Lignin, üç monolignoldan oluşan karmaşık bir heteropolimerdir. Selülozun yanında yeryüzündeki en bol ikinci polimerdir. Burada lignin içeriğinin tahmin edilmesi için en güvenilir yöntem olan tiyoglikolik asit yöntemini gösteriyoruz.
Bu yöntem, lignin tiyoether bağları yoluyla tiyoglikolik aside bağlanması prensibine dayanır. Ayrıca, bu protokolü beş aşamaya ayırdık. İlk aşamada bitki malzemesini hazırlıyoruz.
İkinci aşamada, alkol çözünmeyen ekstraktını izole ediyoruz. Üçüncü fazda tiyoglikolik asit ve asidik koşullar kullanarak lignin çökeltiyoruz. Dördüncü aşamada endüstriyel bambu lignin kullanarak lignin standart eğrisini hazırlıyoruz.
Son olarak, beşinci aşamada, dördüncü aşamada hazırlanan standart eğriyi kullanarak lignin içeriğini tahmin ediyoruz. Bitki materyali toplanır, kökleri ayırmak için saksıları çevirir, suda iyice yıkanır, iki gün boyunca hava kurutulur, etiketli kaplara aktarılır ve bir hafta ila 10 gün boyunca 49 derecelik inkübatörde inkübe edilir. Makas kullanılarak, doku daha fazla 1 mm ila 3 mm boyutlarda parçalar halinde kesilir.
Alternatif olarak, bitki dokularını ezmek için biyokütle öğütücü kullanılır. Kök dokusunu kullanın Biyokütle öğütücüsünü açın, ezilmiş tozu önceden etiketlenmiş kaplara toplayın. Benzer şekilde, kök doku ve yaprak dokusu için tekrarlayın.
Ezilmiş toz, daha sonra dondurucu değirmenine yerleştirilen taşlama vazosuna yüklenir ve dondurucu değirmenini üç döngü boyunca 10 CP hızında çalıştırır. Zemin dokusu tozunun 20 mg'ını tartın ve önceden yapılmış bir 2ml tüpe aktarın. Laboratuvar defterinizdeki boş tüpü ve tüpe, doku tozunu ve doku tozunu not edin.
60 derecelik açık tüpleri bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de her örnek girdap santrifüjüne 1,8 ml su ekleyin. Süpernatant 1.8 ml metanol ekleyin atın.
Vortex ve 15.000 RPM'de 10 dakika boyunca inkübasyon santrifüjden sonra 20 dakika boyunca önceden ısıtılmış 60 derecelik bir blokta kuluçkaya yatır. Bu adımı bir kez daha yineleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın ve peletleri vakum kurutucuda iki ila üç saat veya palet tamamen kuruyana kadar kurutun.
Sonunda lignin içeriğinin tahmini için laboratuvar not defterinizdeki her tüpün ağırlığını ölçün ve kaydedin. Ayrıca bu noktada pozitif kontrol endüstriyel bambu lignin üç taraflı 0.5 mg ila 4 mg arasında ekleyin. Her örnek Girdap'a yüz mikrolitre glikolik asit ile birlikte 1 ml 3 normal hidroklorik asit ekleyin ve 3 saat boyunca 80 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
3 saat sonra kuluçka bunları bir rafa aktarın ve 10 dakika soğumasını bekleyin. daha sonra 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, çözeltinin rengi böyle görünür.
Üstnatant atın. 1 ml su ekleyin. Vortex Santrifüj 15,000 RPM'de 10 dakika.
Üstnatant atın. 1 ml 1 normal sodyum hidroksit ekleyin. Girdap ve bir gecede 37 derecelik shaker'da kuluçkaya yaslan.
Bir gecede kuluçkadan sonra tüpleri 15.000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatant taze önceden etiketlenmiş 2 ml tüpleri aktarın, süpernatant içine 200 mikrolitre konsantre hidroklorik asit ekleyin. Burada gösterildiği gibi nazik bir ters çevirme ile karıştırın.
Onları buzdolabında bir gecede 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçka santrifüjünden sonra 15.000 RPM'de 10 dakika boyunca. Üstnatant atın.
1 ml sodyum hidroksit ekleyin. Girdap ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Absorbans okumalarını toplamak için spektrofotometre kullanın 280 nanometre, Lignin çökeltilmiş sodyum hidroksitte çözüldüğünden 2 mikrolitre sodyum hidroksit boş olarak alın.
Boşluğu sıfıra indir. Benzer şekilde, örnekler için tekrarlayın. Laboratuvar not defterinizdeki absorbans okumalarını toplamak için her numuneden iki mikrolitre kullanın.
Üç teknik çoğaltma için her örnek için üç okuma alın. İlk sütunda örnek numarası var. İkinci sütunda, R1, R2, R3'ün bir deneysel çizginin üç biyolojik tekrarını temsil ettiği biyolojik çoğalmalarımız var.
Üçüncü sütunda ise 280 nanometrede elde edilen emiciliğin ortalamasını aldık. Dördüncü sütundaki lignin içeriğini, x'in ortalama OD olduğu, .m ve c değerlerinin hazırlanan standart eğrinin regresyon çizgisinden çizildiği y=mx-c formülünü kullanarak hesapladık. Beşinci kol metanol ve su yıkamadan sonraki ağırlıktır.
Yani mg'da lignin içeriğinin tahmin edilmesi için kullanılan yol budur. Bu nedenle, altıncı sütundaki lignin içeriğinin mg'ı başına değeri elde etmek için dördüncü sütunda elde edilen değeri beşinci sütuna böleriz. Ve bu değer gram hücre başına duvar ağırlığı elde etmek için 1000 ile çarpılır.
Ve yüzde lignin içeriği, bu değerin 1000'e bölünmesi ve 100 ile çarparak hesaplanır. Son olarak, lignin içeriğindeki farklılıkları anlamak için bir çubuk grafik şeklinde başka bir deneysel çizginin ortalaması ile karşılaştırılacak her deneysel hattın üç biyolojik replikinin lignin ortalamasını alarak ortalama lignin elde ediyoruz. Ayrıca, önem düzeylerini test etmek için öğrenci t-testi uygulayabiliriz.
A sütununda, ticari bambu ligninimiz ve daha sonra TGA'dan önce alınan bambu lignin ağırlığı ve 280 nanometrede ilgili absorbans okumaları vardır. A tablosundaki bu değerler, B sütununda dağınık bir grafik çizmek için kullanılmıştır, bu da bize m ve c değerleriyle gerileme çizgisi verir. C'de standart eğri kullanılarak elde edilen değerleri karşılaştırdık ve endüstriyel bambu lignin deneysel çizgisi bir ve iki bar grafiği şeklinde karşılaştırıldı ve sonuç olarak birbirleri arasında fark gösteriyorlar.
