Gen düzenleme modeli olmayan organizmaların moleküler genetiğini incelemek için popüler hale gelmiş olsa da, RNAi güçlü bir sinerjik araç olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı farklı gelişim evrelerine uygulanabilmektir. Buna ek olarak, kısmi nakavt bu tüm genleri incelemek için kullanılabilir.
Prosedürün başarısı DSR enjeksiyonu ve en az zarar sahip dayanır. Bu uygulama alır, bu yüzden doğru almak için birkaç deneme sürer eğer cesareti olmayın. Mikro enjeksiyon için erken evre embriyolar hazırlamak için, ilk küçük bir Petri kabına% 20 agarose kaynatma dökün ve katılaşmadan önce sıvı agarose yüzeyine üç bir ila iki milimetre genişliğinde plastik tüpler yerleştirin.
Agarose katılaşmış sonra tüpleri kaldırmak ve otoklav distile su 500 mikrolitre ile ortaya çıkan girintileri kapsayacak künt forceps bir çift kullanın. Toplama konteyner hazır olduğunda bir stereo mikroskop altında otoklav distile su ile dolu bir cam kavite çanak içine böcek yuvalama sitelerinden beş sekiz saatlik T.marmoratus embriyo aktarmak için ince bir doğal saç boya sıtkı kullanın. Mikroskop ve ince diseksiyon forsepsi kullanarak her iki taraftan her embriyo chorion kavramak ve embriyo doku yavaşça dışarı slayt sağlayan chorion açık rip.
Toplanan tüm embriyolar her iki chorion katmanları çıkardıktan sonra dikkatle hazırlanan agarose plaka oluklar içine cam kavite çanak embriyolar aktarmak için paintbrush kullanın. Gen özel çift telli RNA ile erken evre embriyolar enjekte etmek için ilk bir iğne puler mikroenjeksiyon iğneleri hazırlamak ve stereo mikroskop kullanın ve keskin bir kenarher ucu kırmak için çiller bulmak. Saflaştırılmış stok çift iplikli RNA buz attıktan sonra, elde edilen çözeltiye 10X enjeksiyon tampon bir mikrolitre ekleyin ve 10 mikrolitre çözeltivinil hacmi getirmek için çift distile su kullanın.
Hazırlanan mikroenjeksiyon iğnelerinden birini çift iplikli RNA çözeltisi ile doldurmak için P10 pipetini kullanın ve iğneyi basınç ejeksiyon teknolojisini kullanan bir mikroenjeksiyon sistemine bağlı bir mikroiğne tutucuya yükleyin. Mikroenjeksiyon sistemini ve basınçlı hava beslemesini açın ve enjeksiyon basıncını inç kare başına 15 pound'a ayarlamak için mikroenjeksiyon sistemindeki mikro valf kullanın ve enjeksiyon süresini saniyelere ayarlamak için zaman ayar ını kullanın. Enjeksiyon iğnesi kalibre etmek için T.marmoratus embriyo su yüzüne enjekte ederken iğne ucunda oluşan sıvı kabarcık hacmini değerlendirmek için 100 ila 200 mikron optimal kabarcık boyutu kullanın.
Optimum kabarcıklar yaklaşık üç saniye lik bir enjeksiyon süresi ile inç kare başına basınç 15 kilo elde edilebilir eğer enjeksiyon iğneiyi iyi kalitede. İğne kurulur hazır olduğunda, iğne embriyoların agarose plakasına, iğnenin embriyolara 45-60 derecelik bir açıyla yaklaşması için hizalayın. Mikro iğneyi yavaşça hareket ettirecek şekilde kullanın, parmak ucu bir embriyonun orta yüzeyine değinceye kadar sonra iğneyi embriyonun yüzeyini delip geçinceye kadar dikkatlice ileri doğru hareket ettirin.
İğne embriyonun içine girdikten sonra mikro enjektör enjeksiyon düğmesine dikkatlice basarak embriyoya çift iplikli RNA'nın bir ila iki nanolitresini teslim edin. RNA'nın tamamı teslim edildiğinde, embriyonun yırtılmasına neden olmadan iğneyi embriyodan yavaşça geri çekin. Başarıyla enjekte embriyolar enjeksiyon yerinde renkli bir nokta varlığı ile tespit edilebilir.
Tüm embriyolar dikkatlice enjekte edildiğinde, 4-5 gün boyunca 14 saat ışık 10 saat karanlık döngüsüne ayarlanmış 25 santigrat derecelik bir kuluçka makinesinde bir nem odasına çanak yerleştirin. Morfolojik olarak görünür nakavt fenotipleri tanımlamak için stereo mikroskop altında embriyo gelişiminin ilerlemesini her gün izleyin. Geliştirme işlemini belgelemek için yüksek çözünürlüklü dijital kamera kullanma.
Herhangi bir ölü embriyo ları çıkarın ve kuluçka döneminde diğer embriyolara mikrobiyal kontaminasyonun yayılmasını ve kurumasını ve yayılmasını önlemek için her gün agarose plaka üzerindeki suyu yenileyin. Larva toplamadan önce ilk küçük bir Petri kabına 60 ila 70 santigrat derece% 2 sıvı agarose ekleyin. Agarose katılaşmış zaman larva başına bir sığ grup yapmak için künt çiller kullanmak agarose içine enjekte edilecek ve yavaşça larva kültür bardak su drenaj.
Anesteziden sonra larvayı, oluklarda boyun ve gövdelerle immobilizasyon plakasına dikkatlice yerleştirmek için yumuşak uçlu büşreler kullanılır, ancak kuyruk agarose yüzeyinin üzerinde yer alır. Tüm larva larva yerleştirildiğinde, her lavı hala sıvı ama tehlikeli derecede sıcak olmayan kalın bir agarose tabakası ile kaplayın ve kazara gerektiği gibi kaplanmış masalları serbest yapın. çift iplikli RNA mikroenjeksiyon yükü için gen özel çift telli RNA çalışma çözümü ile bir mikroiğne gösterildiği gibi.
Elle kontrol edilen bir mikroenjeksiyon şırıngasının pistini yeniden sürükleyin ve iğneyi mikroenjeksiyon sistemine yükleyin. Immobilize larvayı stereo mikroskobun altına yerleştirin, enjeksiyon bölgesi mikroenjeksiyon iğnesinin yörüngesiyle nispeten düz bir açıyla hizalanır. İğne ucunu larvaya dikkatlice taşımak için mikro manipülatörü kullanın ve gerektiğinde iğnedeki renkli enjeksiyon sıvısının hareketine göre enjeksiyon basıncını ayarlayarak şırıngaya yavaşça ve dikkatlice basınç uygulayın.
RNA'nın tamamı enjekte edildiğinde larvayı agarose'dan kurtarmak için yumuşak çiller kullanın ve larvayı 25 ila 28 santigrat derece ve 14 saat açık 10 saatlik karanlık bir döngüde oda sıcaklığında yeni bir su kabına yerleştirin. Bu temsili analizde üç farklı gen, güneş patlaması dalış böceği T.marmoratus'un farklı gelişim evrelerinde yıkıldı. RNA paraziti, embriyogenezin çok erken bir evresinde çift iplikli RNA enjekte edilerek gösterildiği gibi gerçekleştirilir.
Bazı embriyolar bu süreçten sağ çıkamaz ve nekrotik bir hal alamayın. Bu görüntülerde kontrol bireysel ve biraz daha açık göz rengi ile bir birey görülebilir. Bu bireyde, kümenin daha ventral yalanları tamamen pigmentsiz ama hala bazı pigmentasyon görülebilir yapmak daha şiddetli bir nakavt.
Burada tüm gözlerde aslında tam pigment kaybı olan başka bir bireyin bir örnek gösterilir. Lak2 larva sonuçları daha az pigmentli mite sonuçları devirdi, doku alışılmadık yumuşaklık nedeniyle muhtemelen biraz deforme kanatları ile hafif yetişkin bireyler de elde edildi. Yakından günlük olarak enjekte edilen hayvanları gözlemlemek ve hemen herhangi bir ölü bireyleri kaldırmak için hevesle bakmak için emin olun.
Bu tekniğin gücü birçok farklı organizmanın genlerine uygulanabilir olmasıdır. Bu teknik aynı zamanda evrimsel gelişim biyolojisine de yaygın ve başarılı bir şekilde uygulanmıştır.
