Bu çalışma, Ulusal Sağlık hibe 2R01 GM53132 ve P50 GM071558 Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. Kalsiyum göstergeleri ile yükleme hücrelerle <ol><li> 35mm cam alt Mattek yemekleri Levha hücreleri (veya başka bir cam alt odaları inceleyen). </li><li> Kullanarak birincil miyositler kat odaları 1 gün önce 10μg/ml laminin. KB tampon Levha (K-ters Tyrode tampon kardiyak miyositler (yetişkin köpekler, yenidoğan sıçan ya da diğer bir organizmayı izole) 35 Hepes mmol / L, 140 mmol / L KCl, 8 KHCO 3, 2 mmol / mmol / L MgCl 2 L ve 0.4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7.5) ve 37 az% 15 fetal sığır serumu ve% 1 streptamycin ve% 0.5 gentamisin ve inkübe ile desteklenmiş M199 orta yavaş yavaş değiştirmek ° C% 5 CO 2. </li><li> Hücreleri veya oda sıcaklığında 30-45 dakika için herhangi bir istenen kalsiyum göstergesi; kalsiyum yeşil AM (Molecular Probes 1-5 mcM) ile inkübe edin. Boya photobleaching önlemek için tabak alüminyum folyo ile örtün. </li><li> Leibovitz15 14mm EGTA orta (hücreler üç kez yıkayındüşük kalsiyum deneyler) veya herhangi bir uygun görüş medya performans. </li><li> Leibovitz15 orta containing14mM EGTA bir 30-45 dakika inkübe edin. </li><li> Inhibitörlerinin etkilerini test ikinci inkübasyon sırasında (yani 10μM U73122 PLC inhibitörü) ekleyebilirsiniz. </li></ol> 2. Microinjecting hücreleri <ol><li> 24 saat için cam alt Mattek yemekleri (ya da diğer izleme odaları) Kültür kardiyomiyositlerde. </li><li> 14 mM EGTA fenol-Leibovitz-15 orta Değişim (kardiyomiyositlerde kalsiyum serbest ortamda enjekte olması orta içeren kalsiyum, diğer hücreler enjekte edilebilir). </li><li> Mikroenjeksiyon çözüm hazırlayın çalışmalar Gα q ortadan kaldıran bir peptid - caveolae etkileşimleri. Hacminin sadece küçük bir miktar (~ fL) hücre içine enjekte edilir ve böylece makul konsantre stoklarını kullanmış olmalıdır aklınızda bulundurun. Bu peptid 2 mcM Cav3-iskele, kalsiyum-serbest ortamda DAPI ile kullandı. DAPI bir blue boya lekeleri çekirdeğin ve microinjected hücrelerin kimlik sağlar. DAPI birçok kalsiyum göstergeler floresan engel değildir. DAPI miktarı değişken ve biz genellikle çekirdeğin görselleştirmek için yeterli kullanmak (0.5 ve 2 mcM) </li><li> Yalnız boya tracer - DAPI içeren kontrol çözümü hazırlayın. </li><li> Microinjections kendi kendine çekti ya da piyasada bulunan iğne kullanmak için. Uygun iğne parametrelerini belirlemek için boya enjeksiyonu ile uygulayın. Biz, farklı hücrelerin farklı iğne çapları ve mikroenjeksiyon baskılara gerektirebilir unutmayın. </li><li> Örneğin bir InjectMan NI2 Eppendorf FemtoJet&#39;te pompa, otomatik mikroenjeksiyon sistemi kullanın. 90 enjeksiyon basıncı P i hPa ve 45 tazminat basınç P c hPa ayarlayın. 0.7 enjeksiyon süresi t ayarlayın s Gerek enjeksiyon parametrelerini yeniden ayarlayın. </li><li> Ters bir mikroskop (örneğin Zeiss Axiove microinjections gerçekleştirinrt 200M) uzun çalışma mesafesi faz kontrast hedefi (örneğin hava 40x faz 2 hedefi için) ile donatılmıştır. </li><li> Hızlı bir şekilde mümkün olduğu kadar çok hücreler olarak enjekte edilir. Faz kontrast, canlı hücreleri seçmek için kullanarak hücreleri enjekte inceleyin. </li></ol> 3. Co-immunofloresan çalışmalar <ol><li> PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve 30 dakika boyunca% 3,7 paraformaldehid ile düzeltmek. Gerekirse, hücrelerin fiksasyonu önce uyarılır. </li><li> Sabit hücreler PBS ile üç kez yıkayın ve 5minutes için PBS içinde 0.2% NP40 kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> PBS 1 saat için% 4 keçi serumu (ya da diğer uygun serum) içeren kullanarak engelleyin. </li><li> 1 saat için PBS içinde% 1 keçi serumu ile uygun dilüsyon hücrelerin primer antikor ile inkübe edin. </li><li> Alexa-Fluor-488 anti-tavşan veya Alexa-Fluor-647 sulandırılmış anti-fare sekonder antikoru gibi floresan etiketli ikincil antikor Ayrıca, 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7.6 ile 10 dakika hücreler üç kez yıkayın 1: 1000 PBS içinde% 1 keçi serumu (birincil antikorlar iki farklı proteinlerin problama farklı türler ortaya olmalıdır ve ikincil ilgili türlerine karşı olmalıdır dikkat edin). </li><li> 37 ° ° C&#39;de 1 saat, üç kez TBS ile yıkayın. </li><li> TBS tampon ya da başka bir uygun görüş orta hücreleri. </li></ol> 4. Hızlı kalsiyum görüntüleme <ol><li> (Örneğin Fluoview 1000 Olympus) konfokal mikroskop lazer tarama kullanın. </li><li> Yüksek sayısal diyafram objektif kullanın. </li><li> Satın parametreleri ayarlayın. Kalsiyum yeşil kullanımı 488 nm eksitasyon ve uzun 515 emisyon filtreleri geçmek. </li><li> 2 μs / piksel piksel saati ayarlayın - hızlı kalsiyum ölçümleri için ayarlayın. </li><li> 0.05 - 0.3 mikron piksel boyutu ulaşmak için görüntü yakınlaştırma ayarlayın. </li><li> Belirli bir bölgede tercih edilen bir hücre satırı seçin. </li><li> Zaman kontrol penceresinde zaman zaman diliminde istenilen almak için en az 1500 taramaları (satın alma seçeneğinitepkisi - 1.3 ms / satır) 2 saniye doğuracak. </li><li> Kayıt arka plan önceden uyarılması için okuma. </li><li> 5 mcM karbakol ile hücreleri uyarmak ve kayıt verileri hemen başlayabilirsiniz. Hücreleri Leibovitz15 orta 1 mL tutun Leibovitz15 10 mcM karbakol hazırlamak ve hafifçe çanak içine 1 ml eklemek </li></ol> 5. Veri analizi <ol><li> Kaydedilen görüntü her bir piksel için şiddetleri ayıklayın. Fluoview 1000 yazılımını kullanarak bir tablo olarak yoğunluğu verileri kaydetmek. </li><li> Sigmaplot al&#39;ı yoğunluğu veri veya benzer bir veri analiz programı ve bin ~ 9-40 bidonları içine veriler. Deneyler ve elektronik gürültü kontrolü ile karşılaştırın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Biz multi-line lazer uyarma ve 40x/1.2 NA apochromat suya daldırma hedefi ile donatılmış konfokal mikroskop LSM510 (Zeiss Jena, Almanya) lazer tarama hücreleri görüntülenmiş. Şekil. Biz distributio 1 (kırmızı)n, bu hücrelerin 9 önemli yapısal caveolar protein kaveolin-3 antikor ile sabit olmuştur ve lekeli köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde caveolae . Kaveolin-3 immunolabelled Alexa-647 ve 633 nm hattı ile bir O heyecanlıydı: Ne lazer. Görüntüler LP650 nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Alexa-488 (yeşil) ile immunolabeled Gα q kaveolin-3 dağılımı karşılaştırıldı. Alexa-488 488nm Argon-iyon lazer çizgisi ile heyecanlı ve görüntü BP505-530nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Bu ko ölçümleri, iki fluorophores Çok Parça satın alma kullanarak sıralı bir şekilde heyecan vardı. Bu prosedür, kanal çapraz-tartışma en aza indirir. Veri analizi için ko-Zeiss LSM510-Meta ile sağlanan AIM yazılımı kullanılarak yapıldı. Görüldüğü gibi, iki protein kolokalize. Belirlemek için nasıl kaveolin-3 ve Gα arasındaki kaplin <sub&gt; q biz bir inverted mikroskop (IX70, Olympus) 40x (UPlanApo, Olympus, sayısal açıklık amacı ile birleştiğinde bir konfokal lazer tarama mikroskop sistemi (Fluoview Olympus, Tokyo, Japonya) kalsiyum görüntüleme çalışmaları yürütülen, kalsiyum sinyalleri etkileyebilir 1.3) bu ölçümler Zeiss sistemleri üzerinde de yapılabilir ancak yukarıda anlatılan. Bu ölçümler için, hücreler, Ca 2 + Yeşil ile yüklendi . Biz bir 488nm Argon iyon lazer ile boya heyecanlı ve bir LP515 emisyon filtresi aracılığıyla görüntüleri toplanır. Resim çerçeveleri 500 ms aralıklarla toplanmıştır. Olympus yazılımı ve ImageJ kullanarak, her bir piksel için yoğunluğu değerleri çıkarıldı. Çizgi tarama modu hızlı Ca 2 + transientler ve Ca 2 + kıvılcım kantitatif analiz için kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan piksel büyüklüğü 0.1-0.3 mikron idi. Line-tarama hızı hakkında birkaç yüz satır başına ms&#39;den oldu. Şekil. 2 biz bir çizgi tarama Ca 2 + Yeşil-yüklenmiş kardiyomiyosit piksel diyi süresi 2 μs 142 μs, hat zaman oldu. 1200 satır görüntü oluşur. Her tarama hattı Ca 2 yoğunluğu dalgalanma karşılık + Yeşil oluşan 142 μs aralığı üzerinden alınan 71 puan ve hızlı bir kalsiyum yanıtları için salt olarak kullanılabilir. Örneğin, Şekil. 3 Ca 2 + Ca 2 ile ölçülen tek bir satır ayrı bir kardiyomiyosit aktivite, önce saniyeler içinde zamanın bir fonksiyonu (üst) ve sonra + Yeşil floresan (alt) artırır 5 mcM karbakol ek hücre içi Ca 2 + Gα q-PLCβ aktivite ile. Kadar satır ortalaması alınır, karbakol stimülasyon, Ca 2 ~ 1,8 kat artış üretir + Yeşil yoğunluğu . Deneysel koşullar altında (oda sıcaklığında, lazer gücü, dedektör cevabı, boya dağılımları, vb) farklılıklar nedeniyle, bu artış bireysel görülebilir olmayabilirsatırlarını tarar. Yoğunluk değerleri (y ekseni değerleri) benzer olsa da, altta karbakol ile uyarılmış arsa uyarımı daha önce görülmemiş dar dalgalanma zirveleri çok daha sürekli bir kalsiyum düzeyleri ilgili çok daha geniş zirveleri, sahip olduğu açıktır. Şiddeti Bu genişletilmesi ve göreceli bir artış, küçük, yavaş salınımları gizler. Amacımız daha iyi kalsiyum dalgalanmaların bu farklı görünür türleri arasında ayrımcılık. Şekil bu hızlı kalsiyum dalgalanmaların Başka bir örnek gösterilmiştir. 4. Üst grafik uyarılmış ventriküler kardiyomiyositlerde (kırmızı) ve ortalama 3 satır izleri siyah gösterilir için ham hat verileri gösterir. Bu kalsiyum dalgalanmalar Gα q aracılığı ile olduğu ölçüde belirlemek için caveoline3 etkileşimleri, kaveolin-3 aldırır bir peptid microinjected uzun Ca 2 ortadan kaldırır Gα q etkileşimler (yani Cav3 peptid) + mevcut ve bu veriler mavi ile yazılmıştır.(Biz iki izlerini daha iyi ayırt edilebilir böylece Cav3 peptid yoğunluğu 500 çıkarılır unutmayın). Excel dosyaları içine Sigmaplot (Jandel, Inc.) Ham veri sütunları ithal ve histogram analizi yapıldı. Bu analizde, olayların sayısının bir histogram kutuları üretmek için eşit sayıda (bidonları) gruplandırılmıştır. Bin genişliği eşit bir zaman aralığını temsil eder. Yoğunlukları farklı zaman eklenir, belirli bir bin yükseklik yoğunluğu belirli bir zaman penceresi oluşur sayısını temsil eder o kadar bağlanır. Bu tür bir analiz, sadece aynı tarama hızında veri toplama bağlı olduğundan, aynı anda birçok izlerini analiz edilebilir. Ayrıca, bu analiz, boya düzeylerinde farklılıklar, lazer gücü, vb, elektronik ve arka plan gürültü zaman ölçeklerinde çok hızlı gerçekleşir duyarlı değildir ve sadece ilk 1-2 kutularına görülür. Ilgili histograŞekil ham veri ms. 4 sayfanın alt kısmında gösterilmiştir. Kontrol hücreleri için histogram kırmızı hat (çizgi göz rehberlik ve hiçbir modeli kabul edilir) tarafından tasvir gibi geniş bir zaman dağılımı, ilgili kutuları çok sayıda yayılmıştır. Buna karşılık, Gα q-Cav3 etkileşim peptid tarafından kesintiye uğramıştır hücrelerinin yanıt için kutulara peptidin varlığını uzun süre akıları ortadan kaldırır düşündüren dar bir bin dağıtım sınırlı. Mikroenjeksiyon Gα q-Cav3 bozmayan bir kontrol peptid un enjekte edilen hücrelerin 8 &#39;e benzer bir histogram üretir. Şekil. 5 Ca 2 + yetişkin köpek ventriküler kardiyomiyositlerde Yeşil (solda) ve taze hızlı yoğunluk dalgalanmaları, caveolae (sağda) eksikliği unstimulated sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerde karşılaştırın. Burada, 3 dakikalık bir süre içinde şiddetlerinin ilgili histogramlar binned<html> 35 yavaş kalsiyum olayları görüntülemek için. Yenidoğan kardiyomiyositlerde daha yapılandırılmış bir bazal yetişkin hücreler için ise daha yavaş Ca 2 + aktivite eksikliği gösteren düz bir başlangıç ​​hızlı dalgalanmalar gösterir unutmayın. Bu farklılıklar en kolay histogramlar görülmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" /> Gα q dağılımını gösteren köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerinin Şekil 1. Görüntüleri Alexa-488 488nm Argon-iyon lazer hattı ve görüntü ile heyecanlıydı Alexa-488 ile immunolabeled BP505-530nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Sağ üst 633-nm hattı ile heyecan Alexa-647 ile immunolabeled kaveolin-3 lokalizasyonu ile ilgilenen aynı görüntüyü O: Ne lazer ve LP650 nm emisyon filtre kullanılarak kaydedilmiş. Genişletilmiş bir görüntü ile sağ sol alt ko-turuncu renkte görülür birleştirilen görüntü. <html> &quot;Pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" /> Şekil 2: Kalsiyum görüntüleme yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyosit, Ca 2 + Yeşil ile yüklenir . Görüntü 40x hedefi ile 488nm Argon iyon lazer ve LP515 emisyon filtre kullanarak bir konfokal lazer tarama mikroskobu sistem üzerinde alınmıştır. 1200 satır görüntü oluşur, piksel süresi 2 μs yaşamak ve piksel boyutu 0.1 mikron idi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" /> Şekil 3 TOP Yoğunluk dalgalanmalar yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler Ca 2 + Yeşil yüklü olarak tarif görüntülü kardiyomiyosit ve ALT 5 mcM karbakol&#39;ün ek tarafından uyarılır aynı hücrede bir çizgi izlemesi. <html> / 3505fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4 Ca 2 ile yüklenen yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyosit çizgi izleri bir örnek TOP ortalama 3 izlerinin, siyah bir çizgi olarak gösterilir ve microinjected bir hücre göre 180 ms üzerinden alınan + Yeşil (kırmızı ) bir peptid ile ortalama üç izleri siyah Gα q-kaveolin 3 derneği (kırmızı) bozar. Biz alt görüntüleme amaçlı veri kümesinden 400 yoğunluğu sayıları çıkarılır unutmayın. Alt paneller metinde açıklandığı gibi binned verilerin ilgili histogramlar ve bin sayısı isteğe bağlıdır ve bin sayısı (ya da sayısı) o belirli bin yoğunluğu toplam tutarı karşılık. Biz kontrolü (solda) ve peptid (sağ) histogramlar çizilen çizgi, kırmızı ve mavi çizgiler, verilerin kolay bir şekilde belirlenmesine ve karşılaştırmalar için izin vermek ve bir model kabul olduğunu unutmayın. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg &quot;/&gt; Şekil 5 Yoğunluğu dalgalanmalar Ca 2 + yetişkin köpek ventriküler kardiyomiyositlerde Yeşil (solda) ve caveolae (sağda) ve bunlara karşılık gelen histogramlar eksikliği taze, unstimulated sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerde aşağıda gösterilmiştir.

<ol>
	<li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+and+[Ca2+]i+waves+in+cardiac+myocytes.">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li><li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase.">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li><li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes.">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li><li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowded+little+caves:+structure+and+function+of+caveolae.">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li><li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+alters+Ca2++signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G{alpha}q+family+of+G+proteins.">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li><li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G[alpha]q+Interactions.">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li><li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway.">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li><li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses.">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li><li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae.">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz yaşam kardiyomiyositlerde hızlı kalsiyum sinyalleri görüntüleyebilir ve izole etmek için bir yöntem geliştirdik. Bu ölçümlerin deneysel koşullar altında, daha önce diğer hücre sistemleri 10 gibi kardiyomiyositlerde 11 uygulanmış olsa da, histogramlar ve bin analiz birçok Ca 2 + olayları elde edilecek veri sağlar. Daha hızlı olaylar yavaş olanlar ve bunların altında yatan mekanizmaları anlamak için uyarlanmış modelleri kolayca izole edilebilir. Kültürl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Kardiyomiyositlerde fonksiyonu 1,2 optimize etmek için birlikte çalışma süresi değişen birden fazla Ca 2 + akıları var . Değişiklikler Ca 2 + ekstrasellüler ajanlar yanıt olarak faaliyet ağırlıklı olarak, asetilkolin 3,4 gibi ajanlar tarafından uyarılan plazma membran lokalize fosfolipaz Cβ Gα q yolağı tarafından düzenlenir . Biz son zamanlarda caveolae 5,6 olarak adlandırılan plazma membran proteini etki alanı Gα q 7 aktif tuzağa olduğunu bulduk . Bu tuzak Gα q aktive devlet istikrar ve uzun süreli Ca 2 + kardiyomiyositlerde ve diğer hücre tipleri 8 sinyalleri sonuçlanan bir etkiye sahiptir. Biz yaşam kardiyomiyositlerde hızlı bir ölçekte dinamik kalsiyum tepkileri ölçerek bu şaşırtıcı bir sonuç ortaya çıkardı. Kısaca, hücreler bir floresan Ca 2 + gösterge ile yüklenir. Çalışmalarda, Ca 2 + Yeşil (Invitrogen,kalsiyum iyonlarının bağlanması üzerine floresans emisyon yoğunluğunda bir artış sergileyen c.). Floresan konfokal mikroskop bir lazer tarama bir satır tarama modunu kullanmak için kaydedilir. Bu yöntem, seçilen bir hat boyunca piksel floresan yoğunluğu zaman elbette hızlı veri toplama mikrosaniye zaman ölçeği üzerinde zaman izleri yüzlerce üreten sağlar. Bu çok hızlı izleri excel ve sonra analiz için Sigmaplot içine transfer edilir ve elektronik gürültü, boya, ve diğer kontroller için elde edilen izleri ile karşılaştırıldığında. Ca 2 incelemek için farklı akı oranları + tepkiler, zamanla piksel yoğunlukları binned histogram analizi yapıldı. Binning tarama 500 izlerini üzerinden grup ve tek bir arsa üzerinde mekansal ve zamansal olarak derlenmiş sonuçları görselleştirmek için bize izin verir. Böylece, tarar, farklı pik yerleştirme ve gürültü nedeniyle, üst üste zaman ayırt etmek zor yavaş Ca 2 + dalgalarının kolayca görülmektedir.binned histogramlar. Çok hızlı ölçüm zaman ölçeği tozlar, uzun Ca 2 ise çok kısa bir süre kutularına yoğunluğu dar bir dağılım gösterir + dalgaları uzun süre kutuları üzerinde geniş bir dağıtım binned verileri göstermektedir . Bu farklı zaman dağılımları, Ca 2 + akıları zamanlaması bize hücreleri incelemek ve çeşitli hücresel olayları üzerindeki etkilerini belirlemek için izin verir .

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes at JoVE.com

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

measuring-fast-calcium-fluxes-in-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Görüntüleme.  Queensborough Community College. Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Video: Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biyoloji

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.