Dr T. Helleday fiber tekniği yanı sıra yararlı bir tartışma için laboratuar üyeleri ile yardım ve Dr E. Petermann teşekkür ederim. WN, Uluslararası Kanser Araştırma Derneği Kıdemli Uluslararası Araştırma Bursu ve Bilimsel Araştırma hibe (N301 165.935) Polonya Devlet Komitesi tarafından desteklenmektedir.

Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5: Bu yöntem şu yayında kullanılan Burada anlatılan. 1. DT40 hücre Kültür Malzemeler: Fetal sığır serumu (FBS), tavuk serumu, penisilin / streptomisin, 2 merkaptoetanol, RPMI <ol><li> Hücre kültürü ortamı hazırlayın:% 7 FBS eklemek,% 3 tavuk serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 10 mcM 2-merkaptoetanol RPMI medyum. </li><li> DT40 hücreler steril hücre kültürü şişeleri yetiştirilen 38 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmelidir inkübatör. 5 x 5 10 hücre / ml 6 yoğunluğu her geçen gün hücreleri bölme. </li></ol> 2 in vivo etiketleme Malzemeler: EUK, CldU <ol><li> Nükleotid analogları stok çözümleri hazırlayın: 5 mM ve CldU orta ve 2.5 mM IDU çözülür. Her iki çözümü de kısaca 60 Isı ° C ve nükleotid analog kadar vorteksues tamamen çözülür. </li><li> 25 mcM DT40 hücreler katlanarak büyüyen bir final konsantrasyonu IDU ekleyin ve hücre süspansiyonu iyi karıştırın. 38 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri 20 dakika inkübe. </li><li> Ilk etiket ile inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 250 mcM CldU eklemek ve önceki adımda açıklandığı gibi hücre tedavisi. </li><li> Hücreleri buz PBS ile yıkayın ve 7.5 x 10 5 hücre / ml soğuk PBS bir konsantrasyon onları tekrar süspansiyon haline getirin. Etiketli hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol> Açıklanan etiketleme işlemi sadece bir öneridir ve özel soruları yanıtlamak için modifiye edilebilir. Deneysel tasarım hakkında daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakınız. 3. Hücre parçalama ve DNA yayılıyor Malzemeler: Cam slaytlar, lif lizis çözüm <ol><li> 200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA ve% 0.5 SDS: fiber lizis çözüm hazırlayın </li><liCam slayt sonuna kadar bir hücre süspansiyonu&gt; Spot 2 ul. Hava kuru, 5 dakika veya damla hacminin kadar büyük ölçüde azalır, ancak kuru değildir. </li><li> Pipetleyin 7 ul lizis hücre süspansiyonu çözüm ve çözümler karıştırmak için pipet ucu ile hafifçe karıştırın. Devam etmek için hücre erimesi için 2 dakika inkübe edin. </li><li> 15 ° lifleri slayt yayılabilir izin slaytlar yatırın. </li><li> Fiber çözümü slayt alt ulaştığında, kuru hava yatay olarak yerleştirin. Kuruduktan sonra ince, opak bir çizgi slayt boyunca görünür olmalıdır. Bu noktada, çizgi artık görünür olmayacak boyandıktan sonra gergin liflerin başında bir kalem ile işaretlenmiş olmalıdır. Bu işaret, daha sonra mikroskop altında lifleri bulmak için yardımcı olacaktır. </li></ol> 4. Immünofloresan boyaması Malzemeler: Metanol, asetik asit, HCl, PBS içinde% 5 BSA, boyama kavanoz, anti-BrdU (fare) antikor,anti-BrdU (sıçan) antikor, koyun anti-fare Cy3 antikor, keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 antikor, Vectashield montaj orta lamelleri, oje <ol><li> Metanol / asetik asit (3:1), 10 dakika boyunca bir boyama kavanoz ve inkübe daldırın slaytlar. </li><li> 80 dakika sonra 2.5 M HCl batırmayın distile H 2 O slaytlar, yıkayın. </li><li> Yıkama 5 dakika PBS içinde üç kez slaytlar. </li><li> Boyama kavanoz slaytları çıkarın ve kağıt havlu ile fazla PBS toplamak. Slaytları yatay olarak yerleştirin ve her slaytın üstüne pipetlemeyin% 5 BSA. BSA slayt üzerinde eşit biçimde yaymak ve 20 dakika boyunca inkübe slaytları bir lamel ile hafifçe örtün. </li><li> 01:25 anti-BrdU (fare) ve 1:400 anti-BrdU (sıçan):% 5 BSA aşağıdaki konsantrasyonlarda primer antikorlar sulandırınız. </li><li> Çıkarmak için cam slayt aşağı lamel yavaşça hareket ettirin. Kapak kayma slayt yapışıyor kuvvet uygulamayın. Lamel gevşek bir hale gelinceye kadar slayt PBS rehidrated kolaylıkla silinebilir. Bir kağıt havlu ile fazla BSA toplayın ve slaytlar yatay olarak yerleştirin. Her bir slayt üzerine primer antikor çözüm pipetleyin 50 ul. Slayt üzerinde eşit antikor çözüm yaymak ve nemlendirilmiş bir odasında 2 saat süreyle inkübe bir lamel ile tekrar örtün. </li><li> Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak </li><li> : Aşağıdaki konsantrasyonlarda 1:500 koyun anti-fare Cy3 ve 1:400 keçi anti-fare Alexa Fluor 488% 5 BSA sekonder antikor sulandırınız. </li><li> 50 primer antikorlar için açıklandığı gibi ikincil antikor çözüm ul uygulayın. Işık ve 1 saat süreyle inkübe slaytlar koruyun. </li><li> Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak. </li><li> Her bir slayt üzerine Vectashield montaj orta bir damla ekleyin ve bir lamel uygulayın. Lamelleri hafifçe basın ve kağıt havlu ile çevresinde aşırı sıvı kaldırmak. Seal lamelleri şeffaf tırnak polish ve onlara kuru sağlar. -20 ° C&#39;de slaytlar Mağaza </li></ol> 5. Görüntü elde etme Malzemeler: floresan mikroskop, kamera Kalem işareti yakın bir slayt üzerine bir damla immersiyon yağı koyun ve liflerin yerini başlayın. Tipik olarak, bir ana elyaf demeti, ancak bu liflerin çok dolaşmış ve daha sonra analiz edilemez. Lifleri (Şekil 2) birbirinden açıkça ayrılmış alanlar bulmak için ana paket uzağa taşıyın. Biz sadece önyargı önlemek için tek bir renk kanalı kullanarak resimleri seçmek. Sonra, her bir zaman noktasında, konsantrasyon veya hücre hattının yaklaşık 10 fotoğraf çekmek. Ancak, resimlerin sayısı her resmi sayılır kaç lifleri bağlıdır. Bir slayt bir bölge temsilcisi fiber uzunluğu veya çoğaltma yapıları sağlamak değil, farklı fotoğraf çekmek için slayt boyunca hareket ettirin. 6. Veri analizi Malzemeler: Resim analiz programı, örneğin ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) İthalat bir resim analiz programı resim. Uzunlukları ölçün lif yolları ve / veya farklı çoğaltma yapıları sayısı (Şekil 3). Sadece resmin kenarına uzatmak açıkça görülebilir ve liflerin sayısı. Biz genellikle yaklaşık 100 liflerinin uzunluğu ölçmek ve 150-200 çoğaltma yapıların sayısı ve bireysel deneyler en az üç kez tekrarlayın. 7. Temsilcisi Sonuçlar: Yeni çoğaltılmış DNA antikor etiketli nükleotid analogları hatları olarak görüntülenebilir. Deneyler devam eden bir çatal bitişik kırmızı ve yeşil sinyaller (Şekil 3) olarak temsil edilir. Çift etiketleme protokolü de bize çoğaltma yapıları dört ana sınıfı tanımlamak için izin verir: 1) yeni başlanması olayları divid olabilir<html> hücreleri ilk etiket ve ikinci etiketi ile inkübasyon sırasında ateş kökenleri ile inkübe edildi ateş var kökenleri içine ed. Eski komşu, yeşil-kırmızı-yeşil sinyaller ve yeşil hat sadece ikinci oluşur. 2) fesih olaylar bitişik kırmızı-yeşil-kırmızı sinyaller olarak tezahür eder. 3) serpiştirilmiş kökenleri dizilmesinin kökeni ile genom siteleri. Bu tür siteler, ardışık kökenleri ve sonlandırma sinyalleri oluşur. 4), deneysel tasarım bağlı olarak durdu / çökmüş çatal ya da yalnızca kırmızı bir sinyal 7 veya daha kısa bir yeşil yolu 8,9 takip eden bir kırmızı çizgi olarak tarif edilebilir. Koşullar vahşi tip DT40 hücreleri ortalama çatal hızı 0.4 mm / dak, burada açıklanan. Biz yaklaşık% 63,% 10 devam eden çatal kökenleri,% 16 durmuş çatal (kırmızı tek yollarında),% 8 sonlandırmaları ve% 3 serpiştirilmiş lifleri algılayabilir. <html> ure 1 &quot;/&gt; Şekil 1 (A) karikatür sol tarafta DNA etiketleme prosedürünün ilk adımı anlatıyor: katlanarak büyüyor DT40 hücrelere IDU ekleyerek kolayca yeni sentezlenen DNA ipliklerini önde gelen ve geri kalmış dahil nükleotid analog açar. Bu spesifik antikor kullanarak görüntülendi olabilir ve mikroskop altında bakıldığında kırmızı bir çizgi olarak görünecektir. Daha sonra, bu rakam sağ tarafta gösterildiği gibi aynı prosedürü CldU tekrarlanır. Ikinci nükleotid analoğu ile inkübasyondan sonra, aktif bir çatal bitişik kırmızı-yeşil bir yolu olarak görülebilir. Ortalama lif uzunluğu nükleotid analogları inkübasyon süresi ile doğru orantılıdır. (B) parçalanan DT40 hücrelerin DNA, bir mikroskop lamı üzerine ağırlık gergin ve nükleotid analogları dahil spesifik antikorların kullanımı ve floresan mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. igure 2 &quot;/&gt; Şekil 2 bir temsilci floresan görüntü daha sonra her 20 dakika için IDU ve CldU etiketli yabani tip DT40 hücreleri lif gösterir . Liflerinin çoğu birbirinden ayrılır ve böylece kolayca analiz edilebilir. 10 mikron beyaz çubuğu temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 çift etiketleme fiber tekniği biri farklı çoğaltma yapıları arasında ayırt etmek için izin verir; 1 - aktif kopyalayan çatal, 2 - DNA replikasyonu (yeni kökeni ateş), 3 yeni siteleri - çatal sonlandırmaları (iki yakınsak çatal), 4 - serpiştirilmiş lifler (dizilmesinin kökeni siteleri) ve 5 - durmuş çatal (kırmızı sinyal).

<ol>
	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz tek bir molekül düzeyinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametrelerin kantitatif analiz için veren bir yöntem açıklanmaktadır. Geçtiğimiz on yıl içinde, DNA fiber Fluorografi tekniği farklı sürümleri, canlı hücreler içinde bireysel çoğaltma çatal hareket görselleştirmek için geliştirilmiştir. Tüm bu tekniklerin kritik parametre ayrılmış DNA liflerinin sağlayan cam yüzeyler üzerinde DNA uzanan mümkün olan en iyi ulaşmak için kullanılan bir işlemdir. Bunu başarmak için çok önemli bir adım mikroskop lamı gibi lizis zaman hücre süspansiyonu inkübasyon süresi. Bu parametreler, belirli bir laboratuarda sıcaklık ve hava akımı bağlıdır ve ampirik olarak tespit edilmelidir. DNA fiber deney pratik kısmı genellikle bir gün içinde gerçekleştirilir. Ancak, sonraki bir görüntü elde edilmesi ve analizi daha zaman alıcı ve pratik gerektirir. Etiketleme protokol reklam olabilirçeşitli bilimsel sorunlara cevap Apted: ikinci darbe etiketleme sırasında çoğaltma engelleyen bir ajan kullanarak çatal uzama / replikatif stres yanıt durdurduklarını izler. Bu senaryoda, ilk etiket ikinci nükleotid olarak yıkanabilir gerekmez aşırı eklenir. Alternatif olarak, çoğaltma engelleyen ilaçların kombinasyonu ya da sadece ilk etiket eklenmesinden sonra kullanılabilir. Bu ilk etiket gerektirir ve ikinci nükleotid analog önce çıkarılması için ilaç uygulanır. Bu prosedür, bir replikatif stres koşulları altında (yani çatal durdurduklarını ve / veya daraltmak) replikatif çatal istikrar / kurtarma çeşitli DNA onarım faktörlerin önemini belirlemek için olanak sağlar. Kayda Değer, DNA replikasyonu programı özelliklerden penye DNA ve floresan in situ hibridizasyon birleştiren bir alternatif yaklaşımların kullanımı ile daha detaylı bir analiz yapılabilir. Ancak bu, teknik olarak daha zor ve pahalı gerektirirsive donanımları. , Kalitatif ve kantitatif DNA replikasyonu hususlar analiz yeteneği, DNA replikasyonu kendisi kusurlar gibi çoğaltma çatal ile ilişkili genomik istikrarsızlık bastırmak yollar araştırıyor için gerekli bir araç sağlar. Kuşkusuz, bu testte daha normal hücrelere yanıt / kanser hücrelerini çoğaltma çatal hedefleyen ilaçların toksisitesi direnmek için bu mekanizmaları kullanan yanı sıra çevresel değişimlere uyum sağlayan çoğaltma aracılı DNA onarım mekanizmaları ışık tutacak yardımcı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Fetal sığır serumu altın (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Tavuk serum </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Iodo-2&#39;-dezoksiuridin (EUK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Kloro-2&#39;-deoksi-üridin (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop SuperFrost slaytlar </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Kapak No1 fişleri </td><td> Bilimsel laboratuar suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield montaj orta </td><td> H-1000 Vektör laboratuar </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU antikor (fare) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU antikor (sıçan) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> koyun anti-fare Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 antikor </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

Replikasyon çatalı istikrar Bakım canlılığını korumak ve hastalığı önlemek için hücrelerin bölünmesi için büyük önem taşımaktadır. Ilgili süreçleri sadece endojen ve eksojen DNA hasarı karşısında sadık genom çoğaltılması sağlamak değil, aynı zamanda genomik instabilite, tümör gelişimini tanınmış bir etken faktörü engel değildir. Burada, basit ve maliyet-etkin floresan mikroskopi tabanlı DT40 kuş B-hücre hattı DNA replikasyonu görselleştirmek için yöntem açıklanmaktadır. Bu hücre hattı, omurgalı hücreler 1 ters genetik in vivo protein fonksiyonunu araştırmak için güçlü bir araç sağlar . Belirli bir geni eksik DT40 hücrelerinde DNA lif Fluorografi biri bu gen ürünü, DNA replikasyonu ve genom istikrar fonksiyonu açıklamak için izin verir. Omurgalı hücreler replikasyon çatal dinamiklerini analiz etmek için geleneksel yöntemlerle bir nüfus darbe etiketli hücrelerinin DNA sentezi genel oranı ölçüm güveniyor. Bu niceliksel bir yaklaşımdır ve DNA sentezi etkileyen parametrelerin nitel analiz için izin vermiyor. Buna karşın, DNA fiber tekniği 2-4 kullanırken aktif çatal hareketinin hızı doğrudan takip edilebilir. Bu yaklaşımda, doğmakta olan DNA halojenli nükleotidler dahil (Şekil 1A), in vivo olarak etiketlenmiştir . Daha sonra bir mikroskop lamı üzerine, bireysel lifler gerilir ve etiketli DNA çoğaltma yolları spesifik antikor ile boyandı ve floresan mikroskobu (Şekil 1B) ile görünür. Çoğaltma gibi çatal yönlülük başlatılması, iki farklı analogları ardışık kullanımı ile belirlenir. Ayrıca, dual-etiketleme yaklaşımı S-fazında DNA sentezi etkileyen parametrelerin kantitatif analiz sağlar, yani devam eden ve durdu çatal, çoğaltma kökenli yoğunluğu yanı sıra çatal sonlandırmaları çoğaltma yapılar. Sonuç olarak, deneysel prosedür başarmak olabilir.ed, bir gün içinde sadece genel laboratuar cihazları ve floresan mikroskop gerektirir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique at JoVE.com

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

39.7K Görüntüleme.  University of Oxford. DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Video: Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biyoloji

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta ayıklar

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme