Yazarlar Nicotiana benthamiana fidan cömert bağış için Massachusetts Genel Hastanesi Jen Sheen teşekkür etmek istiyorum. Jen Bush bitkilerin büyüyen ve büyüme odası alanı kurma tavsiyesi bize büyük ölçüde yardımcı oldu. Wyss Enstitüsü&#39;nden Tom Ferrante konfokal mikroskobu ile çok önemli yardım teklif etti. Yazarlar, özellikle Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Don Ingber ve Gen Tabancası ve ilgili malzemeleri cömert bağış için Wyss Enstitüsü&#39;ne teşekkür etmek istiyorum. Bu proje için finansman PAS, JCW, ve MDM Enerji İleri Araştırma Projeleri Ajansı Başkanlığı (ARPA-E Ödül # DE-000079) ile bir işbirliği anlaşması ile sağlanan ve Chimerion Biyoteknoloji, Inc aracılığıyla MJV için yapıldı.

Hedefleme Çoklu organel için alternatif olarak eklenmiş diziler-1. Design <ol><li> Nihai protein ifadesi için siteler belirler. Bu iş için, faiz kloroplast, peroksisom ve sitosola hedefleme olduğunu. </li><li> Ilgi organellere proteinleri hedef bilinen protein ve DNA dizilerini tanımlamak için literatür kullanın. Bu durumda, bir kloroplast Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferaz 6,15 ikinci hedef sekansı ve Arabidopsis thaliana transtiretin gibi S-allantoin sentez 16,17 ikinci hedef sekansı, bir peroksizom belirlenmiştir. </li><li> Doğru organellere ilgi proteinleri hedef gereken bir alternatiftir-dilindiğinde rejimini belirlemek. Doğal Arabidopsis sistemde 6 gözlendiği gibi, bu iş için, siteleri splice. MRNA sekansı, doğal bırakarak yeniden birleştirme bölgelerini, ama diziler kodlayan bir kloroplast ya da peroksizomlarda yerleştirildialternatif dilinmemiş intronlarda içinde etiketler (Şekil 1) ome-hedefleme. </li></ol> DNA Parçaların 2.. Gibson Meclisi Şekil 2 &#39;de bakınız. Gibson montaj yöntemi: 1) için bir ön-karışım yapılmıştır çeşitli enzimlerin harekete bağlıdır, kısmen tek kollu DNA parçaları ve komşu 2) tavlama ücretsiz baz çifti olmak üzere iki iplikçikli DNA&#39;nın uçlarını sindirimi. Bu kısıtlama sitelerinin sınırlamalar olmadan DNA fragmanlarının klonlanması için izin verir. <ol><li> DNA plazmid yapısı içinde elemanları için bir düzeni seçin. A) bir plasmid bitkiler, bir kanamisin direnç işaretleyici çalışmak için bilinen bir GFP yapısını içeren bir vektör (gözenek, ve E. coli ve Agrobacterium tumefaciens ana), b) a için bir replikasyon kökeni: Bir örnek olarak TriTag-1 elemanları vardır promoter dizisi, (P ENTCUP2, bitkilerde yapıcı olduğu gösterilmiştir), C) sekansı (CTS) ve bir kloroplast hedefleyen, c) a peroxisome), daha önce tarif edildiği gibi, 6, ek yeri siteleri, bir dizi dizisi (PTS) ve d hedefleme. </li><li> Yapı tabanı-için-baz ile siliko tasarım yazılımı tasarlayın. APE, bu iş için kullanışlı bir açık kaynak kodlu ücretsiz paketidir. Not: TriTag-1, sırası var plazmid vektörü, promoter, ATG, bağlayıcı verici alan, kloroplast hedef sekans, bağlayıcı verici alan, nötr yer, bağlayıcı alıcı alan, peroksizom hedef sekans, bağlayıcı alıcı alan, GFP plazmid vektörü içinde ihtiva gibi . <ol><li> PCR için primerler sipariş ederken her bir birim arasında bir 50 bp üst üste binme olduğu şekilde, in silico DNA yapısı tasarımı. 25 bp her bir yönü: Bu primerler olarak 50 bp üst üste kullanmak mümkündür. <ol><li> Dizisi parçaların her birinin kökeni takip emin olun. Bu gibidir: yetiştirilen ve miniprep için bir plazmid; , bir PCR şablonu olarak kullanılabilen bir doğrusal dizi; ya da olması gereken bir diziTicari olarak sentezlenmiş? Bazı şirketler fragmanları &lt;500 bp için düşük maliyetli DNA sentezi hizmetleri sunuyoruz. Ticari olarak sipariş için avantajlı oldu bu nedenle bu durumda, TriTag kendisi 437 bp. </li><li> Tüm PCR büyütülmüş parçalar ve model DNA saflaştırılan ise en iyi sonuçlar gelecektir. Direnç marker daha kolay PCR büyütülmüş iki küçük şablonlar içine bu büyük DNA bölmek için iyi bir noktadır. </li><li> Kısıtlama Kısıtlama enzim DPNI metilatlı DNA&#39;yı keser. PCR şablonu E bir miniprep olsaydı coli, DPNI tedavi kirlenmesine şablon DNA kaldıracaktır. </li></ol></li></ol></li><li> Ayrı ayrı tüm DNA dizileri arındırın ve su ya da TE Tamponu EB elute. <ol><li> Gözenek vektör part 1, ~ 3.000 bp (yeşil oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi. </li><li> Gözenek vektör part 2, ~ 3,000 bp (siyah oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi. </li><li> TriTag insert, 437 bp (mavi oklar). Ticari emretti. Resuspend GKD 2 O. içinde </li><li> P ENTCUP organizatörü ~ 750 bp (turuncu oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi. </li></ol></li><li> DNA parçalarının her biri konsantrasyonlarını ölçün. Vektör adet 150 ng / ul hedefliyoruz. </li><li> Dondurucu üzerinden Gibson montaj karışımı bir kısım alın ve buz üzerinde eritin. Bu laboratuarda 12-14 yapmak için ticari olarak mevcut, ama aynı zamanda basit. <ol><li> Viskoz 5x master miks ve 15 ul reaksiyon boyutu 1.33x tümbölenleri: Bu tarifi için iki adım vardır. 5x ana karışım içerir: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5, 300 ul 1 M MgCI2, her dNTP, 600 ul 10 mM, 300 ul 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD ve GKD 2 6 ml O. 320 ul hacimde (18) hazırlayın ve -20 ° C&#39;de biri ancak tüm dondurmak Çözelti, oldukça viskoz olacaktır. Bu &quot;5X izoterm tampon&quot; Label </li><li> (320 ul) kalan bir için, 1.2 ul T5 ekzonükleaz, 20 ul Phusion High-FID eklemekelity DNA Polimeraz, 160 ul Taq DNA Ligaz ve 700 ul GKD 2 O. 15 ul hacimde (~ 80) -20 ° C&#39;de PCR tüpleri ve mağaza buz üzerinde ° hazırlayın C. </li></ol></li><li> Parçalarının her biri için eşit molar miktarlarda hacimleri belirler. Gibthon.org dahil olmak üzere birkaç online hesap makineleri vardır. Bütün DNA parçalarının 5 ul toplam olmalıdır. Gibson alikonun mix 15 ul ekleyebilirsiniz. Bu pipet için çok küçük hacimli gerektiriyorsa, DNA fragmanları seyreltmek ve / veya birden fazla kısım kullanın. <ol><li> Yalnız vektör DNA&#39;nın bir denetim hazırlamak (antibiyotik direnç işaretleyici içeren, örneğin DNA parçası) ve su ile hacmini telafi etmek için unutmayın. </li></ol></li><li> 30-60 dakika, 50-55 ° C&#39;de bir termal döngüleyici içinde inkübe. Buz üzerinde değiştirin ve E. dönüşümü ısı-şok kimyasal yetkin hücreler yoluyla coli. Elektrokompenant hücreleri kullanmayın. Yüksek tuz konsantrasyonu, ve nispeten düşük DNA konsantrasyonuhücreler ark neden olabilir. <ol><li> 200 ul kalsiyum-klorür, ticari hazırlanması, yeterli E. için her 20 ul uygulayın coli. 42 ° C&#39;de 30 dakika buz ve ısı şok 60 saniye inkübe </li><li> , Buz 2 dakika geri dön 750 ul SOC veya LB ortamı uygulanır ve 37 ° C sıcaklıkta bir mikro santrifüj tüpü içinde 30 dakika geri çalkalama LB + Kan (veya uygun başka bir antibiyotik) ile ilgili en karışımı ve uygun dilüsyonları Plate. Bu geleneksel ligasyon esaslı klonlama daha yüksek bir arka plan (ve hedef olmayan rekombinasyon olayları daha yüksek bir sayı) neden olabilir ama yaklaşık 10 koloniler taranması için faydalıdır. </li></ol></li><li> Sırası ile klon olduktan sonra, -80 ° C&#39;de bir kısım depolamak </li></ol> Gen tabancası ile Tütün 3. Biolistik Transfeksiyonu Bu vallahi 18,19 kurulmuş olan bir tekniktir. Anahtar adımlar ve farklar aşağıda tarif edilmiştir. <ol><li> 50-100 ml E. büyütün coli ya da 200 ml Agrobacterium. Maxi-hazırlık kültürü. Yaklaşık 1500 ng / ul &#39;lik bir konsantrasyon devam etmek için gereklidir. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi, gen tabancası mermi hazırlayın. Gen Tabancası içine yükleyin. </li><li> Nicotiana benthamiana tütün yaprak epidermal doku transfeksiyonu için, 3 aylık bir bitkinin tabanına yakın büyük bir yaprak seçin. Özenle kesilmiş ve 15 cm Petri kabındaki ıslak kağıt havlu üzerine alt tarafı yukarıya yerleştirin. </li><li> 200-250 psi Gene Gun O basıncını ayarlar. </li><li> Dikkatle yaklaşık 3-5 cm yukarıda, bir yaprağın alt tarafındaki kaburgaların arasındaki Gen Tabancası hedefliyoruz. Güvenlik bırakın ve yaprak parçacıkları sağlar. Her mermi, yaprak üzerinde aynı yerde iki kez kullanılabilir. Yaprak patlar, atmak ve başlangıç, yeni bir yaprak-orada yaprak tokluk bazı farklılıklar nedeniyle böyle bir 12-cm yaprak için, yaklaşık 6 çekim sığdırmak için beklemek vs yaş, nem gibi büyüme koşullarına etmektir. </li><li> Bir üst kaplı yaprak, saklayınBankta düşük ışıkta 2-3 gün boyunca petri. </li><li> UV floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskop yaprak inceleyin ve GFP&#39;yi tek tek hücreler için arayın. Yaprağın 5-10 mm bölümleri ayır. </li><li> ~ 200 ul% 0.1 Triton X-100 altında bir derin kuyu mikroskop slayt yaprak daldırın. Deterjan yüzeyinde oluşan hava kabarcıklarını önlemeye yardımcı olur ve derin kuyu mikroskop slayt daha büyük bir doku görüntüleme alanı sağlar. </li></ol> Geçiştirilmiş Doku 4. Konfokal Mikroskopi Bu talimatlar her enstrüman için değişir, bu yüzden düzgün eğitim almak esastır. <ol><li> Floresans saptama deneyleri için, 489 nm uyarım lazer ayarlamak ve GFP floresans ve klorofil oto-floresan için 630-700 nm için 500-569 nm photomultiplier dedektörleri ayarlayın. 40x su daldırma objektif kullanarak Görüntü hücreler. </li></ol>

<ol>
	<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait+stacking+in+transgenic+crops:+challenges+and+opportunities.">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li><li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+plant+splicing+code:+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements.">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li><li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon.">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li><li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age.">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li><li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5'-+and+3'-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments.">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li><li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana.">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li><li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement.">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts.">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li><li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes.">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li><li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5'+mRNA+tags.">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle:+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes.">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li><li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides,+metabolic+pathways,+and+defense+mechanisms.">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışmada, basit yöntemler bitkilerde çok sayıda hücresel bölümlerin, tek bir transgenik proteini lokalize için tarif edilmiştir. Amaç, Nicotiana benthamiana birden fazla organelde tek bir gen ifade edecek bir yapı tasarlamaktı. Rasyonel stratejiler GFP bazlı DNA konstruktlarının tasarımı, Gibson montaj, Gene Gun yaprak hücrelere plasmidlerin teslimat ve konfokal mikroskobu ile sonuçların gözlenmesi bulunur. Üç farklı kısa, N-terminal etiketler 11<...

Bu çalışma, bitki hücrelerinin çok organellerde bir raportör proteini ifade etmek için, ancak yalnızca tek bir DNA yapısı ile, burada bir metabolik mühendislik / sentetik biyoloji projedir. Birden fazla konuma proteinleri hedef için bir yaklaşım, çok sayıda klonlama genetik kopya, farklı bir lokalizasyon peptit içeren her içerir. Her kopya tek dönüşümleri 1 çaprazlanması ile, alternatif olarak ardışık yeniden dönüştürülmesinin tarafından tanıtılan, ya da olmalıdır. Bu ek klonlama içerir ve terminaline başına bir lokalizasyon etiketi ile sınırlıdır. Birden fazla yere lokalize protein için başka bir alternatif birleştirme 2-5 geçer. RNA, tek bir genden transkribe edilen, ancak transkriptinin farklı numaralar hücre başına birden fazla şekilde genellikle, farklı işlenir. Bu, tek bir genden transkribe hücreye birden fazla haberci RNA neden olabilir. Bu farklı Messenger RNA, aynı proteinin farklı izoformları için kodlayan, ya da bir çerçeve kayması, tamamen farklı bir protein halinde olabilir. Alternatif yapıştırma yıllardır literatürde tarif edilmiş olmasına rağmen, etki ve korunmuş verici ve alıcı ekleme sitelerinin mekanizmaları sadece daha yakın 6 açıklanacaktır edilmektedir. Bu siteleri daha iyi tarif ediliyor, onlar mühendislik için fırsatlar açmak. Birden organellerde bir proteini ifade ederken bitki metabolik mühendisleri bir meydan okuma ile karşı karşıyayız. Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis ilgi organele yönlendirerek, ayrı bir sinyal sekansı ile aynı gen, her birden çok kez klonlanması gerekir. Üç organellerde tek bir gen için, bu sadece üç genlerdir. Ancak altı gen metabolik yolu için, bu 18 gen, önemli bir çaba klonlama için genişler. Tek alternatif dilinmemiş gen işareti içine birden yerelleştirme dizileri birleştirerekificantly bu çaba azaltır. Örneğin, yeniden mühendislik fotorespirasyon 7,8 ve izoprenoid sentez 9,10 kloroplast ve peroksizomları hem de içerir. Doğal Arabidopsis thaliana sisteminde görüldüğü gibi bizim durumumuzda biz daha önce 6 tarif ekleme sitelerin yararlandı. Bu rasyonel tek başına doğal ek yeri siteleri ayrılan mRNA sekansı yeniden, ancak alternatif olarak eklenmiş-intron (Şekil 1) içinde ya da kloroplast-hedefleme peroksizom etiketler kodlayan dizileri yerleştirilmiş olur. Ifade edilen protein ya da kodlanan pre-mRNA, bir intron (Şekil 1G ve 1 H) olarak eksize edildi bağlı olarak, bir etiket olabilir veya olmayabilir. Bu çalışmada sunulan yapıların tasarımı hakkında daha fazla bilgi için, arkadaşı makale 11 bakın lütfen. Bu hala önemli bir klonlama çaba, Gibson montaj, DNA yapıları klonlama için yeni bir yöntem olduğundan, uinşaat sed. Gibson yöntem ne olursa olsun, kısıtlama siteleri (Şekil 2), 12-14 arasında, herhangi bir sıra için kullanılabilmektedir. Enzimlerin spesifik karışımı, tek aşamalı, izotermal montaj sağlar. Bu yöntemde, çok sayıda çift kollu lineer DNA parçaları, 50 bp ~ örtüşen dizilerine sahip olacak şekilde tasarlanmıştır. Gibson düzeneği enzim karışımı kısmen homolog dizilerin tek kollu maruz bırakılması, lineer DNA parçaları sindirir. Bu kısmi tek sarmallı diziler, hızlı, tek aşamalı, dizi-bağımsız, ligasyon içermeyen alt klonlama reaksiyonu ile sonuçlanan reaksiyon karışımı içinde yeniden tavlanır. Bu çalışma bitki kloroplast, peroksisomlara ve sitosollerde ifade için 1) rasyonel tasarım, alternatif olarak eklenmiş yapıları açıklar, 2) kendi klonlama Gibson meclisin yeni ligasyonu-free yöntemi kullanılarak, 3) Gen Tabancası ile tütün yaprak hücrelerinin içine teslimat ve GFP ile gözlemlendiği üzere, organel hedefleme arası 4) Sonuçve konfokal mikroskopi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

Birden fazla alt-hücresel organellere tek bir hedef protein için, bitkiler tipik olarak, ilgili genleri çoğaltmak ve diferansiyel promoterler ve / veya sinyal sekansları da dahil olmak üzere karmaşık bir düzenleyici stratejiler kullanılarak ayrı ayrı her bir geni ifade eder. Metabolik mühendisleri ve belirli bir organele hedef enzimlerin ilgilenen sentetik biyologlar bir meydan okuma ile karşı karşıyayız: Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis aynı gen birden çok kez klonlamak gerekir. Bu çalışma bu strateji için bir çözüm sunar: mRNA alternatif kırpılmayı sokmak. Bu teknoloji kurulmuş ve peroksizom kloroplast hedefleme dizilerinin yararlanır ve alternatif olarak eklenmiş bir tek mRNA halinde birleştirir. Bazı ek yeri varyantları sitoplazmada peroksisom bazı ve bazı, kloroplast gönderilir. Burada sistem çoklu-organel alternatif eklenmeye hedefleme için tasarlanmıştır. Bu çalışmada, GFP ifade olması bekleniyordurasyonel şekilde tasarlanan 5 &#39;mRNA etiketleri bir dizi kloroplast, sitosol ve peroksisom olarak işlenene. Bu etiketler, heterolog genler, birden çok alt-hücresel organellerde ifade edilmesi gerektiğinde gerekli klonlama miktarını azaltma potansiyeline sahiptir. Bu yapılar önceki çalışmada 11 olarak tasarlanmıştır ve Gibson montaj, kısıtlama enzimleri gerektirmeyen bir ligasyon bağımsız klonlama yöntemiyle klonlanmıştır. Elde edilen plazmidler, bir modifiye protokol ile Gen Tabancası Nicotiana benthamiana yaprak epidermal hücrelere dahil edilmiştir. Son olarak, transforme edilmiş yapraklar konfokal mikroskopi ile gözlemlenmiştir.

Tasarım çaba önemli bir planlama sonucudur. Bu proje için yeni diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin çevrilmiş bir ön-mRNA&#39;nın alternatif uç uca eklenmesi oluşturmak için kullanılmasıdır. Bu proteinler, bu durumda, farklı organeller olarak ifade edilmiştir kloroplast, peroksizom ve / veya Sitosol. Bu alternatif olarak 6 eklenmiş doğal Arabidopsis geni uyarlanmış ve (TriTag-1 ve TriTag-2) alternatif olarak ekson dizileri hedef kloroplast 6 ve peroksizom ...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun at JoVE.com

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

20.4K Görüntüleme.  Harvard University.  Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder. 

Video: Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Çevre

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Bio-tabanlı Sanayi Feedstock olarak Tütün Ağacı ve Kavak Değerlendirme transkript ve metabolit profil

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne illness. Ready-to-eat (RTE) processed foods such as deli meats, cheese, and in some cases fresh produce, have been involved in foodborne disease outbreaks due to contamination with pathogens such as Listeria monocytogenes. With respect to L. monocytogenes, deli slicers are often the main source of cross contamination. The goal of this study was to use a fluorescent compound to simulate bacterial contamination and track this contamination in a retail setting. A mock deli kitchen was designed to simulate the retail environment. Deli meat was inoculated with the fluorescent compound and volunteers were recruited to complete a set of tasks similar to those expected of a food retail employee. The volunteers were instructed to slice, package, and store the meat in a deli refrigerator. The potential cross contamination was tracked in the mock retail environment by swabbing specific areas and measuring the optical density of the swabbed area with a spectrophotometer. The results indicated that the refrigerator (i.e. deli case) grip and various areas on the slicer had the highest risk for cross contamination. The results of this study may be used to develop more focused training material for retail employees. In addition, similar methodologies could also be used to track microbial contamination in food production environments (e.g.&#160;small farms), hospitals, nursing homes, cruise ships, and hotels.

The overall goal of this study was to demonstrate the potential cross contamination mechanism of foodborne pathogen Listeria monocytogenes in a retail deli setting. This methodology may be applied to a variety of different environments to track pathogen contamination. &#160;

Floresan Tozu Kullanımı Perakende Ortamlarda Mikrobiyal Bulaşma Takip - Bir Perakende Deniz Çevre Örneği

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

Yerfıstığı aflatoksin RNAi aracılı Kontrol: Yöntem Yerfıstığı Mikotoksin Üretim ve Transgen Anlatım Analiz /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

Deniz bir Model - olarak Barnacle Balanus improvisus kültür ve gen ekspresyonu

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Müstakil yaprak özendirme, Çiğneme böcek Manduca Sexta tarafından Infestation sırasında patates gen Ifade çalışmaları basitleştirmek için

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Saf Yaprak Döken Standlarda Üç Farklı Yöntem Kullanılarak Yaprak Alan İndeksi Tahmini

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...