Yöntemimiz bir protein kompleksi oluşumunun kinetik çalışmasına yardımcı olur. Bir protein kompleksinin ne kadar sıkı olduğunu ve protein kompleksinin diğer proteinler tarafından müdahale edilip edilebiş olmadığını açıklar. Bu teknik, bir muhabir olarak floresan kullanarak nicel bir şekilde protein-protein etkileşimi incelenmesini sağlar, bizim tsözde gerçek zamanlı olarak bir protein kompleksinin ilişki ve ayrışma izleyebilirsiniz.
Başlamak için, protein veritabanından COL1 CAND1 kompleksi için veri ile başlayan FRET titresini tasarlayın. PyMOL'daki yapıyı yükleyin ve ardından sihirbaz menüsüne gidin ve CAND1'in ilk amino asidi ile COL1'in son amino asidi arasındaki mesafeyi tahmin etmek için ölçüm işlevini kullanın. Daha sonra, online spektrum görüntüleyici yükleyin ve aynı anda 7-amino-4-methylcoumarin ve FlASH uyarma ve emisyon spektrumları görüntülemek.
AMC FRET donör ve FlASH FRET kabul eden olduğunu. Eşlik eden metin protokolünü takip ederek FRET donör proteini ile hücreleri hazırlayın. Daha sonra, COL1 sortase RBX1 kompleksini ifade eden E.Coli hücrelerinin bir peletine 50 mililitre likis tamponu ekleyerek COL1 sortase RBX1 kompleksini arındırın.
Hücreleri %50 genlikte sonication ile buz. Bir saniye açık olması için gücü üç dakika, numunenin aşırı ısınmasını önlemek için bir saniye kapalı olarak alternatif edin. Ortaya çıkan hücre lisatını 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücre enkazını 45 dakika boyunca 25, 000 kez g santrifüj ile çıkarın.
Sonra, glutatyon boncuk beş mililitre supernatant ekleyin ve hücre lysate temizlemek için dört derece santigrat onları kuluçka. Kuluçkadan sonra boncuk lysatkarışımını 1, 500 kez g'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüj edin. Sonra, supernatant çıkarın.
Daha sonra, hiçbir proteaz inhibitörü olan lysis tampon 5 mililitre ile boncukyı yıkayın. Çözeltiyi santrifüj ettikten sonra supernatant'ı çıkarın. Şimdi, yıkanmış boncuklara üç mililitre lysis tampon ekleyin ve boncuk bulamacını boş bir sütuna aktarın.
Yeni sütuna, ayrıca beş mililitre elüsyon arabelleği ekleyin ve sonra sütunu 10 dakika kuluçkaya yatırın ve eluate'yi toplayın. Sonra, glutatyon boncuk lardan eluate mililitre başına beş miligram trombin 200 mikrolitre ekleyin. Dört santigrat derecede bir gecede kuluçkadan sonra protein örneğini tampon A.Load ile üç kat seyreltin Protein örneğini bir tampona yükleyin Dakikada sıfır noktasında kikonik değişim kromatografisi sütunu dengelenir.
Daha sonra, dakikada 1 mililitre lik bir akış hızı ile proteini eute etmek için tampon A'daki B tamponunun %50'sine sıfır bir degrade ekleyin. Daha sonra, FRET donör proteinini içeren eluat fraksiyonlarını havuza alın ve 30 kilodalton kesme ile ultrafiltrasyon membranı kullanarak iki nokta beş mililitreye kadar yoğunla. Şimdi, 7-amino-4-metilcoumarin ekle 7-amino-4-metilcoumarin col1 c-terminus ile sortaz aracılı transpeptidasyon ilk fret donör protein örnek tampon değiştirerek sortaz tampon içine bir tuzsuzlama sütun kullanarak.
Bunu başarmak için, ilk sortase arabellek 25 mililitre ile bir tuzsuzsütun dengeleyin. Daha sonra, iki nokta beş mililitre FRET donör protein çözeltisi sütuniçine yük ve üzerinden akışı atın. Daha sonra, üç nokta beş mililitre sortase tampon ile örnek elute ve üzerinden akışı toplamak.
Eluat mikrolitre, 600 mikromolar saflaştırılmış sortaz Bir çözelti ve 25 milimolar GGGG-AMC peptid 10 mikrolitre 100 mikrolitre ekleyin. COL1-AMC-RBX1 üretmek için bir gecede karanlıkta 30 santigrat derecede reaksiyon karışımı kuluçka. Şimdi, tüm örneği boyut dışlama kromatografi sütununa yükleyin ve tampon sütun hacminin beş katı bir nokta ile aşındırın.
Sonunda, COL1-AMC-RBX1 içeren eluat fraksiyonları havuzu. FRET acceptor proteinhazırlamak için metin protokolü boyunca izleyin. Adımların çoğu FRET donör protein hazırlama benzer.
Tamamlandıktan sonra FlASH CAND1 çözeltisini hazırlayın. İlk olarak, flash çözeltisinin bir mikrolitresini yeni hazırlanmış tetra-cys-CAND1 çözeltisinin 50 mikrolitresine ekleyin. Kombine çözeltileri iyice karıştırın ve flash CAND1 çözeltisini oluşturmak için 1-2 saat boyunca karışımı karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
FRET tampon 300 mikrolitre, 70 nanomolar son konsantrasyonuna COL1-AMC-RBX1 ekleyin ve bir cuvette içine çözüm aktarın. Bir fluoriometer örnek tutucu cuvette yerleştirin. Numuneyi 350 nanometre uyarma ışığıyla heyecanlandırın ve emisyon sinyallerini bir nanometre artışanında 400 ila 600 nanometre arasında tarayın.
Daha sonra, FRET tampon 300 mikrolitre, 70 nanomolar son konsantrasyona hem COL1-AMC-RBX1 ve FlASH-CAND1 ekleyin. Numuneyi 350 nanometre uyarma ışığıyla heyecanlandırın ve 400-600 nanometreden gelen emisyon sinyallerini bir nanometre lik artışlarla tarayın. Uyarma ışığını 350 nanometreye ayarlayın ve 450 nanometre emisyon ışığının geçmesini sağlayan ve 500 ila 650 nanometre emisyon ışığını engelleyen bant geçiş filtresi kullanın.
Dolgu konumundaki numune vanaları ile su dolu üç mililitrelik bir şırınga bağlayın. Daha sonra, numune şırınga sürücü yukarı ve aşağı birkaç kez hareket ettirerek su ile iki örnek şırınga yıkayın, bittiğinde su atarak. Daha sonra, FRET tamponu ile dolu üç mililitrelik bir şırınga bağlayın.
İki numune şırıngasını, numune şırınga sürücüsünün birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek FRET tamponuyla yıkayın ve bittiğinde suyu atın. Şimdi, üç mililitrelik bir şırınga bağlayın ve fret tamponunda 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 ile ilk örnek şırınga, şırınga A, yükleyin. Daha sonra numune valfini sürücü konumuna çevirin Ayrıca, üç mililitrelik şırınga B'ye bağlayın ve Fret tamponunda 100 nanomolar FlASH CAND1 ile B şırıngasını yükleyin ve valfini sürücü konumuna çevirin.
Yazılımda edinme altındaki kontrol panelini açın ve 60 saniye boyunca COL1-AMC emisyonuna kaydedin. O zaman tek bir atış yap. Her çekimden tek bir üstel eğriye kadar zaman içinde ölçülen azalma ve floresan sinyalleri sığdırın.
Daha önce gösterildiği gibi sistemi yıkayın ve daha sonra 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 ve 100 nanomolar FlASH CAND1 fret tampon içine şırınga A.Connect içine bir çözüm ekleyin.O dolgu konumunda iken sisteme yükleyin Yük şırınga A ve daha sonra sürücü konumuna örnek valfin açın. Daha sonra, Skp1-Skp2 çözeltisini şırınga B.Connect'e yükleyin. Şırınga B'yi yükleyin ve numuneyi sürücü konumuna getirin.
Yazılımda, kontrol panelini satın almak ve açmak için gidin. COL1-AMC emisyonuna 30 saniyeden fazla kayıt olacak şekilde programı ayarlayın. O zaman tek bir atış yap.
Floresan sinyalleri, frırşağı A ve şırınga B.Neşret b.Ne zaman 70 nanomolar HER COL1-AMC ve FlASH CAND1 FRET oluşturmak için karışık, iki emisyon zirveleri emisyon spektrumları mevcut olan karıştırma sonra zaman içinde artar. COL1-AMC'nin zirvesi daha da azaldı ve FlASH CAND1'in zirvesi daha da arttı. FRET için tam uzunlukta CAND1 kullanıldığında donör pik yoğunluğunda %10 azalma gösterdi.
Ancak, ilk sarkaç kesilmiş CAND1 kullanıldığında donör pik yoğunluğunun azaltılması %30'a yükseltildi ve sinyal değişikliklerinin COL1-AMC ve FlASH CAND1 arasındaki FRET'den kaynaklandığını doğrulamak için daha yüksek FRET verimliliği ne kadar artırıldı, donör FRET, kabul eden de Chase olarak bilinen aşırı etiketsiz CAND1 ile karıştırıldı. Sonuç olarak donör tepesi tamamen onarıldı ve kabul eden tepe noktası azaltıldı. Burada gösterilen doğrusal regresyon analizi aşağıdaki CAND1 konsantrasyonu ile ortalama gözlenen K değerinin bir arsa.
Kompleksin üzerindeki sabiti ölçmek için, 50 nanomolar COL1-AMC gözlenen dissoslaşma hızı sabitleri bir dizi flash CAND1 artan konsantrasyonları ile 50 nanomolar COL1-AMC karıştırılarak ölçüldü kullanılmıştır. On sabitinin ölçümüne benzer şekilde, COL1 ve CAND1'in gözlenen kopma sabiti, donör sinyalinin zaman içinde durmuş akış florometresi üzerinde izlenmesi yle bulundu. Burada donör sinyali hızla arttı ve saniyede sıfır noktası dört gözlenen K değerini ortaya koydu.
Buna karşılık, tampon önceden monte edilen komplekse eklendiğinde, COL1 CAND1'in hızlı bir şekilde dağılmasının Skp1 Skp2 tarafından tetiklendiğini düşündüren bir sinyal artışı gözlenmedi. Florofororları mümkün olduğunca karanlıkta tutmaya çalışın.
