Burada gösterilen protokol, bitkilerin inositol polifosfatlarının biyosentezinin aydınlatılanın ve bitki metabolizması ve gelişiminin belirli yönlerindeki rolleriyle ilgili soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İnositol fosfatların radyoaktif olarak etiketlenmiş öncülü bitkilerdeki tüm inositol fosfat türlerinin güvenilir şekilde tespit edilmesine olanak sağladığından bu yöntem son derece hassastır. Çoğu bitki biyologları HPLC analizi ve gerekli kurulum aşina olduğu için bu yöntemin görsel gösteri önemlidir.
Buna ek olarak, bu protokolün kritik adımları, inositol fosfat çıkarma gibi, uygun gösteri olmadan takip etmek zordur. İki bağımsız HPLC pompaları oluşan bir sistem kurarak başlayın, tampon A ve tampon B.Her pompalar için bir bilgisayar veya ana pompa ile birlikte kontrol edilmesi gerekir. Her iki pompa için de yerçekimi kuvveti veya üçüncü bir alçak basınç pompası ile pistonlu conta yıkama uygulayın.
Her iki pompayı da dinamik bir miksere bağlayın, ardından mikseri en az bir mililitre kapasiteye sahip bir numune halkası ile bir enjeksiyon valfine bağlayın. Enjeksiyon valfini kolona ve kolonu kesir toplayıcısına bağlamak için kılcal damarlar kullanın. Deiyonize suda %0,8 bakteriyolojik agardan oluşan katı büyüme ortamıyla dolu kare Petri kaplarında bir sıra halinde lotus tohumu ekin.
Tohumların karanlıkta en az üç gün boyunca dört santigrat derecede tabakalamasını bekleyin. Tohumları bir büyüme kuluçka makinesine yerleştirin. 10 ila 20 fideyi% 1 sakaroz ile desteklenen ve pH 5.7 ayarlanmış yarım güçlü MS tuz çözeltisi iki mililitre ile dolu 12-iyi net düz alt hücre kültür plakası bir kuyu içine aktarın.
Plakaya 3H miyo-inositol 45 mikrocurie ekleyin ve yavaşça girdap. Bir kapak ile plaka kapağı ve mikro gözenekli cerrahi bant ile mühür. Sonra büyüme kuluçka içine geri yerleştirin.
Etiketleme beş gün sonra, medyadan fide kaldırmak ve deiyonize su ile kısa bir süre yıkayın. Kağıt havlu ile kurulayın ve tüp overfill değil emin olun, 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine aktarın. Snap tüpü sıvı nitrojenle dondurun ve ekstraksiyona kadar eksi 80 derecede saklayın.
Dondurucudan numuneleri alın ve kullanıma hazır olana kadar sıvı nitrojende saklayın. Onlar erime başlayana kadar bir mikrosantrifüj tüp havaneli ile grind, sonra buz soğuk çıkarma tampon 500 mikrolitre ekleyin. Numune homojenize olana ve çözelti renklendirinceye kadar taşlama devam edin.
18, 000 kez G ve dört derece santigrat derece 10 dakika için örnekleri santrifüj. Sonra taze bir 1.5 mililitrelik tüp içine supernatant aktarın. Ekstraksiyon için kullanılan tüpler katı radyoaktif atık olarak kabul edilir ve buna göre bertaraf edilmesi gerekir.
Dikkatle hemen proteinlerin yağış ve köpüren neden olacak ekstresi, nötralizasyon tampon 300 mikrolitre ekleyin. Bir dakika sonra, pH'ın yedi ile sekiz arasında olduğundan emin olmak için numuneyi bir pipet ucu ve pipet beş mikrolitre pH kağıdına karıştırın. Gerekirse, istenilen pH'a ulaşılına kadar nötralizasyon tamponu veya çıkarma tamponu küçük miktarlarda ekleyin ve numunelerin açık bir kapakla en az bir saat buzun üzerinde dinlenmesine izin verin.
Sonra 10 dakika santrifüj ve taze bir 1,5 mililitrelik tüp içine supernatant aktarın. Fraksiyon kolektörü 96 küçük sintilasyon şişeleri ile donatın ve her şişeyi düşük pH tamponları ve yüksek amonyum fosfat konsantrasyonları ile uyumlu uygun bir sintillation kokteyliki mililitre ile doldurun. HPLC sistemini çalıştırın, ardından pistonlu conta yıkamayı etkinleştirin ve tüm çalışma boyunca aktif tutun.
Numuneye uygun bir şırınga ile elle enjekte edin. Pompaları ve degradeyi çalıştırın. HPLC çalışması devam ederken, basıncı düzenli olarak kontrol edin.
Başlangıç basıncı 18-24 bar civarında olmalı ve %100 tampon B'ye ulaşıldıktan sonra yavaşça 50-60 bar'a yükselmelidir. Koşudan sonra, şişeleri sıkıca kapatın ve karıştırmak için Scintillation kokteyli ile kesirleri şiddetle sallayın. Doğrudan ölçüme devam etmiyorsanız, şişeleri karanlıkta dik bir konumda tutun.
Kesirleri ölçmek için, şişeleri küçük şişelere uyan raflar kullanarak Sintillation sayacı raflarına yerleştirin ve her şişeyi sıvı bir sintillation sayacında beş dakika ölçün. Dakika başına ölçülen sayımların veya CPM'nin bekletme süresine göre çizildiği bir 2B satır grafiği hazırlayın. Örnekleri birbiriyle karşılaştırmak için, her bir örnek için her eluted kesirden 25 ila 96 dakikadan cpm'yi özetleyerek ve toplam CPM'yi bu örnekten diğer örneklerin toplam CPM'sine bölerek verileri normalleştirin.
Belirli inositol polifosfat zirvelerinin göreceli niceliklerini gerçekleştirmek ve daha sonra istatistiksel analizler için çoğaltma verilerini içeren çubuk grafikler oluşturmak için, kromatografilerin en yüksek alanlarını hesaplayabilen özel bir yazılımla analize devam edin. Sintillasyon sayımı ndan sonra A.thaliana özlerinden elde edilen tam bir inositol polifosfat spektrumu burada gösterilmiştir. Zirveleri güzel ayrılmış ve farklı izomerleri atanabilir.
Yaşlı bir kolon kullanıldığında, inositol hekakisfosfat ın net bir azalması ve inositol pirofosfat yokluğu görülebilir. Arabidopsis fideleri ile aynı koşullarda yetiştirilen ve etiketlenen L.japonica fidelerinde de SAX-HPLC analizi yapıldı. Arabidopsis'ten bilinen tüm inositol polifosfat türleri ve zirveleri görülebilse de, iki tür arasında spesifik inositol polifosfat izomerlerinin göreceli miktarlarında farklılıklar vardır.
Örneklerin ekstraksiyondan hemen sonra analiz edilmesi gerekmediğini göstermek için, bir numune nin bir kısmı eksi 80 santigrat derecede depolandıktan sonraki gün iki ve yarısına bölündü. Taze ve dondurulmuş numunelerin SAX-HPLC profilleri arasındaki farklar önemli değildi, bu da bir donma-çözülme döngüsünün numuneye zarar vermediğini ve yöntemin kendisinin tekrarlanabilir sonuçlar ürettiğini gösterdi. Bu protokolü denerken, her zaman iyice, dondurulmuş ve ekstraksiyon tampon ile örnekleri eziyet ve SAX-HPLC analizi için radyo etiketli inositol fosfat maksimum kurtarma sağlamak için nötralizasyon sonrası nötr pH yakın hedefliyoruz.
Daha sonra kullanılmak üzere bir SAX-HPLC çalıştırmak radyo etiketli arındırmak mümkündür, örneğin scintillation kokteyller olmadan kesirler toplayarak ve sadece küçük aliquots ölçerek karşılıklı reaksiyonlar.
