Mikroskopi-Rennes Görüntüleme Merkezi (MRic, BIOSIT, Rennes, Fransa) mühendislerine tavsiye ve yardım için ve özellikle X. Pinson'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. MRic, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-10-INBS-04) tarafından desteklenen Ulusal Altyapı France-BioImaging'in üyesidir. Bu çalışma Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ligue Contre le Cancer Comités d'Ille et Vilaine, des Côtes d'Armor et du Finistère ve Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) tarafından G.B.'ye desteklendi.

NOT: Bu protokolde kullanılan U2OS hücreleri Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC, HTB-96) satın alınmış ve mikoplazmadan arındırılmış olarak test edilmiştir. 2.1 ile 2.7 arası adım, hücreleri ve reaktifleri steril tutmak için laminer akış başlığı altında yapılmalıdır.
1. Donör/alıcı FRET çiftinin seçilmesi
<ol><li>En uygun donör/alıcı FRET çiftlerinin seçimi için literatüre bakın. FRET/FLIM kurulumunun özelliklerine (mevcut lazer hatları, filtreler vb.) göre son seçimin yapılması gerekmesine rağmen, yararlı örnekler 20.21.22.23,24'te bulunabilir. Aşağıda, bir donör/alıcı çiftinin nasıl seçilene ilişkin bazı hususlar yer alır.<ol>
<li>Donörün seçilmesi: mevcut floresan proteinler hakkında tam bir bilgi kümesi için FP tabanına (https://www.fpbase.org/) bakın. Bu veritabanı sürekli olarak tüm yeni geliştirilen floroforlarla güncellenir.</li>
		<li>Literatürde mevcut olan biyosensörler ve kullanılan ilgili floresan proteinler hakkında daha fazla bilgi için Floresan Biyosensör Veritabanı'na (https://biosensordb.ucsd.edu/index.php) bakın.</li>
		<li>Genel bir başlangıç noktası olarak, parlak bir donör florofor seçin. İyi adaylar mTFP1 veya ECFP olarak siyan floresan proteinler veya EGFP veya mEGFP olarak GFP varyantlarıdır.</li>
		<li>Oligomerler protein lokalizasyonunu ve/veya işlevini etkileyebilir25. CFP monomerik mutantlarını mTurquoise226 veya Aquamarine27,28 olarak kullanmayı düşünün. Bu varyantlar ayrıca iyi kuantum verimi ve yok olma katsayılarına sahiptir, bu da onları FRET bağışçıları olarak iyi adaylar haline getirir.</li>
		<li>FRET verimliliği bu parametrelerden yoğun olarak etkilenebileceği için hücre içi pH23 gibi çevresel değişikliklere karşı duyarsız floresan proteinleri (hem donör hem de kabul eden olarak) veya fotobleaching25'i tercih edin29. Günümüzde, mTurquoise2 veya mTFP1 gibi floroforlar, iyi fotoğraflanabilirlikleri sayesinde donör olarak yaygın olarak kullanılmaktadır22,25,26.</li>
	</ol></li>
	<li>Kabul edenin seçilmesi: siyan donörleri genellikle mVenus, Citrine ve YPet20,21,22,30 olarak Sarı Floresan Protein (YFP) varyantları ile eşleştirilir. Bununla birlikte, bu proteinlerin pH'a karşı çok daha fazla hassasiyete sahip olduğu ve küresel olarak zayıf bir fotoğraflanabilirlik gösterdiği belirtilmelidir.<ol>
<li>YFP'nin yeni geliştirilen, pH'a duyarsız sarı varyantlarını pH-Lemon31, yeşil floroforları mNeonGreen23 veya kırmızı floroforları mScarlet-I23,32 olarak mTurquoise2 için daha önce onaylanmış floresan kabul edenler olarak kullanmayı düşünün.</li>
		<li>Alternatif olarak, FRET/FLIM deneylerinde siyan-floresan donörler için iyi bir kabul edici olarak gösterilen ShadowG33 veya ShadowY34 olarak YFP'nin floresan olmayan /karanlık türevlerini kullanmayı düşünün.</li>
		<li>Donör olarak mEGFP kullanıyorsanız, mCherry olarak monomerik kırmızı alıcıları kullanmayı düşünün.</li>
	</ol></li>
	<li>FP temel web sitesinde bulunan araçları kullanarak seçilen donör/alıcı çiftin spektral özelliklerini doğrulayın. mEGFP/mCherry çiftinin bir örneği için Şekil 1'e bakın.<ol>
<li>FP temel web sitesinde Araçlar açılır menüsünü ve Spectra görüntüleyici'yi seçin.</li>
		<li>Açılır menülerde, görselleştirmek için florofor çiftinin adını girin (örneğin, mEGFP ve mCherry).</li>
		<li>Açılır menüde belirli bir lazer seçerek donör/alıcı çiftinin özelliklerini belirli bir ışık kaynağıyla simüle edin. Alternatif olarak, Lazer ekle'yi seçerek belirli bir lazer dalga boylarını girin. Florofor spektrumunu istediğiniz dalga boyunu ayarlamak için emisyonu normalleştir seçeneğine tıklayın. Burada, GFP'yi heyecanlandırmak için kullanılan dalga boyu 480 ± 10 nm'dir.</li>
	</ol></li>
	<li>Seçilen donör/alıcı çifti, AURKA'nın tam uzunluk dizisinin N-terminus'una bir florofor ekleyerek ve bir tane de C-terminus'ta klonlayın. Bu yapıyı tercih edilen bir memeli ifade vektörüne eklemek için tercih edilen klonlama yönteminin yönergelerini izleyin.</li>
</ol>2. Hücre kültürü, transfection ve senkronizasyon
<ol><li>1. GÜN. U2OS hücreleri için kültür ortamı hazırlayın: Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu (FBS), %1 Penisilin-Streptomisin ve %1 L-Glutamin (bundan böyle tam büyüme ortamı) ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta (DMEM) kullanın. Alternatif olarak, önceden takviye edilmiş L-Glutaminli DMEM de kullanılabilir.</li>
	<li>Hücreler donmuşsa, bir şişeyi deneylerden en az 8 gün önce (yani 2,5 noktadan itibaren) çözün.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de memeli hücre kültürlerine adanmış ve %5 CO2'ye sahip bir inkübatörde büyütün. Kirlenmeleri önlemek için inkübatörleri düzenli olarak temizleyin ve sterilize edin.</li>
	<li>Hücreler ~% 80 izdihama ulaştığında:<ol>
<li>Ca2+ ve Mg2+ olmadan steril 1x fosfat tampon salin (PBS) ile kısaca yıkayın.</li>
		<li>Üretici protokolüne göre steril %0,05 Trypsin-EDTA ile hücreleri 1-3 dk inkübatöre yerleştirerek trypsinize hücreleri.</li>
		<li>Tam büyüme medyasının iki katı hacim ekleyerek trypsin inaktive; iyice karıştırın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu 3-5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj.</li>
		<li>Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve ertesi gün oda slaytlarında ~ % 70-80 izdiahta olmaları için uygun seyreltmeyi hesaplayın. Alternatif olarak, canlı hücre görüntüleme için benzer destekler de kullanılabilir.</li>
		<li>Seçilen canlı hücre görüntüleme desteğindeki ilgili hücre hacmini pipetle ve hücreleri ertesi güne kadar inkübatöre geri yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>2. GÜN. Transfection ile devam edin. Optimum transfeksiyon verimliliği (~%50/80) elde etmek için tercih edilen geçici transeksiyon yöntemleri yönergelerini izleyin. Spesifik bir transfeksiyon yöntemine gerek yoktur. Transeksiyon verimliliğinin kullanılan hücre hattına göre değişebileceğini unutmayın. 48 saat kuluçkaya yaslanın. NOT: Geçici transeksiyon ihtiyacını atlamak için üç vektörün her birini içeren kararlı klonlar üretin. Bu aşamada iki tür denetim planlanmalıdır. İlk olarak, tam uzunlukta AURKA varlığının mTurquoise2'nin ömrünü etkilemediğini doğrulamak için "yalnızca donör" kontrolü gereklidir. İkinci olarak, kinaz-ölü mutasyonu taşıyan bir biyosensör, FRET'in kaldırıldığı veya önemli ölçüde düşürüldüğü negatif bir kontrol olarak kullanılmalıdır. Kinaz ölü bir mutant alternatif olarak, ATP analog MLN8237 olarak AURKA aktivasyonunun kimyasal inhibitörü negatif kontrol olarak kullanılabilir.<ol>
<li>Her biri bağımsız bir kuyuda olmak üzere üç transfeksiyon koşulu önceden planlayın: "Sadece donör" vektörü (örneğin, AURKA-mTurquoise2) "Biyosensör" (örneğin, superYFP-AURKA-mTurquoise2) Bir kinaz-ölü/"K162M" biyosensör (örneğin, superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2) veya alternatif olarak, AURKA aktivasyonunun inhibitörü (örneğin, MLN8237)</li>
		<li>Her bağımsız donör/alıcı çiftin karşılaştırması için üç koşul gerçekleştirin.</li>
		<li>Eşitlenmemiş ve G2/M senkronize edilmiş hücreleri karşılaştırıyorsanız transfected kuyuların sayısını iki katına çıkarmayı düşünün (bkz. adım 2.6).</li>
	</ol></li>
	<li>3. GÜN. G2/M'deki hücreleri senkronize edin. DMSO'da çözünmüş 100 ng/mL nokodazol ekleyin ve her transfected kuyuya ışık maruziyetini önleyin ve 16 saat boyunca kuluçkaya yatın (tercihen bir gecede). Eşitlenmemiş ve G2/M senkronize edilmiş hücreleri karşılaştırıyorsanız, her transfeksiyon durumunu nokodazol veya eşit miktarda DMSO ile tedavi edin. Daha iyi bir senkronizasyon verimliliği için, DMSO'da tek kullanımlık nokodazol aliquots hazırlayın, -20 ° C'de saklayın ve kullandıktan sonra atın. NOT: Hücre eşitleme verimliliği hücre çizgileri arasında değişebilir. Nokodazolün optimal konsantrasyonu ve kuluçka süresi, FRET/FLIM deneylerinden önce akış sitometrisi yaklaşımları ile deneysel olarak belirlenmelidir. İstatistiksel olarak ilgili FRET/FLIM analizleri için G2/M'de genel hücre popülasyonunun en az %50'si kadar bir senkronizasyon verimliliği öneriyoruz.</li>
	<li>4. GÜN. Mitotik hücrelerde nokodazol yıkama ve FRET/FLIM görüntüleme<ol>
<li>Kültür ortamını bir pipetle çıkarın ve önceden ısıtılmış, steril PBS ile değiştirin. Mümkünse ışığa maruz kalmaktan kaçının. Tabağı hafifçe sallayın.</li>
		<li>Yıkama prosedürünü tekrarlayın, her zaman ışığa maruz kalmaktan kaçının.</li>
		<li>İkinci PBS yıkamayı çıkarın ve %20 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve %1 Penisilin-Streptomisin (bundan böyle görüntüleme ortamı) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış, steril Leibovitz L-15 ortamı ile değiştirin. NOT: Görüntüleme ortamı pH göstergesi (örneğin fenol kırmızısı) ve orta bileşenler riboflavin olmadan satın alınmalıdır. Bu maddeler, ömür boyu değerleri bozabilecek bir otofluoresans kaynağıdır.</li>
		<li>FRET/FLIM görüntülemeye devam edin. Sıcaklıktaki hızlı değişiklikleri en aza indirin ve mümkün olduğunca hızlı görüntüleme adımına (adım 3) geçin. Numuneyi mikroskop kurulumuna taşırken ışıktan korumayı düşünün (yani alüminyum bir folyoya sararak veya bir kutuya yerleştirerek).</li>
	</ol></li>
</ol>3. FRET/FLIM alımları
NOT: Bu protokoldeki FRET/FLIM alımları, in35 olarak tanımlanan ve 15,17'de olduğu gibi bir kontrol çözümü ile donatılmış özel yapım bir kurulum üzerinde gerçek yapılmıştır (Şekil 2). Kurulum artık Inscoper tarafından ticarileştirildi ve darbeli heyecan için beyaz lazerli bir dönen disk mikroskobundan ve kameranın önünde yüksek hızlı bir zaman kapılı yoğunlaştırıcıdan yapılmıştır. 10 ns'lik bir zaman diliminde 2 ns'lik zamansal kapılar, beş zaman kapılı görüntü yığını elde etmek için ardışık olarak kullanılır. Bu görüntüler daha sonra aşağıdaki denkleme göre piksel piksel ortalama floresan ömrünü hesaplamak için kullanılır: δti = ΔΔti • Δti ith kapısının gecikme süresine karşılık gelirken ben piksel piksel zaman geçişli yoğunluk görüntüsünü gösterir35,36 . Bu yöntem hızlı FLIM ölçümleri sağlar: montaj veya binning adımları gerekmez ve ömür, minimum foton bütçesi ile çevrimiçi modda hesaplanabilir. Sistem ayrıca kullanıcı dostu bir yazılım arayüzü sunar. Bununla birlikte, aynı deney FLIM ölçümleri için donatılmış diğer herhangi bir ticari mikroskop kurulumu altında gerçekleştirilebilir.
<ol><li>G2/M bloğundaki hücrelerin mitoza en uygun şekilde salınmasını sağlamak için 37 °C'de deneyler yapın. Mümkünse termostatik oda ile donatılmış mikroskop kurulumları ile FRET/FLIM deneyleri gerçekleştirin.</li>
	<li>Deneyden en az 30 dakika ila 1 saat önce mikroskobun termostatik odasını açın.</li>
	<li>Lazeri, kamerayı, mikroskop kurulumunu ve görüntüleme yazılımını çalıştırın (Şekil 2).</li>
	<li>Donör florofor için uygun ekscitasyon ve emisyon dalga boylarını seçin. Uygun dalga boyları seçenekleri şunlardır: mTurquoise2 için φex 440/10 nm ve φem 483/35 nm (Şekil 3A); GFP için φex 488/10 nm ve φem 525/50 nm(Şekil 3B).</li>
	<li>Pozlama süresini genellikle 30 ila 100 ms arasında ayarlayın (Şekil 3). Aşırı lazer gücünün fotobleaching olarak indüklenmiş fototoksik etkilere neden olabileceğine dikkat edin, bu da floresan ömrünü değiştirebilir37. Kurulumda, zaman atlamalı alımlar sırasında ilk kapının floresan yoğunluğunu izleyerek fotobleaching olaylarının yokluğunu doğrulayın. Floresan yoğunluğundaki değişimler gözlenebilirse, alımı atın ve lazer gücünü ayarlayın. NOT: Buradaki kurulumda, ilk kapıda en az 3000 gri düzeye izin verilen bir pozlama süresi seçin; aksi takdirde yazılım donör ömrünü hesaplamaz. Bu gri düzey değeri, ilgili yaşam değerleri elde etmek için gereken minimum foton bütçesine karşılık gelir.</li>
	<li>FRET/FLIM kazanımlarını başlatmadan önce, bipolar iğlerin ortaya çıkmasını bekleyerek hücrelerin mitoza girdiğinden emin olun (U2OS hücrelerinde ~ 20/30 dk). Mitotik AURKA esas olarak bu yapıda lokalize olduğundan, iğlerin doğrudan mikroskop altındaki hücrelerde oluşumunu harici bir ışık kaynağı ile tarayarak mitotik ilerlemeyi doğrulayın (Şekil 1). Mitotik ilerleme için gereken sürenin kullanılan hücre satırına göre değişebileceğini unutmayın.</li>
	<li>MLN8237 ile tedavi planlanıyorsa, hücreleri mikroskop altına yerleştirin ve metafaza ulaşmalarına izin verin (nokodazol yıkamadan yaklaşık 20 dakika sonra). DMSO'da çözünmüş 250 nM MLN8237'yi hem donör yapıyı ifade eden hücrelere hem de biyosensörü ifade eden hücrelere ekleyin.<ol>
<li>Yukarıdaki gibi transfected hücreler üzerinde bu durumu kontrol edin ve eşit miktarda DMSO ile kuluçkaya yaslanın. Daha iyi bir AURKA inhibisyonu için, DMSO'da MLN8237'nin tek kullanımlık aliquotlarını hazırlayın, -80 ° C'de saklayın. Aliquotları buza yerleştirerek çözün ve kullandıktan sonra atın.</li>
		<li>10 dakika kuluçkaya yaslanın. Bu süreden sonra, mitotik iğ küçülür ve sadece tek, yoğun bir nokta kalır. K162M mutantları kullanıldığında da benzer bir fenotip gözlenir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitotik iğdenin daha iyi çözülmesi için en az 63x hedef kullanın (Şekil 3).</li>
	<li>Metafazda bir hücre bulunduktan sonra (bkz. Şekil 4 metafazdaki bir hücre örneği olarak), xyz koordinatlarını görüş alanının ortasına yerleştirmek için ayarlayın.</li>
	<li>Daha hızlı görüntüler için tek bir z düzlemi seçin. Mitotik milin daha görünür veya yoğun olduğu düzlemi seçin.</li>
	<li>Kaydı başlatın. Alım süresi kullanılan FLIM kurulumuna göre değişebilir (birkaç saniyeden en aza kadar). Piyasada bulunan ticari kurulumların çoğu, hem floresan mikrografisini hem de piksel piksel yaşam haritasını detaylandıracaktır. Her iki görüntü de kaydedin.</li>
	<li>Her transfection ve/veya tedavi durumundan en az 10 bağımsız görüntü elde edin.</li>
</ol>4. ΔLifetime'ın hesaplanması ve donör/alıcı çiftler arasında FLIM değerlerinin karşılaştırılması
<ol><li>Piksel piksel yaşam boyu haritanın tamamından (yani, tüm mitotik mil) ömür boyu değerleri ayıklayın veya belirli alt bölgelere karşılık gelen ilgi alanlarını (ROI) seçin. NOT: Kullanılan FRET/FLIM kurulumuna göre, ömür boyu hesaplamalar doğrudan satın alma yazılımı üzerinde yapılabilir veya genel görüntü işleme çözümleriyle (örneğin, Fiji/ImageJ: https://fiji.sc/) çıkarılabilir. Yaşam boyu değerleri doğrudan hesaplayan yazılım ( çevrimiçi mod olarak da bilinir), yeni başlayanlar ve FRET / FLIM'e tam olarak aşina olmayan mikroskopi kullanıcıları için uygun olan daha kullanıcı dostu bir çözüm sunar. Aksine, edinimden sonra ömür boyu değerlerin çıkarılması genellikle uygun bir prosedür gerektirir. Bu seçenek yeni başlayanlar için daha az erişilebilirdir, çünkü matematiksel montaj modelleri hakkında daha önceki bazı bilgiler gereklidir.</li>
	<li>Görselleştirildikten veya çıkarıldıktan sonra, "yalnızca donör" vektörünü (örneğin, AURKA-mTurquoise2) ifade eden hücrelerin ortalama ömrünü hesaplayın, bu da donör ömrü anlamına gelir.</li>
	<li>4.1 adımında hesaplanan her bağımsız yaşam süresi değerini ortalama donör ömründen çıkarın. Analiz edilen tüm koşullarda tüm hücreler için bu adımın tekrarlanması, her durum için ΔLifetime verecektir.</li>
	<li>"Yalnızca donör", "biyosensör" ve "K162M" veya DMSO ve MLN8237 koşulları için ΔLifetime değerlerini karşılaştırın. NOT: "Yalnızca donör" durumu için, ΔLifetime sıfıra yakın ve ömür boyu değerlerin deneysel dalgalanmalarına karşılık gelen değerlerle sonuçlanmalıdır. "Biyosensör" koşulu için, ΔLifetime değerleri iki yapı arasındaki net farkı vermelidir (resimli bir örnek için Şekil 4'e bakın).</li>
	<li>ΔLifetime değerlerini farklı donör/alıcı çiftler arasında karşılaştırın.<ol>
<li>"Biyosensör" koşullarını karşılaştırın: benzer ΔLifetime gösteriyorlar mı?</li>
		<li>"K162M" veya MLN8237 koşulları aralarında benzer ΔLifetime gösteriyor mu? ΔLifetime'ları "yalnızca donör" durumuna benzer mi?</li>
	</ol>
</li>
</ol>

G.B. deneyleri gerçekleştirdi, makaleyi yazıp inceledi ve fon sağladı, M.T. makaleyi inceledi ve destek sağladı. Bu yazıda gösterilen hızlı FLIM ölçümleri için çözümler üreten Inscoper şirketinin (Fransa) bilimsel danışmanı ve hissedarı olan M.T. Inscoper makalenin Açık Erişim yayınını kısmen destekledi. Inscoper deneysel tasarım, veri işleme veya makalenin yazımında yer almadı.

Genetik olarak kodlanmış FRET biyosensörleri, tek proteinlerin veya tüm sinyal yollarının aktivasyonunu ölçmek için güvenilir araçlardır41. Özellikle, AURKA FRET biyosensörü, kinazın zaman ve mekanda aktivasyonunu keşfetmenin tercihli bir yolunu oluşturur. Bununla birlikte, bazı unsurlar bir FRET biyosensör tasarlarken veya optimize ederken, sadece genel anlamda değil, daha spesifik olarak AURKA için özel ilgiyi hak eder.
İlk olarak, donör/alıcı FRET çiftinin niteliği ve göreceli konumu bu kinazın belirli işlevlerine uyarlanabilir. AURKA, mitoz sırasında mitotik iğdede büyük ölçüde zenginleştirilmiştir, ancak hücre döngüsü boyunca ve farklı hücre altı yerlerde (örneğin, centrosomes, çekirdek ve mitokondri)1,2 bulunur. Biyosensör, asidik pH'a ulaşabilen mitokondri gibi belirli bölmelerde kullanılacaksa, mTurquoise2/shadowG olarak pH duyarsız donör-alıcı FRET çifti seçimi yapılmalıdır. Ayrıca, FRET donörün C-terminusuna yerleştirilmesi, biyosensörün bu hücre altı bölmesinde daha iyi bir şekilde görselleştirilmesine izin verebilir ve hatta AURKA N-terminus'un mitokondri16,42'de kısmen parçalandığının gösterildiği göz önüne alındığında FRET tespitini optimize edebilir.
İkincisi, AURKA FRET biyosensörünü optimize etmenin henüz keşfedilmemiş bir yolu, tam uzunlukta AURKA ve donör / alıcı çifti arasındaki bağlayıcıların daha dikkatli bir şekilde tasarlanmasını gerektirecektir. Sadece floresan çifti arasındaki mesafe değil, aynı zamanda bağlayıcının kendisinin özellikleri de FRET verimliliğini artırmak için temel faktörler olarak gösterildi43,44,45,46. Bu ışıkta, bağlayıcının sertliğini veya esnekliğini artırmak FRET verimliliğine zarar verebilir veya daha da iyileştirebilir.
Üçüncü olarak, AURKA'nın aşırı ifadesinin hücrelerin önemli bir kısmında mitotik iğ anormalliklerine neden olduğu bilinmektedir2. Memeli ekspresyon vektörlerinde bulunan en yaygın promotörlerden biri olan sitomegalovirüs (CMV) gibi güçlü bir promotör altında veya AURKA minimal promotör dizisi (CTTCCGG)14,47 altında aynı FRET yapıyı ifade ederek elde edilen ΔLifetime'ı karşılaştırmak ilginç olacaktır. Bu organizatörün daha önce kinazın devrilmesinden sonra ortaya çıkan tekelci veya çok kutuplu iğleri kurtardığı gösterildi ve kullanımı se14,47 başına hücre döngüsü pertürbasyonlarına neden olmadı. FLIM protein ekspresyon seviyelerine ve hücredeki göreceli konsantrasyonlara karşı duyarsız olsa da11, aynı biyosensör kurulumundaki iki promotörün kapsamlı bir karşılaştırmasından yararlanmak, herhangi bir yerdeki aktif AURKA havuzunun anlaşılmasını genişletecektir. Buna ek olarak, epitel ve hematolojik kanser paradigmaları için geçerli olan aşırı ifade üzerine AURKA aktivasyonunun nasıl değişebileceği hakkında yeni içgörüler sağlayacaktır.
Son olarak, aşağı akış FRET uygulaması da dikkate alınmalıdır. AURKA alanında gelecekteki bir bakış açısı, kinaz konformasyonal biyosensörü substrat bazlı bir biyosensörle bir araya getirmek olacaktır. İki biyosensörün FRET davranışını aynı anda analiz etmek - multipleks FRET olarak bilinen bir süreç - ikinci donör kanalında spektral kanamayı önlemek için ilk biyosensörde koyu renkli bir alıcı gerektirir. AURKA bağlamında, bu, kinazın ilk biyosensörle aktivasyonunu ve ikincisiyle belirli bir substrata doğru enzymatic aktivitesini tespit etmenin heyecan verici yeni perspektifini açacaktır. Çoklamadaki son gelişmeler artık aynı anda en fazla üç biyosensöre izin veriyor48. Benzer bir yöntemin AURKA bağlamında uygulanması, sadece kinazın aktivasyon etkinliği etkileşimini test etmek için değil, aynı zamanda AURKA sinyal basamaklarını benzeri görülmemiş mekansal çözünürlükle keşfetmek için de çok umut verici bir stratejiyi temsil edebilir.
Sonuç olarak, FRET/FLIM protein aktivitesi hakkındaki bilgileri derinleştirmek için uygun bir yoldur. Bir yandan, en az bir floresan moiety sayesinde, canlı hücrelerde belirli bir proteinin lokalizasyonunu görselleştirmeye izin verir. Öte yandan, protein aktivasyonu ve/veya aktivitesi hakkında bilgilendirici olabilecek protein konformasyon değişikliklerini çözebilir. Bu nedenle, FRET/FLIM ve konformasyonsal FRET biyosensörleri, canlı hücrelerde sinyal yollarını takip etmek için yaygın yöntemler haline gelme potansiyeline sahiptir ve enfes mekansal çözünürlüktedir.

Aurora kinaz A/AURKA, hücre döngüsü boyunca ve farklı hücre altı bölmelerde aktif olan çok fonksiyonlu bir serine/threonine kinazdır1. Geniş mekansal arteral aktivasyonunu anlamak kanserde özellikle önemlidir, çünkü AURKA genellikle epitel ve hematolojik malignitelerde aşırı ifade edilir ve hastalar şu anda mevcut tedavilere zayıf yanıt verir2.
Yapısal çalışmalar, AURKA'nın aktif olmayan bir kinazdan aktif bir kinaza dönüştürmek için iki adımdan geçtiğini ortaya koydu. İlk olarak, Thr288'in otofosforilasyonu kinazın kinetik cebinin konformasyonunu değiştirir ve 3,4,5,6'yı aktive eder. Bu adım, AURKA'nın insan hücrelerinde ve Xenopus laevis3,6,7'de katalitik aktivitesini artırarak kinazın tam aktiviteye neden olduğunu sağlar. Etkinleştirildikten sonra, AURKA'nın Xklp2 (TPX2) için hedefleme proteini ile etkileşimi ikinci bir konformasyon değişikliğine neden olur5. Bu daha fazla değişiklik, AURKA'nın hücredeki alt tabakalarına doğru tam enzymatic aktiviteye ulaşmasını sağlar5,8,9,10.
Yaklaşık yirmi yıl boyunca, AURKA'nın aktivasyonu ve aktivitesi hakkında içgörüler esas olarak biyokimyasal yaklaşımların bir kombinasyonu ile elde edildi. Bunlar arasında AURKA aktivasyonunun ayırt edici özelliği olarak hücrelerde veya in vivoda fosforilasyonlu Thr288'in tespiti, kristalografik analizler ve in vitro veya AURKA1'in aktivitesini araştırmak için selüloz kinaz tahlilleri sayıldı. Ancak, bu yaklaşımların mekansal çözümü zayıf veya yoktur ve bu iki olayın dinamiklerinin bilgisini genişletmek için yeni çözümlere ihtiyaç vardı.
Son birkaç yılda floresan probların gelişimi, AURKA'nın canlı hücrelerde izlenmesini kolaylaştırdı ve daha fazla mekansal çözünürlükle aktivasyonunun takip etmesine izin verdi. Şimdiye kadar geliştirilen AURKA için en spesifik sensörler, etkin olmayan ve aktif AURKA arasında ayrım yapmak için FRET prensibine (Förster'ın Rezonans Enerji Transferi)11'e güveniyor. Geliştirilen ilk sensör, AURKA kinaz aktivitesinin substrat bazlı bir biyosensörüydü. Substrat bazlı biyosensörler, fosforilasyon için belirli bir kinaz tarafından hedeflenen kısa bir aminoasik dizi ile oluşturulur ve bir donör / alıcı FRET çiftine ve verimli bir FRET işlemi için biyosensörün katlanmasına yardımcı olan fosforillenmiş kalıntıyı tanıyan bağlayıcı bir etki alanına yerleştirilir12. AURKA durumunda, fosforilasyon tarafından hedeflenen 14 aminoasidlik bir KIF2C parçası CFP-YFP donör/alıcı çifti arasına sokuldu13. Ancak, bu sensörün bazı büyük dezavantajları vardır. İlk olarak, bu probda kullanılan KIF2C dizisi hem AURKA hem de yakından ilişkili kinaz AURKB tarafından hedeflenebilir, böylece bu biyosensörün özgüllüğü azaltılabilir. İkincisi, sensör fosforilasyon için endojen kinazlara dayanır. Bu nedenle, kinaz miktarları sınırlanıyorsa (örneğin, hücre altı bölmelerde veya hücre döngüsü aşamalarında) FRET verimliliği tespit edilemez veya önemli olmayabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için "konformasyon sensörleri" olarak bilinen yeni bir AURKA sensörü sınıfı oluşturuldu. Bu problarda, AURKA'nın tam uzunluktaki dizisi N-terminustaki bir donör floroforu ve C-terminustaki bir kabul edici florofor içine yerleştirildi. Inaktif AURKA, kinazın N ve C-termini birbirinden uzaklaştıran "açık" bir uyum sunar. İki termini (> 10 nm) arasındaki bu mesafede, donör/alıcı çifti FRET için izin vermeyen bir yapılandırmadadır. Aksine, otofosforil aURKA, iki protein termini ve iki floroforun yakınında olduğu "kapalı" bir uyum benimsemiştir. Bu, donör ve alıcı arasında, donör ömründeki varyasyonlar kullanılarak ölçülebilen FRET'e izin verdiği gösterilmiştir14,15. Bu tür problar çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, genetik olarak kodlanırlar ve hücredeki endojen kinazın yerini almak için kullanılabilirler. İkincisi, AURKA'nın devrilmesiyle indüklenen fenotipleri kurtarırlar, bu da hücrede işlevsel olduklarını gösterir. Üçüncüsü, kinazın farklı hücre altı bölmelerde ve hücre döngüsü boyunca aktivasyonunu takip etmeye izin verirler. Problar, kinazın aktive olduğu bilinen yerlerde (yani centrosomes ve mitotik iğ) AURKA'nın aktivasyonunu tespit etti ve ayrıca mitokondri16'da AURKA'nın aktivasyonunu keşfetmeye katıldı. Son olarak, bu sensörler, yeni farmakolojik inhibitörleri tanımlamak için AURKA'nın konformasyon değişikliklerinin kullanıldığı FRET / FLIM tabanlı yüksek içerikli taramalara izin sağladı17.
Bu çalışmada, kültürlü hücrelerde AURKA aktivasyonunu görselleştirmek için bir prosedür açıklıyoruz. İlk olarak, FRET için potansiyel florofor çiftleri hakkında bir fikir vereceğiz. En uygun donör/alıcı çiftinin seçimi mevcut mikroskop kurulumuna veya multipleks FRET18,19 olarak belirli bir aşağı akış uygulamasına göre yapılacaktır. Ardından, hızlı bir FRET/FLIM mikroskop kurulumunda seçilen biyosensörlerin davranışlarını araştırmak için bir boru hattı öneriyoruz. Bu işlem hattı, hücre kültürü ve eşitleme yordamlarından FLIM edinme ve veri analizine kadar uzanacaktır. Son olarak, biyosensör tasarımı için benzer bir stratejinin diğer kinazlara uygulanabileceği ve diğer FRET tabanlı görüntüleme sistemleriyle de kullanılabileceği için bu protokolün potansiyel avantajlarını tartışacağız.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alisertib (MLN8237)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1133</td>
			<td>Use at a 250 nM final dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>41966052</td>
			<td>High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Leibovitz&#39;s L15 medium + L-glutamine, no Phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>2515380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Merck 
			Brand: Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>Use at a 100 ng/mL final dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>25300096</td>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of aurora kinase a activation using conformational fret biosensors in live cells

Epitel kanserleri genellikle Ser/Thr kinaz Aurora A/AURKA'nın aşırı ifadesi ile belirgindir. AURKA, Thr288'deki otofosforilasyonu üzerine aktive olan çok fonksiyonlu bir proteindir. Yapısal düzeyde iyi karakterize olmasına rağmen, hücre döngüsü boyunca AURKA'nın aktivasyonunun tutarlı bir şekilde izlenmesi eksiktir. Olası bir çözüm, AURKA'nın otofosforilasyonu hakkında yeterli mekansal çözünürlükle fikir edinmek için genetik olarak kodlanmış Förster'in Rezonans Enerji Transferi (FRET) biyosensörlerinin kullanılmasından oluşur. Burada, Thr288 otofosforilasyonünü tespit eden FRET biyosensörlerini ve mitoz sırasında bu modifikasyonun nasıl takip edeceğine dair bir protokol açıklıyoruz. İlk olarak, olası donör/kabul eden FRET çiftlerine genel bir bakış sunuyoruz ve memeli hücrelerinde AURKA FRET biyosensörlerinin olası klonlama ve yerleştirme yöntemlerini gösteriyoruz. Daha sonra, özel yapım bir kurulumda floresan ömür boyu görüntüleme mikroskopisi (FLIM) ile hızlı FRET ölçümleri için adım adım analiz sağlıyoruz. Ancak, bu protokol mevcut alternatif ticari çözümler için de geçerlidir. AURKA tabanlı bir biyosensör için en uygun FRET kontrollerini göz önünde bulundurarak ve bu aracın hassasiyetini daha da artırmak için gelecekteki potansiyel iyileştirmeleri vurgulayarak sonuca varıyoruz.

Farklı spektral özelliklere sahip iki biyosensör kullanarak Thr288'de AURKA'nın otofosforilasyonunu kaydetmek için yukarıda açıklanan prosedürü izledik. İlk GFP-AURKa-mCherry probu14'i farklı spektral özelliklere sahip iki biyosensörle karşılaştırdık. Bu iki prob, floresan donör mTurquoise2'ye ve bir durumda floresan olmayan bir alıcıya (ShadowG) veya ikinci bir durumda sarı bir alıcıya (superYFP) dayanır. Daha sonra her donör/alıcı çiftine tam uzunlukta AURKA dizisini ekledik. AURKA aktivasyonu için negatif kontrole sahip olmak için iki strateji izlenebilir. İlk olarak, küçük bir ATP-analog (MLN8237) kullanımı, kinazın kinetik cebine ATP'nin bağlanmasını engeller ve aktivasyonunu önler38. İkincisi, Lys162'nin Met'e (K162M) mutasyonu, her biyosensörün 14,15,39'u aktive edemeyen kinaz ölü bir versiyonunu oluşturur. Bu mutasyon, normalde Lys162 ve Glu181 arasında kurulan bir tuz köprüsünün bozulmasına neden olur, bu da kinazın kinetik cebinin istikrarlı bir şekilde açılmasına neden olur ve genel inaktivasyonunu tetikler40. FRET için negatif bir kontrol olarak, kabul edici-devoid bir yapı (GFP-AURKA veya AURKA-mTurquoise2) kullandık.
G2/M'deki hücreleri senkronize ettikten ve mitoza salduktan sonra, mitotik mildeki tüm transfected yapıların ömrünü ölçtük (Şekil 4). Not olarak, bu yapı bir bütün olarak kabul edildi ve mil içindeki hiçbir ROI analiz edildi. Daha sonra tüm koşullar için ΔLifetime'ı hesapladık. Beklendiği gibi, GFP-AURKA veya AURKA-mTurquoise2'nin ömrü ("yalnızca donör" koşulları) 0'a yakındı, bu da bu yapılar için ölçülen değerlerin ortalama değer etrafında dalgalandığını gösteriyordu (Şekil 4A,4B). Buna karşılık, GFP-AURKA-mCherry için ΔLifetime değerleri istatistiksel olarak yalnızca donör durumundan farklıydı ve ΔLifetime ~130 ps arttı (Şekil 4A). Benzer gözlemler shadowG-AURKA-mTurquoise2 ve superYFP-AURKA-mTurquoise2 için de yapılmıştır ve ΔLifetime'ın sadece donör durumundan sırasıyla ~150 ve ~220 ps arttığı (Şekil 4B,4C). Bu veriler, sahte renk arama tablosu (LUT) ile tek hücrelerde kolayca görselleştirilebilir. Bu durumda, ΔLifetime'ın 0 civarındaki değerleri sahte renkte sarı iken, daha önemli farklılıklar sahte renkte kırmızı/mordur. Gerçekten de, piksel piksel LUT, yalnızca donör yapılarını ifade eden hücrelerde sarıya daha yakınken, biyosensörü ifade eden hücrelerde kırmızı / mor spektrumda daha fazlaydı (Şekil 4A,4B). Bu durum, GFP-AURKA-mCherry biyosensörü mln8237 farmakolojik inhibitörü ile tedavi edildiğinde de gözlenmiştir.
Daha sonra kinaz ölü biyosensörlerinin ΔLifetime'ını analiz ettik. Bu yapılar ara ΔLifetime değerlerini gösterdi: ΔLifetime, yalnızca donör durumuna kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 4B,4C), ancak normal benzerlerinden de önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 4B,4D). MLN8237 ile tedavi edilen veya kinaz ölü biyosensörlerini ifade eden hücrelerle yapılan karşılaştırmalar, her donör/alıcı çift için ΔLifetime varyasyonlarının yalnızca AURKA'nın aktivasyonuyla bağlantılı olup olmadığını tahmin etmek için gereklidir. GFP-AURKA-mCherry durumunda, AURKA'ya özgü bir inhibitör kullanıldığında ΔLifetime varyasyonları ortadan kalkmaktadır. Tersine, ΔLifetime varyasyonları çoğunlukla, ancak shadowG-AURKA-mTurquoise2 ve superYFP-AURKA-mTurquoise2 durumunda sadece AURKA aktivasyonu ile bağlantılı değildir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig01.jpg"> Şekil 1: GFP (donör) ve mCherry (alıcı) ekscitasyon ve emisyon spektrumu. Spectra, FP temel web sitesinden (https://www.fpbase.org/) elde edildi ve uyarlandı ve 480 nm lazer uyarlamaya göre ayarlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig02.jpg"> Şekil 2: Deneysel çalışma alanının görüntüsü. (1) Kontrol çözümü; (2) beyaz lazer kaynağı; (3) CCD kamera; (4) mikroskop kurulumu; (5) numunenin oküler taraması için harici ışık kaynağı / lamba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig03.jpg"> Şekil 3: FLIM alımı için yazılımın temsili görüntüleri. (A, B) (1) donör için heyecan ve emisyon parametreleri ( A'da CFP veya B'de GFP); (2) pozlama süresi; (3) hedefin seçimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig04v3.jpg"> Şekil 4: AURKA FRET biyosensörlerinin temsili görüntüleri ve negatif kontrolleri. (A) (Mikrograflar) Floresan (yeşil kanal) ve GFP-AURKA veya GFP-AURKA-mCherry'yi ifade eden U2OS hücrelerinin ilgili piksel piksel ΔLifetime'ı (yalnızca donör – biyosensör), G2/M'de senkronize edilir, bipolar mil görünene kadar serbest bırakılır ve daha sonra DMSO veya MLN8237 ile tedavi edilir. ΔLifetime sahte renk ölçeği ("Ateş" arama tablosu) ile gösterilmiştir. (Grafik) Belirtilen koşullar için karşılık gelen niceleme ve iki yönlü ANOVA analizi. (B) (Mikrografiler) Floresan (camgöbeği kanalı) ve gölgeyi ifade eden U2OS hücrelerinin ilgili piksel piksel ΔLifetime 'ı (yalnızca donör – biyosensör) shadowG-AURKA-mTurquoise2 (üst panel) veya superYFP-AURKA-mTurquoise2 (alt panel), G2/M'de senkronize edilir ve iki kutuplu mil görünene kadar serbest bırakılır. ΔLifetime sahte renk ölçeği ("Ateş" arama tablosu) ile gösterilmiştir. (Grafik) Yukarıdaki mikrograflarda temsil edilen koşulların ilgili nicelleştirilmesi ve tek yönlü ANOVA analizi. (C) (Mikrograflar) AURKA-mTurquoise2 (üst panel), shadowG-AURKA K162M-mTurquoise2 (orta panel) ve superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2'nin görüntüleri mikrograflarda olduğu gibi elde edildi ve temsil edildi. (Grafik) Belirtilen transeksiyon koşulları için iki yönlü ANOVA analizi. Boxplots çubuk ortanca temsil eder; bıyıklar min'den maks. n = bir temsili deneyin (üç) durumu başına 10 hücreye kadar uzanır. Tek tek değerler nokta olarak temsil edilir. Ölçek çubuğu: 10 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (A) içinde belirtilen her koşula karşı (B) ve (C) içinde belirtilen her duruma karşı. NS: önemli değil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells at JoVE.com

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Çok fonksiyonlu Ser/Thr kinaz AURKA'nın aktivasyonu, Thr288'deki otofosforilasyonu ile ayırt edilir. Burada, mitoz boyunca kinaz aktivasyonunu takip etmek için hızlı bir FRET protokolü ile birlikte prob mühendisliği için bazı stratejileri göstermektedir.

Aurora kinazının Gerçek Zamanlı İzlenmesi Canlı Hücrelerde Konformasyonsal FRET Biyosensörleri Kullanılarak Aktivasyon

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...

real-time-monitoring-aurora-kinase-activation-using-conformational

Research

JoVE Journal

Biology

3.0K Görüntüleme.  Univ Rennes, CNRS, IGDR (Genetics and Development Institute of Rennes), UMR 6290, F-35000 Rennes, France. Çok fonksiyonlu Ser/Thr kinaz AURKA'nın aktivasyonu, Thr288'deki otofosforilasyonu ile ayırt edilir. Burada, mitoz boyunca kinaz aktivasyonunu takip etmek için hızlı bir FRET protokolü ile birlikte prob mühendisliği için bazı stratejileri göstermektedir.

Video: Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Biyoloji

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...