Dolaylı immünoreskence dna onarım proteinleri, mekansal ve zamansal işe alma fotoğrafları tespit etmek mümkün kılar ve DNA hasarı yerinde Proteinprotein etkileşimleri sorgulamaya yardımcı olur. DNA hasarının ardından DNA onarım proteinleri DNA'ya verilirken konsantrasyonları yerel olarak artar ve sabit numunelerde dolaylı immünofloresan tarafından görüntülenebilecek foci adı verilen gruplar oluştururlar. Bu teknik protein odaklarını saptamak ve hücrelerdeki mevcut ların kolokalizasyonunu ölçmek için kullanılabilir.
Bu karmaşık oluşumu ve DNA onarımı için gerekli olayların diziaçıklamak yardımcı olabilir. bu tür deneylerden belirli protein protein etkileşimleri gerektirilebilir. Prosedürü gösteren Barbara De La Pena, benim laboratuvar dan çok yetenekli postdoc Fotoğraf 40, 000 HeLa hücreleri 12 üzerinde iyi plaka üzerinde 18 milimetre yuvarlak cam coverslip ile her bir iyi% 80 birleşimi ile başlatın olacaktır.
Hücreleri dört gri gama ışınlamaya maruz bıraktıktan sonra, bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Sonra tamamen PBS çıkarın ve her kuyuya NDB 200 mikrolitre ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın ve NDB'yi çıkarın.
Kuluçka süresinin hücre hattına bağlı olarak değişebileceğini, ancak genellikle iki dakikayı geçmemesi gerektiğini unutmayın. Hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra PBS'yi tamamen çıkarın ve hücre fiksasyonu için her kuyuya %4 PFA'dan 200 mikrolitre ekleyin.
Hücreleri 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sonra PFA kaldırın ve her kuyuya bir mililitre PBS ekleyin. PBS'yi tamamen çıkarın ve sonra her kuyuya 200 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında iki saat veya dört santigrat derecede 16 ila 18 saat kuluçkaya yatırın.
birincil antikor ve seyreltme tampon seyreltmek ve girdap kadar iyi bir nem kutusu ve burada parafilm bir parça karışık ve tek bir damla birincil antikor 10 mikrolitre ekleyin. Kapak kaymasının bir kenarını damla ile birlikte kuyudan hizalayın ve yavaşça sıvıyı yayan parafilm üzerine indirin. oda sıcaklığında iki saat boyunca kapak kayma kuluçka.
Kuluçkadan sonra kapak yıkama başına bir dakika pbs üç kez kayar. ikincil antikor ve seyreltme tamponunu seyreltin ve girdap iyice karıştırılır kadar her coverslip için ikincil antikor 10 mikrolitre daha önce açıklandığı gibi ve ışıktan korunan oda sıcaklığında iki saat kuluçka. Kapak fişlerini PBS ile üç kez ve yıkama başına bir dakika su ile bir kez yıkayın.
Daha sonra şeffaf oje ile DAPI mühür kapak fişleri içeren bir gliserol bazlı montaj ortamı ile cam slaytlar üzerine monte ve onları 20 dakika kuru maya bırakın. 60 x objektif lens üzerine daldırma yağı bir damla yerleştirin ve XYZ görüntü edinimi için gözlük aracılığıyla çekirdekleri bulmak için DAPI kullanın, satın alma yazılımı açın ve yuvarlak yolculuk ve 512 tarafından 512 görüntü boyutu olarak galvano tarayıcı türü olarak tarayıcı türü ayarlayın. PMT panelde vbm ortalamasına ayarla, çerçeveve sıralı tetkik satıra.
Sonraki boya ve ısı dedektörleri DAPI ve SD bir kanal bir ayarlayın, kanal iki alexafluor 488 ve HSD üç, ve kanal üç alexafluor 647 ve HSD dört canlı görüntü ayarlamak Z.To için seçin, canlı pencerede canlı düğmesine basın ve odak ayarlayın. Ardından lazer yoğunluğu hassasiyeti ayarlamak için PMT araç penceresini kullanın, z yığınları için kazanç ve mahsup, baştan sona ve 15 dilim seçin. Görüntüleri kaydetmek için klasörü seçin ve edinmeye başlamak için LSM Başlat düğmesine basın.
Bittiğinde, görüntü edinimini tamamlamak için seri bitti düğmesine basın. Analiz yazılımını açın ve toplu iş aracı penceresine basın ve analiz etmek için görüntüleri seçin. Analiz aracı penceresine gidin ve 15 dilimden maksimum yoğunluk projeksiyonu görüntüleyecek olan projeksiyonu seçin.
Giriş çıktısı ayarı altında, oluşturulan toplu iş ve çıktı klasörünü seçin. Görüntülerin işlenmesi için işlem basın ve görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. El yazması talimatlara göre cellprofiler ile nükleer nicelik gerçekleştirin.
Radyasyonla tedavi edilmeyen hücreler çok az gama H2AX expo işareti sergilerler. Temel DNA onarım proteinlerinin yokluğunda, DNA kırıklarında gama H2AX birikimi görülebilir. Onarılmamış sonları birikimi hücreleri katı gama H2AX çekirdekleri ile endike pre hipotonik hale yol açabilir.
Işınlama dan sonra, çekirdekler gama H2AX lokalize son derece hızlı bir çift telli molalar çok sayıda sergiler. Herhangi bir foci bir radyasyon yokluğunda gözlenen az iken foci sayısı bir iki dört ve 16 saat sonrası bir radyasyon ve NOA radyasyon kontrolü için sayısallaştırılmıştır. Ortaya çıkan biyolojik soruya ve gerekli veri türüne bağlı olarak, farklı hayvan türlerinde ortaya çıkan primer antikorların çokkatlılaştırılması ve ikincil antikorlar kullanılarak farklı floresanlarla etiketlenerek, farklı çizim seçenekleri nin Colocalization olarak düşünülmesi gerekir.
Yeşil ve kırmızının süperpozisyonu, sarı sıcak noktalara yol açar, ilgi iki protein aynı piksel mevcuttur. Kolocalzizasyonun nicel analizi, nesne tabanlı bir yaklaşım la veya yoğunluk korelasyon katsayısı tabanlı analizleri gerçekleştiren istatistiksel bir yaklaşımla elde edilebilir. Bu protokolde farklı hayvan türlerinde yetiştirilen birincil antikorların bir kombinasyonu kullanılabilir.
Antikorların uyumlu olduğundan ve birbirine karışmadığından emin olun. Birincil antikorların her birine karşı kullanılacak ikincil antikorları uygun şekilde ayarlamanız ve kullanılacak daha az kuvveti seçerken belirli bir spektral çakışmayı göz önünde bulundurmanız gerekir. Kolokalizasyon veya proteinler olası doğrudan etkileşimleri gösterir.
Bu hücrelerde granüler yağış ile doğrulanabilir, ya da doğrudan in vitro saflaştırılmış proteinler kullanılarak aşağı koymak.
