Name: visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide at JoVE.com

This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA Biyotinilasyon <ol><li> Terminal transferaz kullanılarak kör uçlu DNA biyotinilasyon (TdT) Not: künt uçlu DNA Kullan T4 DNA (166 kbp). <ol><li> 2.5 mM CoCl2, 10 x reaksiyon tamponu 5 ul 10 mM biyotin-11-dUTP ve 0.5 ul, terminal transferaz 0.5 ul (10 birim) ve T4 DNA 0.5 ul (0.5 ug / ul), 5 ul ekle reaksiyon karışımına. Su 38.5 ul ekleyerek 50 ul son hacim olması için yapın. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyon karışımı inkübe edin. Not: Genişletilmiş reaksiyon süresi, yani çift gergin DNA verebilir, biotins iki ucunda etiketlenmiş olması mümkündür. </li><li> 0.5 M EDTA, pH 8 5 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> 4 ° C&#39;de tüp tutun. </li></ol></li><li> DNA ligazı kullanılarak yapışkan uçlu DNA biyotinlenmesi Not: Bir yapışkan uç DNA Kullan λ DNA (48.5 kbp). &lt;ol&gt; <li> T4 DNA ligaz 1 ul 10 x ligasyon tampon maddesi 5 ul, 25 ng 1 ul ekle / λ faj DNA ul ve 50 ul bir son hacim yapmak için, su 43 ul ilave edin. </li><li> 4 ° C&#39;de tüp tutun. </li></ol></li></ol> 2. İşlevsel yüzey türetilmesi Not:. Şekil 1 &#39;de gösterildiği şekilde, cam yüzey üzerinde bir DNA molekülünün bir son halata için, bir birincil amin grubu biyotin-PEG kaplama ardından bir lamel silanlı olan bu PEGilasyon prosesi, tek bir molekül, DNA görüntüleme için önemlidir çünkü o önemli ölçüde yüzeyde istenmeyen moleküllerin eki tarafından oluşturulan rastgele gürültüyü azaltabilir. <ol><li> piranha Temizleme Not: Piranha çözümleri bu nedenle uygun güvenlik yönergeleri izleyerek, dikkatle ele alınmalıdır, organik malzemelerle şiddetle tepki. <ol><li> Bir yerde bir politetrafloroetilen (PTFE) rafa lamelleri, b onları tutuny PTFE boyuna iplik mühür bandı, raf üzerinde yüzeylerin kenarında ve yarım yarım. sarma sonra, temizlik işlemi sırasında raf işlemek için bant uzun parçası (~ 5 cm) bırakın. </li><li> SO, H2O 2 4 ve 150 ml davlumbaz pirana çözelti yapmak için H2, 350 ml 1 L cam beher. 2 saat pirana çözelti içinde raf yerleştirin. </li><li> beher su pH kadar iyonu giderilmiş su ile iyice boş kaptan pirana çözeltisi ve durulama lamelleri nötr ulaşır. pH kağıdı şeritleri kullanın. </li><li> 30 dakika süre ile, beher içeren su içinde kapak slipleri raflar sonikasyon. beher sadece amino silanizasyon önce boş su. cam yüzeylerin temizlenmesi ve türetmek için sonikasyon gücü 75 W kullanın. </li></ol></li><li> Cam Yüzeyinde Aminosilanization <ol><li> N 2 ml ilave edilir - [3- (trimetoksisilil) propil] etilendiamin ve 200 ml buzlu asetik asit 10 miaminosilanization çözeltisinin hazırlanması için temiz polipropilen kaba metil alkol. </li><li> polipropilen kaba temizlenmiş lamelleri yerleştirin. 30 dakika boyunca 100 rpm&#39;de ve oda ısısında çalkalanır. </li><li> W, en az 30 dakika boyunca 100 rpm&#39;de ve oda ısısında çalkalayın 75 ° C&#39;da 15 dakika için türetilmiş kapak slipleri ile beher sonikasyon. </li><li> etil alkol ile iki kez beher solüsyonun boşaltın ve metil alkol ile bir kez dikkatli bir şekilde lamelleri durulama ve. Mağaza etil alkolde lamelleri ve iki hafta içinde bunları kullanmak. </li></ol></li><li> Lamel PEGilasyon <ol><li> 0.1 M sodyum bikarbonat, 10 ml (NaHCO3) sağlayın. 0.22 um&#39;lik bir şırınga filtresi ile filtre solüsyonu. </li><li> Biyotin-PEG-süksinimidil karbonat (biyotin-PEG-SC) NaHCO 3 350 ul PEG-süksinimidil valerat 80 mg (mPEG-SVG) 2 mg eritin. hafif bir koruma tüpü kullanın. </li><li> 1 için kuvvetli bir şekilde tüp vorteks0 sn ve santrifüj o 1 dk kabarcıklarını çıkarmak için 10.000 x g&#39;de. </li><li> etil alkol ile yıkama, ardından aseton ile, bir cam slayt, durulayın. havaya slayt tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> temiz bir cam slayt PEG çözeltisi bir damla (50 ul) yerleştirin. herhangi bir kabarcıklar oluşturmadan, bir amino Silanlanmış kapak kayma ile hafifçe damlacık örtün. </li><li> 3 saat boyunca yer slaytlar gecede karanlıkta oda sıcaklığında nemli odasını iyi tesviye etmek. altta su ile oda olarak boş bir pipet ucu tutucu kullanın. tüp içinde kalan PEG çözeltisi kapatılır ve 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> iyonu giderilmiş su ile iyice PEG&#39;lenmiş lamel durulayın. kullanana kadar karanlık ve kuru bir yerde saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Bir akış odası Montaj <ol><li> . Şekil 2&#39;deki gibi, bir delikli akrilik tutucu imal boru ucun çapı 0.762 mm olduğundan emin olun ve bir delikli bir giriş olduğu tayin ve diğeribir çıkış (Şekil 2). </li><li> Herhangi bir kanal delik perturbing değil, bir giriş ve çıkış deliğine dik hizalama çift taraflı yapışkan bant şeritler akrilik tutucu (genişlik 5-6 mm) (Şekil 2), yerleştirin. Çok kanallı duvarları odaları yapmak için bu bant şeritlerini kullanın. Bir pipet ucu kullanılarak bandı fırçalayın. </li><li> yüzükoyun PEG&#39;lenmiş tarafı, akış odalarını yapmak için üstüne bir PEG&#39;lenmiş lamel yerleştirin. </li><li> sızıntı herhangi bir çözüm önlemek için, çift taraflı bantlar yerleştirilir alana bir lamel üstüne basın. Üst ve alt (Şekil 2&#39;de sarı renk) de odacığın kenarlarını kapatma çabuk kuruyan epoksi yapıştırıcı ekleyin. </li><li> Bir gaz geçirmeyen şırınga boru (dış çapı OD, 0.042 &quot;) arasında kısa bir parça (2.5 cm) geç ve epoksi yapıştırıcı ile bağlantıyı tıkamak. </li><li> şırınga ile bağlantılı boru ve epoksi yapıştırıcı ile ortak mühür: Uzun esnek borular (0.03 &quot;OD) bağlayın. </li><li> Tubi doldurunng DI su ile şırınga ile bağlantılı. hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> epoksi yapıştırıcı ile kapatılmış akış odasının deliğe boru yerleştirin. </li><li> bir rezervuar olarak diğer delik sarı ucu (200 ul ucu) yerleştirin. </li></ol> Akış Odası içine 4. Numune Yükleme Not: Neutravidin streptavidin gibi diğer avidin protein ile değiştirilebilir. Bu açıklanan sürece bütün tepkimeler, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. Sarı uç örnek çözümü almak ve akrilik tutucu (Şekil 2b) deliği üzerine solüsyonu ile ucu yükleyin. <ol><li> / Dakika, 50 ul şırınga pompa akış hızını ayarlayın. Yük avidin protein 20 ul (T50 çözeltisi içinde 25 ug / ml, 10 mM Tris, NaCl 50 mM, pH 8), 10 dakika için tutun. </li><li> Yük 20 biyotinlenmiş oligodeoksinükleotidler ul (1 x TE 100 uM) ve 10 dakika için tutun. terminal transferaz kullanılırsa, yükleme atlamakoligodeoksinükleotidler evi. </li><li> Yük 20 10 ul / dk&#39;lık bir akış oranında akış odasına Kademe 1 DNA çözeltisi ul ve 30 dakika için tutun. </li><li> 1 × TE ile akış odasına yıkayın ve FP-DBP 10 (~ 80 nM) 40 ul yükleyin. </li><li> 60X objektif lens 1 × TE boyama moleküllerin sürekli akış ile floresan mikroskop altında DNA gözlemleyin. FP (eGFP) -DBP uyarılması için 488 nm katı hal lazer kullanın. DNA moleküllerinin tam germek için, kullanılan DNA uzunluklarına göre farklı akış oranlarına uygulanır. Örneğin, T4 DNA 166 kbp için λ DNA 48.5 kbp, ve 100 ul / dakika 50 ul / dak uygulanır. <ol><li> Akrilik tutucu geri dönüşümü için, bir deterjan çözeltisi 12 monte akış odaları ıslatın. tamamen çıkarmak için elleriyle bir jilet ve ovalayın kasetleri ve epoksi çıkarın. şırınga iğneleri ile delikleri unclog. sonraki kullanıma kadar deiyonize su içinde tutucular tutun. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads.">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li><li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase.">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li><li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow.">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li><li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy.">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces.">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li><li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis.">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection.">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules.">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada yüzeylerde ankraj için biyotinile uzun DNA moleküllerini görselleştirmek için bir platform sunuyoruz. Bu biyotinile sığır serum albümini ile bir avidin protein kaplı yüzey üzerine gergin DNA molekülleri için bir yaklaşım. 6. önceki yaklaşımda bildirmiştir, biz gergin DNA moleküllerini leke bis-interkalasyon boyalar neden olduğu DNA verilmedi-parçalanmasının önemli bir sorun bulduk yüzey. Bu sürekli heyecanlı fluorophores uyarma ışık güç foto-bölünme önlemek için m...

Cam ya da topuk kısmı yüzeylerinde gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme DNA alt tabakası, 1,2 ve polimer fizik DNA-protein etkileşimleri, protein dinamiği araştırmak için kullanılmıştır. 3,4 tek gergin büyük DNA molekülleri için bir platform tat birkaç var avantajlar diğer DNA immobilizasyon yöntemlerine göre. 5 İlk olarak, yüzey üzerinde gergin büyük bir DNA molekülü bağlanma sitesi tanıyan bir DNA-bağlama proteini için kritik öneme sahip olan bir kesme akışı olmadan doğal rasgele sargı bir biçime sahiptir. İkinci olarak, bir akış odasının enzimatik reaksiyonlar için bir dizi DNA molekülüne kimyasal ortamı değiştirmek oldukça kolaydır. Üçüncü olarak, bir mikroakışkan kesme akımı alternatif DNA uzama kullanarak elde etmek çok zordur tam kontur uzunluğu,% 100 kadar uzanan moleküler DNA, yüzey immobilizasyon 6 ve nanochannel hapsi olarak yaklaşımları neden olur. 7 A stretche tamD bir DNA molekülü genomik haritada enzimatik hareketlerini izlemek için yararlı olabilir konumsal bilgi sağlar. Bununla birlikte, DNA, bağlama yaklaşım, YOYO-1 genel olarak, bağlı DNA molekülleri kolaylıkla flüoresan uyarma ışık kırılması neden olduğu için bu araya eklenen boyanın önemli bir dezavantajı vardır. Genel olarak, büyük DNA moleküllerinin bir flüoresan mikroskobu altında görüntülenmesi için bir floresan boya ile boyanmış olması gerekir. Bu amaçla, YOYO-1, ya da diğer TOTO serisi boyalar da iki-şeritli DNA interkalasyon olduğunda bu boyalar, sadece floresan için öncelikle kullanılır. 8 Bununla birlikte, bis-araya eklenen boyanın ışık kaynaklı DNA verilmedi-bölünme için neden olduğu iyi bilinmektedir fluorophores ardalanması. 9 ayrıntılı bir yüzeyde gergin floresan lekeli DNA molekülleri kesme akımları serbestçe DNA moleküllerini hareketli kuvvetleri kırılma uygulamak beri daha kırılgandır. Bu nedenle, biz bir roman D olarak FP-DBP geliştirdiyüzey üzerinde gergin büyük DNA moleküllerini görüntülenmesi için NA-boyama Protein boya. AP-DBP kullanmanın avantajı, bunun bağlandığı DNA moleküllerinin verilmedi-bölünmesini neden olmasıdır. 10. Ayrıca bis-interkalasyon boyalar çevre uzunluğu artmakta, AP-DBP, DNA çevre uzunluğu artmaz yaklaşık% 33. Bu video yöntemi PEG-biyotin yüzeye büyük DNA moleküllerini hayvan zinciri için deneysel bir yaklaşım getirmektedir. 1 küt uçlar ve yapışkan uçları ile DNA tethering farklı yaklaşımlar göstermektedir Şekil. Bu durumda, bu boyama yöntemi, DNA molekülünün her türlü uygulanabilir. 2 DNA moleküllerini germek için ve kimyasal ve enzimi yüklemek için kesme akışı üretmek üzere bir şırınga pompası ile kontrol edilebilir akış odası düzeneğinin şematik bir temsilini tasvir etmektedir çözümler. Şekil 3 PEGylat üzerinde gergin tamamen gerilmiş DNA moleküllerinin mikrograflarını gösteriyorEd yüzeyi 11 ve AP-DBP ile boyandı.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. DNA Biotinylation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP is also available</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Provided with 10x reaction buffer</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Also available at New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Functionalized Surface Derivatization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.1) Piranha Cleaning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness</td></tr><tr><td>Teflon rack</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>PTFE Thread Seal Tape</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&amp;trade; tape</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 95% Purity</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 35% in water</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.2) Aminosilanization on Glass Surface&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]&lt;br/&gt; ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Methyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td>Polypropylene Container</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.3) PEGylation of the coverslip&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Assembling a Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acrylic Support</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>3M</td><td></td><td>Transparent type</td></tr><tr><td>Quick-dry Epoxy</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gas Tight 250 &amp;micro;l Syringe</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Sample Loading into Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state Laser (488&amp;nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

Şekil 1, 1b, Şekil. Şekil 1a yapışkan uçlu DNA moleküllerinin avidin kaplı PEG yüzeyi üzerinde hareketsiz tamamlayıcı biyotinile oligonükleotid ile melezlenir verilmektedir. DNA molekülünün ucu yapısına bağlı olarak, iki farklı DNA bağlama yöntemleri gösterir eklenmesini gösterir biyotinile ddNTP veya terminal transferaz ile kör uçlu DNA 3 &#39;hidroksil grubuna dNTP. Bu DNA moleküllerinin yapıları ve biyoti...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide at JoVE.com

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Görüntüleme.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Video: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Biyokimya

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

<meta charset="utf8"></head><body>DNA Perdeleri Homolog Rekombinasyon Sırasında Karmaşık Moleküler Sistemlere Işık Tutuyor

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

DNA Perdeleri Homolog Rekombinasyon Sırasında Karmaşık Moleküler Sistemlere Işık Tutuyor

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetik

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Biyoloji

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>Tek moleküllü çalışmalar için yerinde nükleozom sulandırması

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tek Moleküllü Teknikler için Verimli Nükleozom Sulandırma

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

DNA Perdeleri Homolog Rekombinasyon Sırasında Karmaşık Moleküler Sistemlere Işık Tutuyor

DNA Perdeleri Homolog Rekombinasyon Sırasında Karmaşık Moleküler Sistemlere Işık Tutuyor

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği