C vitamini meyve ve sebzelerin besin değerinin bir göstergesidir. Biz, özellikle marul, dünya çapında en çok tüketilen yapraklı sebze, bunu ölçmek için kolay ve güvenilir bir yöntem gerekir. Bu yöntem C vitamini bozulmasını önler ve doğruluk ve hassasiyet sayesinde hem askorbik hem de dehidroaskorbik asitlerin hızlı ve güvenilir bir şekilde çıkarılmasını ve hızlı ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar.
Bu yöntem gıda teknolojisinde besin selülitleri oluşturmak, tıpta gıdanın sağlık üzerindeki etkilerini incelemek ve bitki ıslahında, farklı türlerdeki C vitamini içeriğini artırmak için kullanılabilir. Ines Medina Lozano ile prosedür gösteren, Jose Angel Aranjuelo ve Arantzazu Castellanos, benim laboratuvar iki analist olacak. Bitki örneklerini hazırlamak için, bitki başına en az bir dış ve bir iç yaprağı hasat edin ve eksi 80 derece santigrat depolama yerleştirmeden önce, hemen sıvı azot yaprakları dondurmak.
Dondurulmuş bitki örneklerini lizileştirmek için, kapaksız numune tüplerini lyophilizer'ın dondurucu haznesine yerleştirin ve lyophilizer'ı belirtildiği gibi programlayın. Kondansatör sıcaklığını eksi 80,2 santigrat derecede koruyun ve malzeme tamamen kuruduğunda 112'deki vakum sabitini, 20 mililitrelik polipropilen tüplerde liyofilize numunelere 10 milimetre çapında paslanmaz çelik toplar ekleyin. Ve örnekleri ince bir toza dönüştürmek için uygun zamanda ve yoğunlukta bir Çok Tüplü Girdap kullanın.
Askorbik asit standart stok ve seyreltme çözeltileri hazırlamak için, hassas bir denge üzerinde tam 10 miligram askorbik asit standardı tartın. Ve numuneye 90 mililitre mobil faz. Numuneyi eritmek için manyetik karıştırıcı kullanın ve elde edilen çözeltinin 100 mililitresini doğru bir şekilde ölçmek için hacimsel bir şişe kullanın.
Ek ultrasaf su ekleme, pH iki formik asit ile asitli, gerektiği gibi. Sonra bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için, stoktan beş seyreltme hazırlamak. Düşük ışık yoğunluğu altında çalışan, 15 mililitre polipropilen santrifüj tüpü ve girdap çözeltisi beş saniye için, lyophilized zemin numunesi ve ekstraksiyon çözücü beş mililitre 50 miligram ekleyin.
Dakikada 2000 devrimleri bir yörünge shaker üzerinde 10 dakika boyunca örnek sallayarak sonra, oda sıcaklığında, 10 dakika boyunca bir ultrasonik banyo için tüp aktarın ve santrifüj ile örnek toplamak. Sonra supernatant bir 0.22 mikron rejenere selüloz filtre ile zorlanma, beş mililitrelik kehribar şişe içine, ekstre hem askorbik ve dehidroaskorbik asitleri ayıklamak için. Yaprak örneklerinde askorbik asit konsantrasyonu belirlemek için seyreltme hazırlamak için, iki mililitrelik kehribar sıvı kromatografi şişesi içine ekstresi bir 200 mikrolitre ve ultrasaf su 800 mikrolitre ekleyin ve ptfe / silikon fişi ile şişe kapatın.
Toplam askorbik asit ekstraksiyonu için, bir ekstresinin 200 mikrolitresini iki mililitrelik kehribar sıvı kromatografi şişesine aktarın ve şişeye çözeltiyi azaltan 200 mikrolitre ekleyin. Şişeyi bir fişle kapatın ve çözeltiyi beş saniye girdaplayın. Oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, ışıktan korunan, reaksiyonu durdurmak ve asidik bir pH'a askorbik asidi stabilize etmek için 0,4 Molar sülfürik asitten 200 mikrolitre kullanın.
Numunelerde toplam askorbik asit konsantrasyonu belirlemek için seyreltme hazırlamak için, toplam askorbik asit ekstresi iki, ultrasaf su 400 mikrolitre ekleyin. Şişeyi bir fişle kapatın. Denemeye başlamadan en az bir saat önce, tüm çalışma çözümlerinin UPLC Sistemine yüklendiğini doğrulayın ve üç UPLC modülünü açın.
Dahili kalibrasyon işlemi tamamlandığında, yazılımı açın ve enstrümantal programı yükleyin. Yazılım yüklendikten sonra Quaternary Solvent Manager'ı tıklatın ve UPLC yönetim konsoluna erişmek için Başlat Konsolu'nu seçmek için Sağ Fare Düğmesini tıklayın. UPLC cihazının hazırlanması na ve stabilizasyonuna devam etmek için Sistem, Kontrol ve Başlangıç'ı tıklatın ve En az beş dakika boyunca Tüm UPLC hatlarını temizlemek için Prime Solvents, QSM, A, B, C, D, Seal Wash ve Prime Süresini kontrol edin.
SM'yi tıklatın, 45 saniyeden büyük Yıkama Solventini kontrol edin. Enjektörü temizlemek ve temizlemek için Çözücüyü Temizlemeyi ve 35 döngüyü kontrol edin. UPLC'yi yöntem koşullarına göre equilibrate olarak dengelemek için, Equilibrate'yi Yöntem ve QSM'ye kontrol edin ve akışı dakikada 0,3 mililitreye ayarlayın.
Solvent A ila %2 solvent B ila %0 solvent C %98 ve solvent D %0 Hala Yöntem ve SM'ye Denge de ve numuneyi 5 dereceye, kolonu da 30 santigrat dereceye ayarlayın. Yöntem ve Diğer'e Equilibrate'de, Lamba Açık'ı seçin ve Başlat'ı tıklatın. Ekipmanın en az bir saat stabilize olmasını bekleyin.
Kararlılığı doğrulamak için Konsol Sistemini başlat ve QSM'yi tıklatın ve yalnızca sütundaki basıncı denetlemek için QSM Sistem Basıncı'nı seçin. Basınç değişikliklerinde tanımlanabilir eğilimler yoksa ve delta değeri basınç inç kare başına 10 pound'dan azsa, hızlı başlangıç ekranında matrisi analiz edilecek standartların ve örneklerin adlarıyla doldurun. Standartlardaki askorbik asit konsantrasyonunun belirlenmesi için, uplc aletine her seyreltmenin beş mikrolitresini enjekte edin ve en seyreltilmiş çözeltiden başlayarak tabloda belirtildiği gibi en konsantre çözeltiye kromatografi uygulayın.
Yaprak örneklerinde askorbik asit ve toplam askorbik asit konsantrasyonu belirlemek için, seyreltilmiş ekstresi bir beş mikrolitre enjekte ve iki ayıklamak sırasıyla, kromatografik analiz için UPLC aracı içine. Askorbik asit ve toplam askorbik asit konsantrasyonlarını hesaplamak için, yazılımda Quickstart, Browse Project, Kanallar, standart veya örnek ve PDA kanal bir, 245 nanometre 1,2 nanometre de adını tıklatın. Standart ve örnek kromatogramları açmak için, kromatogramın başlangıç noktasını tıklatın ve standartlara ve numunelere karşılık gelen tepeyi entegre etmek için bitiş noktasına sürükleyin.
Daha sonra askorbik asit standart seyreltme verileri kullanın, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, kromatografik olarak belirlenen absorbans değerlerini temsil etmek ve numunenin emici değerleri interpolate, askorbik asit ve toplam askorbik asit konsantrasyonu elde etmek için, formüle göre. Lactuca matrislerde C vitamini niceliği, güvenilir sonuçlar elde edebilirsiniz bir kromatografik yaklaşım geliştirilmesini gerektirir. Burada, madenci omzunda tanımlanmamış bir kromatogram ile birlikte, optimize edilmemiş bir protokol sunan ve askorbik asit tepe, bir kromatogram görülebilir.
Bununla birlikte, ekstraksiyon ve kromatografik koşulları iyileştikten sonra, bilinmeyen bileşiklerin girişimleri olmadan çözülmüş bir askorbik asit tepe elde edilebilir. Buna ek olarak, UPLC ultraviyole ekipman kullanımı, Yerine HPLC ultraviyole, tutma ve çalışma sürelerini azaltır. Askorbik asit zirvelerinde yapılan parazitler, kromatografik süreç sırasında yetersiz ayrılma nedeniyle sürekli olarak C vitamini içeriğinin hafife alınışla sonuçlanır.
Çakışan tepe alanları aralarındaki en derin noktada dikey bir damla ile entegre edilir gibi. Ayrıca, optimize edilmeyen bir protokolün kullanılması, sonuçlardan yararlı bir sonucun çıkarılmasını engeller. Tüm örnekler benzer bir C vitamini içeriği ne gibi görünüyor, herhangi bir formları.
Buna karşılık, optimize edilmiş protokol kullanılarak, farklı örnek türleri arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farkların saptanmasına olanak tanır. Birden fazla örnek toplamak için emin olun, doğru örnekleri korumak için, okside edici ajanlar örnek maruz ilerler ve C vitamini her iki formları ölçmek için toplam C vitamini içeriği sadece herhangi bir bitki türü nde değil, aynı zamanda, herhangi bir meyve ve sebze herhangi bir meyve, hatta birkaç teknik değişiklikler ile işlenmiş gıda ölçülebilir.
