Name: visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique at JoVE.com

Dr T. Helleday fiber tekniği yanı sıra yararlı bir tartışma için laboratuar üyeleri ile yardım ve Dr E. Petermann teşekkür ederim. WN, Uluslararası Kanser Araştırma Derneği Kıdemli Uluslararası Araştırma Bursu ve Bilimsel Araştırma hibe (N301 165.935) Polonya Devlet Komitesi tarafından desteklenmektedir.

Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5: Bu yöntem şu yayında kullanılan Burada anlatılan. 1. DT40 hücre Kültür Malzemeler: Fetal sığır serumu (FBS), tavuk serumu, penisilin / streptomisin, 2 merkaptoetanol, RPMI <ol><li> Hücre kültürü ortamı hazırlayın:% 7 FBS eklemek,% 3 tavuk serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 10 mcM 2-merkaptoetanol RPMI medyum. </li><li> DT40 hücreler steril hücre kültürü şişeleri yetiştirilen 38 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmelidir inkübatör. 5 x 5 10 hücre / ml 6 yoğunluğu her geçen gün hücreleri bölme. </li></ol> 2 in vivo etiketleme Malzemeler: EUK, CldU <ol><li> Nükleotid analogları stok çözümleri hazırlayın: 5 mM ve CldU orta ve 2.5 mM IDU çözülür. Her iki çözümü de kısaca 60 Isı ° C ve nükleotid analog kadar vorteksues tamamen çözülür. </li><li> 25 mcM DT40 hücreler katlanarak büyüyen bir final konsantrasyonu IDU ekleyin ve hücre süspansiyonu iyi karıştırın. 38 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri 20 dakika inkübe. </li><li> Ilk etiket ile inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 250 mcM CldU eklemek ve önceki adımda açıklandığı gibi hücre tedavisi. </li><li> Hücreleri buz PBS ile yıkayın ve 7.5 x 10 5 hücre / ml soğuk PBS bir konsantrasyon onları tekrar süspansiyon haline getirin. Etiketli hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol> Açıklanan etiketleme işlemi sadece bir öneridir ve özel soruları yanıtlamak için modifiye edilebilir. Deneysel tasarım hakkında daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakınız. 3. Hücre parçalama ve DNA yayılıyor Malzemeler: Cam slaytlar, lif lizis çözüm <ol><li> 200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA ve% 0.5 SDS: fiber lizis çözüm hazırlayın </li><liCam slayt sonuna kadar bir hücre süspansiyonu&gt; Spot 2 ul. Hava kuru, 5 dakika veya damla hacminin kadar büyük ölçüde azalır, ancak kuru değildir. </li><li> Pipetleyin 7 ul lizis hücre süspansiyonu çözüm ve çözümler karıştırmak için pipet ucu ile hafifçe karıştırın. Devam etmek için hücre erimesi için 2 dakika inkübe edin. </li><li> 15 ° lifleri slayt yayılabilir izin slaytlar yatırın. </li><li> Fiber çözümü slayt alt ulaştığında, kuru hava yatay olarak yerleştirin. Kuruduktan sonra ince, opak bir çizgi slayt boyunca görünür olmalıdır. Bu noktada, çizgi artık görünür olmayacak boyandıktan sonra gergin liflerin başında bir kalem ile işaretlenmiş olmalıdır. Bu işaret, daha sonra mikroskop altında lifleri bulmak için yardımcı olacaktır. </li></ol> 4. Immünofloresan boyaması Malzemeler: Metanol, asetik asit, HCl, PBS içinde% 5 BSA, boyama kavanoz, anti-BrdU (fare) antikor,anti-BrdU (sıçan) antikor, koyun anti-fare Cy3 antikor, keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 antikor, Vectashield montaj orta lamelleri, oje <ol><li> Metanol / asetik asit (3:1), 10 dakika boyunca bir boyama kavanoz ve inkübe daldırın slaytlar. </li><li> 80 dakika sonra 2.5 M HCl batırmayın distile H 2 O slaytlar, yıkayın. </li><li> Yıkama 5 dakika PBS içinde üç kez slaytlar. </li><li> Boyama kavanoz slaytları çıkarın ve kağıt havlu ile fazla PBS toplamak. Slaytları yatay olarak yerleştirin ve her slaytın üstüne pipetlemeyin% 5 BSA. BSA slayt üzerinde eşit biçimde yaymak ve 20 dakika boyunca inkübe slaytları bir lamel ile hafifçe örtün. </li><li> 01:25 anti-BrdU (fare) ve 1:400 anti-BrdU (sıçan):% 5 BSA aşağıdaki konsantrasyonlarda primer antikorlar sulandırınız. </li><li> Çıkarmak için cam slayt aşağı lamel yavaşça hareket ettirin. Kapak kayma slayt yapışıyor kuvvet uygulamayın. Lamel gevşek bir hale gelinceye kadar slayt PBS rehidrated kolaylıkla silinebilir. Bir kağıt havlu ile fazla BSA toplayın ve slaytlar yatay olarak yerleştirin. Her bir slayt üzerine primer antikor çözüm pipetleyin 50 ul. Slayt üzerinde eşit antikor çözüm yaymak ve nemlendirilmiş bir odasında 2 saat süreyle inkübe bir lamel ile tekrar örtün. </li><li> Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak </li><li> : Aşağıdaki konsantrasyonlarda 1:500 koyun anti-fare Cy3 ve 1:400 keçi anti-fare Alexa Fluor 488% 5 BSA sekonder antikor sulandırınız. </li><li> 50 primer antikorlar için açıklandığı gibi ikincil antikor çözüm ul uygulayın. Işık ve 1 saat süreyle inkübe slaytlar koruyun. </li><li> Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak. </li><li> Her bir slayt üzerine Vectashield montaj orta bir damla ekleyin ve bir lamel uygulayın. Lamelleri hafifçe basın ve kağıt havlu ile çevresinde aşırı sıvı kaldırmak. Seal lamelleri şeffaf tırnak polish ve onlara kuru sağlar. -20 ° C&#39;de slaytlar Mağaza </li></ol> 5. Görüntü elde etme Malzemeler: floresan mikroskop, kamera Kalem işareti yakın bir slayt üzerine bir damla immersiyon yağı koyun ve liflerin yerini başlayın. Tipik olarak, bir ana elyaf demeti, ancak bu liflerin çok dolaşmış ve daha sonra analiz edilemez. Lifleri (Şekil 2) birbirinden açıkça ayrılmış alanlar bulmak için ana paket uzağa taşıyın. Biz sadece önyargı önlemek için tek bir renk kanalı kullanarak resimleri seçmek. Sonra, her bir zaman noktasında, konsantrasyon veya hücre hattının yaklaşık 10 fotoğraf çekmek. Ancak, resimlerin sayısı her resmi sayılır kaç lifleri bağlıdır. Bir slayt bir bölge temsilcisi fiber uzunluğu veya çoğaltma yapıları sağlamak değil, farklı fotoğraf çekmek için slayt boyunca hareket ettirin. 6. Veri analizi Malzemeler: Resim analiz programı, örneğin ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) İthalat bir resim analiz programı resim. Uzunlukları ölçün lif yolları ve / veya farklı çoğaltma yapıları sayısı (Şekil 3). Sadece resmin kenarına uzatmak açıkça görülebilir ve liflerin sayısı. Biz genellikle yaklaşık 100 liflerinin uzunluğu ölçmek ve 150-200 çoğaltma yapıların sayısı ve bireysel deneyler en az üç kez tekrarlayın. 7. Temsilcisi Sonuçlar: Yeni çoğaltılmış DNA antikor etiketli nükleotid analogları hatları olarak görüntülenebilir. Deneyler devam eden bir çatal bitişik kırmızı ve yeşil sinyaller (Şekil 3) olarak temsil edilir. Çift etiketleme protokolü de bize çoğaltma yapıları dört ana sınıfı tanımlamak için izin verir: 1) yeni başlanması olayları divid olabilir<html> hücreleri ilk etiket ve ikinci etiketi ile inkübasyon sırasında ateş kökenleri ile inkübe edildi ateş var kökenleri içine ed. Eski komşu, yeşil-kırmızı-yeşil sinyaller ve yeşil hat sadece ikinci oluşur. 2) fesih olaylar bitişik kırmızı-yeşil-kırmızı sinyaller olarak tezahür eder. 3) serpiştirilmiş kökenleri dizilmesinin kökeni ile genom siteleri. Bu tür siteler, ardışık kökenleri ve sonlandırma sinyalleri oluşur. 4), deneysel tasarım bağlı olarak durdu / çökmüş çatal ya da yalnızca kırmızı bir sinyal 7 veya daha kısa bir yeşil yolu 8,9 takip eden bir kırmızı çizgi olarak tarif edilebilir. Koşullar vahşi tip DT40 hücreleri ortalama çatal hızı 0.4 mm / dak, burada açıklanan. Biz yaklaşık% 63,% 10 devam eden çatal kökenleri,% 16 durmuş çatal (kırmızı tek yollarında),% 8 sonlandırmaları ve% 3 serpiştirilmiş lifleri algılayabilir. <html> ure 1 &quot;/&gt; Şekil 1 (A) karikatür sol tarafta DNA etiketleme prosedürünün ilk adımı anlatıyor: katlanarak büyüyor DT40 hücrelere IDU ekleyerek kolayca yeni sentezlenen DNA ipliklerini önde gelen ve geri kalmış dahil nükleotid analog açar. Bu spesifik antikor kullanarak görüntülendi olabilir ve mikroskop altında bakıldığında kırmızı bir çizgi olarak görünecektir. Daha sonra, bu rakam sağ tarafta gösterildiği gibi aynı prosedürü CldU tekrarlanır. Ikinci nükleotid analoğu ile inkübasyondan sonra, aktif bir çatal bitişik kırmızı-yeşil bir yolu olarak görülebilir. Ortalama lif uzunluğu nükleotid analogları inkübasyon süresi ile doğru orantılıdır. (B) parçalanan DT40 hücrelerin DNA, bir mikroskop lamı üzerine ağırlık gergin ve nükleotid analogları dahil spesifik antikorların kullanımı ve floresan mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. igure 2 &quot;/&gt; Şekil 2 bir temsilci floresan görüntü daha sonra her 20 dakika için IDU ve CldU etiketli yabani tip DT40 hücreleri lif gösterir . Liflerinin çoğu birbirinden ayrılır ve böylece kolayca analiz edilebilir. 10 mikron beyaz çubuğu temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 çift etiketleme fiber tekniği biri farklı çoğaltma yapıları arasında ayırt etmek için izin verir; 1 - aktif kopyalayan çatal, 2 - DNA replikasyonu (yeni kökeni ateş), 3 yeni siteleri - çatal sonlandırmaları (iki yakınsak çatal), 4 - serpiştirilmiş lifler (dizilmesinin kökeni siteleri) ve 5 - durmuş çatal (kırmızı sinyal).

<ol>
	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz tek bir molekül düzeyinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametrelerin kantitatif analiz için veren bir yöntem açıklanmaktadır. Geçtiğimiz on yıl içinde, DNA fiber Fluorografi tekniği farklı sürümleri, canlı hücreler içinde bireysel çoğaltma çatal hareket görselleştirmek için geliştirilmiştir. Tüm bu tekniklerin kritik parametre ayrılmış DNA liflerinin sağlayan cam yüzeyler üzerinde DNA uzanan mümkün olan en iyi ulaşmak için kullanılan bir işlemdir. Bunu başarmak için çok önemli bir adım mikroskop lamı gibi lizis zaman hücre süspansiyonu inkübasyon süresi. Bu parametreler, belirli bir laboratuarda sıcaklık ve hava akımı bağlıdır ve ampirik olarak tespit edilmelidir. DNA fiber deney pratik kısmı genellikle bir gün içinde gerçekleştirilir. Ancak, sonraki bir görüntü elde edilmesi ve analizi daha zaman alıcı ve pratik gerektirir. Etiketleme protokol reklam olabilirçeşitli bilimsel sorunlara cevap Apted: ikinci darbe etiketleme sırasında çoğaltma engelleyen bir ajan kullanarak çatal uzama / replikatif stres yanıt durdurduklarını izler. Bu senaryoda, ilk etiket ikinci nükleotid olarak yıkanabilir gerekmez aşırı eklenir. Alternatif olarak, çoğaltma engelleyen ilaçların kombinasyonu ya da sadece ilk etiket eklenmesinden sonra kullanılabilir. Bu ilk etiket gerektirir ve ikinci nükleotid analog önce çıkarılması için ilaç uygulanır. Bu prosedür, bir replikatif stres koşulları altında (yani çatal durdurduklarını ve / veya daraltmak) replikatif çatal istikrar / kurtarma çeşitli DNA onarım faktörlerin önemini belirlemek için olanak sağlar. Kayda Değer, DNA replikasyonu programı özelliklerden penye DNA ve floresan in situ hibridizasyon birleştiren bir alternatif yaklaşımların kullanımı ile daha detaylı bir analiz yapılabilir. Ancak bu, teknik olarak daha zor ve pahalı gerektirirsive donanımları. , Kalitatif ve kantitatif DNA replikasyonu hususlar analiz yeteneği, DNA replikasyonu kendisi kusurlar gibi çoğaltma çatal ile ilişkili genomik istikrarsızlık bastırmak yollar araştırıyor için gerekli bir araç sağlar. Kuşkusuz, bu testte daha normal hücrelere yanıt / kanser hücrelerini çoğaltma çatal hedefleyen ilaçların toksisitesi direnmek için bu mekanizmaları kullanan yanı sıra çevresel değişimlere uyum sağlayan çoğaltma aracılı DNA onarım mekanizmaları ışık tutacak yardımcı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Fetal sığır serumu altın (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Tavuk serum </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Iodo-2&#39;-dezoksiuridin (EUK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Kloro-2&#39;-deoksi-üridin (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop SuperFrost slaytlar </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Kapak No1 fişleri </td><td> Bilimsel laboratuar suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield montaj orta </td><td> H-1000 Vektör laboratuar </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU antikor (fare) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU antikor (sıçan) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> koyun anti-fare Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 antikor </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

Replikasyon çatalı istikrar Bakım canlılığını korumak ve hastalığı önlemek için hücrelerin bölünmesi için büyük önem taşımaktadır. Ilgili süreçleri sadece endojen ve eksojen DNA hasarı karşısında sadık genom çoğaltılması sağlamak değil, aynı zamanda genomik instabilite, tümör gelişimini tanınmış bir etken faktörü engel değildir. Burada, basit ve maliyet-etkin floresan mikroskopi tabanlı DT40 kuş B-hücre hattı DNA replikasyonu görselleştirmek için yöntem açıklanmaktadır. Bu hücre hattı, omurgalı hücreler 1 ters genetik in vivo protein fonksiyonunu araştırmak için güçlü bir araç sağlar . Belirli bir geni eksik DT40 hücrelerinde DNA lif Fluorografi biri bu gen ürünü, DNA replikasyonu ve genom istikrar fonksiyonu açıklamak için izin verir. Omurgalı hücreler replikasyon çatal dinamiklerini analiz etmek için geleneksel yöntemlerle bir nüfus darbe etiketli hücrelerinin DNA sentezi genel oranı ölçüm güveniyor. Bu niceliksel bir yaklaşımdır ve DNA sentezi etkileyen parametrelerin nitel analiz için izin vermiyor. Buna karşın, DNA fiber tekniği 2-4 kullanırken aktif çatal hareketinin hızı doğrudan takip edilebilir. Bu yaklaşımda, doğmakta olan DNA halojenli nükleotidler dahil (Şekil 1A), in vivo olarak etiketlenmiştir . Daha sonra bir mikroskop lamı üzerine, bireysel lifler gerilir ve etiketli DNA çoğaltma yolları spesifik antikor ile boyandı ve floresan mikroskobu (Şekil 1B) ile görünür. Çoğaltma gibi çatal yönlülük başlatılması, iki farklı analogları ardışık kullanımı ile belirlenir. Ayrıca, dual-etiketleme yaklaşımı S-fazında DNA sentezi etkileyen parametrelerin kantitatif analiz sağlar, yani devam eden ve durdu çatal, çoğaltma kökenli yoğunluğu yanı sıra çatal sonlandırmaları çoğaltma yapılar. Sonuç olarak, deneysel prosedür başarmak olabilir.ed, bir gün içinde sadece genel laboratuar cihazları ve floresan mikroskop gerektirir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique at JoVE.com

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

39.8K Görüntüleme.  University of Oxford. DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Video: Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetik

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that are incorporated during DNA synthesis in human cells. However, this technique has a limited resolution of a few thousand kilobases. Consequently, post-replicative single-stranded DNA (ssDNA) gaps as small as a few hundred bases are not detectable by the standard assay. Here, we describe a modified version of the DNA fiber assay that utilizes the S1 nuclease, an enzyme that specifically cleaves ssDNA. In the presence of post-replicative ssDNA gaps, the S1 nuclease will target and cleave the gaps, generating shorter tracts that can be used as a read-out for ssDNA gaps on ongoing forks. These post-replicative ssDNA gaps are formed when damaged DNA is replicated discontinuously. They can be repaired via mechanisms uncoupled from genome replication, in a process known as gap-filling or post-replicative repair. Because gap-filling mechanisms involve DNA synthesis independent of the S phase, alterations in the DNA fiber labeling scheme can also be employed to monitor gap-filling events. Altogether, these modifications of the DNA fiber assay are powerful strategies to understand how post-replicative gaps are formed and filled in the genome of human cells.

Here we describe two modifications of the DNA fiber assay to investigate single-stranded DNA gaps in replicating DNA after lesion induction. The S1 fiber assay enables the detection of post-replicative gaps using the ssDNA-specific S1 endonuclease, while the gap-filling assay allows visualization and quantification of gap repair.

DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>DNA Replikasyonu ve Çatal Durma Olaylarını Analiz Etmek için 2D Jel Elektroforezi

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Replikasyon Çatalı Durma ve Genişleme Mekanizmalarını Ortaya Çıkarmak için Patojenik Tekrarların DNA Replikasyonunu Karakterize Etme

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Yolu Büyümesi ile Gözlenen CMG Aracılı DNA Çözülmesi

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tek Moleküllü Görselleştirme Yoluyla Ökaryotik DNA Replikasyonunun Dinamiklerini Çözme

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi