleri. Hücrelerin transfeksiyon verimliliği azaltacaktır% 100 konfluent tek tabaka oluşturur izin vermeyin. </li><li> Lipofectamine 2000 kullanarak ilgi plazmid hücreleri Transfect. Transfeksiyon koşulları üreticinin protokolü kullanılarak optimize edin. </li><li> Ertesi gün, geçit, iki P150 petri kutularının içine hücreler. Büyük bir çanak stabil kolonileri arasında yeterince boşluk izin tavsiye edilir. </li><li> Ertesi gün, medya değiştirmek ve her yemek için 500 mg / ml G418 ekleyin. G418 konsantrasyonu ayrı hücre hatları için optimize edilmelidir. </li><li> Yaklaşık 2 hafta boyunca her gün medya değiştirin. 2 hafta sonra, G418-dirençli koloniler oluşturmaya başlar, ve çıplak gözle görülebilir. </li><li> Ters bir floresan mikroskop kullanarak, GFP pozitif koloniler tespit. Plaka üzerinde bir sharpie kalem kullanarak bu koloniler işaretleyin. </li><li> Selektif, doku kültürü plakadan koloniler trypsinize, medya aspire ve hücreler iki kez PBS veya tripsin çözüm ile yıkayın. Ikinci yıkama, tüm çözüm aspire yok. Plakanın altındaki sıvı ince bir tabaka hücreleri kurumasını önlemek için bırakın. </li><li> Her işaretli koloni için koloni kenarı etrafında temizlemek için mümkün olduğunca yakın steril bir pamuklu bir bez kullanın. Bu hücre koloni içeren ıslak alan bir ada yaratacaktır. Pipet 10 ul koloni üzerine tripsin. Her koloni için tekrarlayın ve kurutma önlemek için hızlı bir şekilde devam edin. Deneyimli bir araştırmacı genellikle ~ P150 plaka başına 12 koloniler alabilirsiniz. </li><li> 37 o plaka ° C&#39;de 5-10 dakika hücreleri ayırmak plaka ve yuvarlak görünene kadar. </li><li> Her koloni için: Pipet 10 koloni üzerine tripsin ul ve plaka hücreleri ayırmak için birkaç kez aşağı ve yukarı pipetle. Sonra 24 iyi bir çanak tek bir kuyuya koloninin tüm hücreleri pipetle. </li> &lt;li&gt; stabil kolonileri büyüdü sonra, her koloninin protein ifade standart western blot ve immünofloresan kullanılarak analiz edilmektedir. Daha fazla analiz için bu hücre hatları genişletin. </li></ol> 2. En iyi kolajen bağlama (isteğe bağlı) cam alt çanağı yüzey modifikasyonu <ol><li> P35 10 mm açılması ile her yemeğin cam kısmı üzerine cam silanize için,% 2 pipet 300 ul 3-Aminopropyltrimethoxysilane çözüm. Silanization ve çapraz bağlama şematik Şekil 1&#39;e bakınız. 3-Aminopropyltrimethoxysilane filtrelenmiş su ile seyreltilir. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> 3-Aminopropyltrimethoxysilane çözüm aspire edin ve her 10 dakika için filtrelenmiş su ile üç kez yıkayın. </li><li> 50 ° C 1,5 saat, su ve sıcak plaka üzerinde yer yemekleri aspire. Yeri üstleri biraz çanak kapalı yemekleri tabak içinde bu nem kaçabilir. </li><li> Isı yemekleri çıkarın ve coo izinl. </li><li> Pipet 300 ul% 2 cam bölümü her yemeğin üzerine glutaraldehid çözüm. Glutaraldehid PBS içinde seyreltilir. </li><li> 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Glutaraldehit solüsyonu aspire edin ve her biri 10 dakika PBS üç kez bulaşıkları yıkamak. </li><li> 1 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalma yemekler sterilize edin. Silanlanmış yemekler oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> 3. Tracer parçacıkları ile 3D kollajen jel hazırlanması <ol><li> 5 dakika 15.000 rpm&#39;de santrifüj stok tracer partiküller (parçacıklar: 10 10 / ml) 100 ul iplik floresan tracer parçacıklar yıkayın, sıvı dışarı aspirat ve 500 ul medya ekleyin . 5 kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, medyanın 30 ul tekrar süspansiyon parçacıklar. </li><li> GFP ifade hücrelerin her zamanki gibi Trypsinize. </li><li> Yeniden süspanse hücre pelletini yaklaşık 2 x 10 6 hücre / ml. </li><li> Pipet 240 ul Eppendorf tüpe büyüme medya. </li><li> 1M HEPES 12.6 ul, 20 ul filtrelenmiş su, hücre çözüm 50 ul, sonra floresan parçacıklar 10 ul ekleyin. </li><li> Son olarak, sığır dermis Kolajen I çözümü (1 mg / ml &#39;lik bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için) 167 ul ekleyin. </li><li> Iyice çözüm karıştırın, daha sonra Silanlanmış cam alt çanağı cam kısmı üzerine çözüm pipetle 80 ul. </li><li> Inkübatör içine yerleştirin çanağı ve jel 37 polimerize izin ° C de 30 dakika boyunca. P35 cam alt çanak tipik kollajen jel Şekil 1A bakın. </li><li> Her çanak büyüme ortamı dikkatli bir şekilde 2 ml ekleyin. </li></ol> 4. Time-lapse görüntü elde etme Prosedürü <ol><li> Mikroskop muhafaza sıcaklık kontrolü açın ve 37 ° C kapsamında odasında bir kararlı durum sıcaklık dengelenmesi Canlı hücre görüntüleme sistemi bir örneği için Bkz: Şekil 2. </li><li> , Nötr bir pH&#39;ı korumak için 25 mM HEPES ile desteklenmiş yeni medya medya değiştirin. IçinDIC görüntüleme, tabak cam üst bir üst değişimi. Parafilm ince bir şerit kullanarak, medya buharlaşmasını önlemek için çanağı yan kapağı. </li><li> Immersiyon yağı hedefi için, objektif bir damla immersiyon sıvısının yerleştirin. </li><li> Mikroskop sahnede çanak içeren kollajen jel yerleştirin ve çanak daldırma sıvı ile temas edinceye emin olun. </li><li> Örnek ve resme ilgi hücreleri aramak için odaklanın. Sahne kayma en aza indirmek için, bulaşık, uzun bir yakalama başlamadan önce yaklaşık 45 dakika boyunca yerleşmek için izin verir. </li><li> Görüntü elde parametrelerini belirtin. Modüle lazer gücü, maruz kalma süresi, sıklığı ve süresi yakalama zaman, hücrelere zarar verebilir lazer pozlama, en aza indirin. Gerçek parametreler mikroskop sistemi ve hücre tipine göre değişir. </li><li> Time-lapse satın alma sırasında, bir inhibitörü eklenebilir. Inhibitörü Ayrıca deney için, parafilm çanak mühür yoktur. <ol><li> HazırlıkHEPES istenen bir çalışma konsantrasyonu ilaç ile medya eklenmiştir. </li><li> Duraklatmak görüntü yakalama, medya, ilaç ve dikkatli bir şekilde, çanak bozmadan çanak üst kaldırmak için ne zaman hazır. </li><li> Çanak medya aspire, ve çanak içine medya içeren ilaç pipetle. Sonra, çanak üst dikkatli bir şekilde değiştirin. </li><li> Örnek olabilir ek olarak yeni medya nedeniyle out-of-focus, odak ayar yapın. </li><li> Yakalama yeniden başlatın, sonra sonraki 30 dakika için yakalama izlemek ve gerektiğinde odak yeniden ayarlamalıdır. Ilaç Ayrıca deney bir örneği için Bkz: Şekil 4. </li></ol></li></ol> 5. Sıkı bağlamak prosedürü ve analizi <ol><li> Sıkı bağlamak kurulum sistemleri arasında, üreticinin talimatları takip edin değişir. </li><li> Canlı hücre görüntüleme için parametreleri ayarlayın. </li><li> Photobleaching için parametreleri ayarlayın. Hücrenin zarar vermeden floresan sinyal photobleach için yeterli lazer gücünü kullanın. Test bu paruygulama hücreleri üzerinde koşulları uygun olarak belirlenmelidir. </li><li> Görüntü yakalama başlatın ve ilgi bölge photobleaching önce en az 5 kare görüntü yakalama izin verir. </li><li> Yakalama devam edin ve kurtarma zamanı tam floresan kurtarma yakalamak için yeterli olmalıdır. Sıkı bağlamak deney bir örnek için Şekil 5&#39;e bakınız. </li><li> Floresan kurtarma photobleached alanının ortalama floresan yoğunluğu (önce ve photobleaching sonra), zamanla ölçerek analiz edin. Istatistiksel analiz yazılımı (örneğin Excel) kullanarak, üstel denklem için kurtarma eğrisi uyum: I = f (1-e-kt), ben ben f son şiddeti, yoğunluğu, t zamanı ve τ ½ yarım nihai değere ulaşmak için yoğunluk için gereken zamanı: τ ½ = ln (2) / k Yarı zamanlı, protein hareketlilik oranının bir ölçüsüdür. </li><li> Parametreleri, yarı zamanlı ve uygun üstel eğri nihai yoğunluğu elde edin. Inci hesaplayıne final ilk floresan yoğunlukları oranı alarak mobil kesir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Matriks içinde sağlıklı epitel hücreleri canlı hücre görüntüleme bir örnek Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Sağlıklı hücreler, düzgün, sürekli bir membran ve farklı çekirdeği sağlıksız hücrelerin sık sık kesintiye membran ve aşırı sayıda vakuol iken sergilerler. 3 boyutlu bir matris, tek epitel hücreleri 1 göç ve birkaç gün boyunca, epitel hücreleri içinde matris 2 üç boyutlu, küresel, çok hücreli kistler oluşturur. Hücreler de son derece dinamik ve kist içinde göç (Şekil 3). Çevresindeki matriks (Şekil 4), gömülü tracer parçacıkların yer değiştirme yoluyla göç eden hücreler tarafından uygulanan çekiş güçlerinin bir sonucu olarak matris deformasyon analiz edilir. Tracer parçacık hareketleri, farklı bir maksimum projeksiyon görüntü olarak görüntülenir.ent zaman noktalarında, ve her seferinde noktası (Şekil 4B) göstermek için sözde renkli. Alternatif olarak, bireysel bir tracer parçacık görüntüleri (Şekil 4C) zamanla izleme parçacık hareketi göstermek için bir montaj olarak görüntülenir. ImageJ Tüm görüntü analizi kullanılarak yapıldı. Bu matris deformasyon nitel değerlendirmeler ve bu nedenle göç eden hücreler tarafından uygulanan kuvvetler, çekiş kuvveti dağılımı faydalı ilk yaklaşımdır. 3D göçmen hücreler tarafından uygulanan çekiş güçleri kantitatif tahmini Bu protokol kapsamı dışında ve başka bir yerde 3,4 açıklanmıştır. Deney photobleaching sonra tipik bir floresan kurtarma Şekil 5&#39;te gösterilmiştir. Ilgi bölgesi floresan yoğunluğu gözle görülür sağlıklı ve bozulmamış hücrelerin korurken arka plan düzeyleri (sinyal-gürültü oranı en üst düzeye çıkarmak için) göre azalmış, böylece optimize edilmiş lazer ayarları kullanarak photobleached olmalıdır. En iyi ayar b gerekirHer sıkı bağlamak kurulum farklı olarak e deneysel olarak belirlenir (örneğin, sıkı bağlamak kullanarak lazer tarama konfokal sistem). Maruz kalma sonrası sıkı bağlamak görüntü elde etme ve zaman aralığı dikkatle arka plan photobleaching önlemek için kontrol edilmelidir. Daha düşük lazer gücü, kısa maruz kalma süresi, ve duyarlı kamera kullanımı ve yüksek verimli optik kullanımı, yüksek kaliteli sıkı bağlamak görüntüleme için çok önemlidir. Floresan görüntü alımı sırasında beyazlatma önemli ise, bu arka plan solmaya sayısal ve gözlenen floresans yoğunluğu kurtarma gelen normalize edilmelidir. 3D çevre doğası nedeniyle, floresan kurtarma z bileşeni önemli hale gelebilir. Bu nedenle, photobleached bölgenin öncesi ve sonrası 3D yığın görüntüleri alarak photobleached hacmi tanımlamak için önemlidir. Daha fazla analiz ve modelleme floresan kurtarma, başka bir yerde 5,6 tartışılmıştır. Canlı hücre görüntüleme t eşsiz kombinasyonuechniques: GFP matris deformasyon ve inhibitörlerinin yanı sıra izlemek için sitoskeletal proteinler, kırmızı floresans tracer parçacıklar dinamikleri takip etmek, protein dinamiği, çekiş gücü ve moleküler yollar analizi için aynı anda kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Şekil 1 kollajen jel hazırlanması. A) cam alt çanak Polimerize kollajen matriks. Pembe renkli jel gömülü floresan parçacıklar nedeniyle. B) Usulü cam yüzey kollajen jel çapraz bağ cam alt yemekleri tedavisinde. İlk olarak, cam alt çanak 3-Aminopropyltrimethoxysilane çözüm, cam kollajen matriks çapraz bağları glutaraldehid çözümü ile tedavi edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Şekil 2 sıkı bağlamak / konfokal mikroskop kurulum Şemalar. Konfokalmikroskop CoolSnap HQ II CCD kamera ile Zeiss AxioObserver dayalı ve tamamen Slidebook yazılımı (Akıllı Görüntüleme Yenilikler) tarafından otomatik. Konfokal birim özel tasarlanmış ve iki lazerler arasında geçiş milisaniye izin Yokogawa dönen disk ünitesi CSU10 Acousto Optik Ayarlanabilir Filtresi (AOTF) ile iki katı hal lazerleri (50 mW gücünde ve 40 mW ile 561 nm ile 488 nm) dayanmaktadır. Emisyon filtreleri (# 118.661 ve 118.085, Chroma Teknolojisi) 525 / 50 nm ve 620 / 60 nm ve dikroik ayna 488-568 BrightLine Çift bant (Semrock). Hedefleri NA 1.1 ve 0.62 mm çalışma mesafesi ile uzun bir çalışma mesafesi 40x C-Apochromat amacı, NA 1.4 ile 63x Plan-Apochromat amacı ve 0.19 mm çalışma mesafesi vardır. Mikroskobu, bir fiber optik dye lazer, bilgisayar kontrollü bir ışın konumu ve yoğunluğu ve kırınım sınırlı spot büyüklüğü pompalanır oluşan bir sıkı bağlamak photoablation sistemi içerir. Ayrıca, mikroskop ile donatılmıştır.her eksen üzerinde 0.1 mikron doğrusal kodlayıcılar içeren bir xy motorlu sahne. Time-lapse görüntüleme sırasında, çevre sıcaklığı, özel olarak tasarlanmış bir mikroskop odası ve bir geri bildirim sıcaklık kontrolü ile bir ısıtıcı tarafından yapılmaktadır. Herhangi bir gürültü ve titreşim izole etmek için, tüm mikroskop sistemi titreşimsiz bir masaya. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Şekil 3 GFP-aktin ifade epitel hücrelerinin hücre görüntüleme yaşayın. Bu hücreler kültür 3D kollajen matriks 4 gün sonra bir kist oluşmuş. Diğerleri (kırmızı ok ucu) içinde kist iç göç ederken bazı hücreler, kist (sarı ok ucu) yüzeyi boyunca hareket eder. Ölçek çubuğu 10 mm, saat zaman. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Şekil 4 çekiş kuvveti etkisi Rho-kinaz inhibisyonu. A) G ifade göç MDCK hücre DIC görüntüFP nükleer işaretleyici etiketli. Görüntü Rho-kinaz inhibitörü Y-27.632 tedavisi hemen önce çekildi. Ölçek çubuğu 10 mm. B) Parçacık deplasman Y-27.632 ek kaynaklanan. Parçacık konumları farklı zaman noktalarında (0 - 52 dakika) yoğunluğunu ölçeğine göre sözde renkli, daha sonra tek bir görüntü yansıtılıyor. Beyaz bölgeye göç eden hücreler, GFP pozitif çekirdeğini oluşturur. Ölçek çubuğu 10 mm. Saat dakika. C) hücre firar kenarında parçacık hareketi B (ok). Asterisk Y-27.632 ek önce çekilen son kare gösterir. Tracer parçacık sırasıyla, doğru ve önce uzağa göç hücre sondaki kenar ve Y-27.632 eklenmesinden sonra taşındı. Ölçek çubuğu 1 mikron. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Şekil 5, üç-boyutlu bir matris hücre göç ifade GFP-aktin sıkı bağlamak analizi . A) Timelapse görüntüleri GFPaktin hücre photobleaching öncesi ve sonrası dile getirdi. GFP-aktin hücre arka tarafta biriken küçük bir bölge timepoint 0 (kırmızı ok ucu) photobleached. Saniye Saat, ölçek çubuğu 5 mikron. B) photobleached bölgesi (düz çizgi) ve floresan kurtarma (daireler) üstel uyum ortalama floresan yoğunluğu zamanla çizilir. Floresan yoğunluğu photobleaching önce başlangıç ​​değeri normalize edildi.

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada, üç boyutlu bir matris hücre göçü mekanizmaları çalışma canlı hücre görüntüleme kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin başarı stably GFP-etiketli proteinlerin ifade &quot;iyi&quot; klonlar elde bağlıdır. GFP proteinlerin düşük seviyesi çok yüksek, GFP seviyesi hücrede istenmeyen yan etkileri var ise, hücre sağlığını tehlikeye atar aşırı uyarım pozlama gerektirir. Böylece, hücre içine genler transfect vektör seçim (örneğin, organizatörü, floresan e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kollajen, sığır, Tip I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stok 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Suda sulandırınız </td></tr><tr><td> glutaraldehid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> PBS içinde seyreltin </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres polistiren mikroküreler 1 mikron, kırmızı floresans (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kültür medya bileşenleri: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Geleneksel olarak, hücre göçü, iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Ancak, yara iyileşmesi, doku rejenerasyonu ve kanser metastazı gibi önemli biyolojik süreçleri sırasında, hücrelerin karmaşık, üç boyutlu ekstrasellüler doku ile dolaşmak gerekir. Bu biyolojik süreçlerin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, hücre göçü sürüş için sorumlu proteinlerin rollerini incelemek için önemlidir. Burada, epitel hücre hattı (MDCK) kullanarak hücre göç mekanizmaları incelemek için bir protokol taslağı, ve üç boyutlu bir model sistem olarak, lifli, kendi kendine polimerize matris. Bu optik net ekstraselüler matriks, canlı hücre görüntüleme çalışmaları kolayca mükellef ve fizyolojik, yumuşak doku ortamı daha iyi taklit eder. Bu rapor doğrudan protein yerelleştirme ve dinamikleri görselleştirmek için tekniği ve çevresindeki üç boyutlu matris deformasyon gösterir. Sınavhücresel süreçleri sırasında protein yerelleştirme ve dinamikleri ination protein fonksiyonları önemli bir fikir verir. Genetik olarak kodlanmış olan floresan etiketleri protein yerelleştirme ve dinamikleri gözlemlemek için benzersiz bir yöntem sağlar. Bu tekniği kullanarak, anahtar hücre içi birikimi analiz edebilir, kuvvet üreten matris yoluyla hücre manevraları gibi gerçek zamanlı sitoskeletal bileşenleri. Buna ek olarak, farklı dalga boylarına sahip birden fazla floresan etiketlerini kullanarak, biz, böylece bize farklı proteinler benzer veya birbirinden farklı rollere sahip olup olmadığını, örneğin, test etmek için izin proteinlerin aynı anda birden fazla lokalizasyonu inceleyebilirsiniz. Ayrıca, floresan tagged proteinleri (sıkı bağlamak) analizi Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak dinamikleri belirlenebilir. Bu ölçüm testleri, protein hareketlilik ve nasıl stably proteinler bağlı iskelet ağ. Canlı hücre görüntüleme protein fonksiyonu inhibitörlerinin tedavi ile birleştirerek,proteinleri ve göç eden hücrelerin morfolojisi dağıtım gerçek zamanlı değişiklikleri inceleyebilirsiniz. Ayrıca, biz de hücre göçü sırasında matris deformasyon görselleştirmek için matris içinde gömülü floresan tracer parçacıkların kullanımı ile canlı hücre görüntüleme birleştirir. Böylece, kuvvet üreten bir göç hücre proteinleri nasıl dağıttığını görselleştirmek, nerede ve çekiş güçleri çevreleyen matriks sarf edilir. Bu teknikler sayesinde, hücre göçü mekanizmaları spesifik proteinlerin ve onların katkılarını rolleri içine değerli bilgiler elde edebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Görüntüleme.  University of California, Davis. Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Video: Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Biyomühendislik

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

İletken Mürekkepler düzlemsel ve Üç Boyutlu Baskı

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Evrensel Real Time Derin Doku İnsan Anjiografi ve Fonksiyonel Preklinik Çalışmalar üç boyutlu Optoacoustic Görüntüleme Probe El

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...