This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).

1. Geçici Transfeksiyon Not: CytoBAS ve NucleoBAS (Malzeme Tablo bakınız) başarılı bir şekilde çok sayıda hücre türleri (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK ve HEK293T hücreleri) kullanılmıştır. Sensör kullanmak için ana şartı o hücreye girmek için kodlama DNA gerektiren ifade edilecek gerekiyor. <ol><li> % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 FBS,% 1 L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) için uygun olan komple kültür ortamında hücrelerin seyreltilir. </li><li> Steril 8 de odacıklı cam kapak (0.8 cm 2) içine istenilen yoğunlukta Plaka hücreleri. Bu gerekli değildir, ancak bir alt-konfluent (% 60-80 konflüansa), deney günü hücre katmanı Amaç. </li><li> Oyuk başına 400 ul nihai hacme kadar komple kültür ortamı. Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir. </li><li> NucleoBAS ve 0.5 ug eklenmesi ile steril tüp içine transfeksiyon karışımı hazırlayınveya kültür ortamının 100 ul CytoBAS DNA (serum / antibiyotik serbest). Iyi girdap. Bir transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks karıştırın. Optimum verim vermek transfeksiyon reaktifleri hücre tipi bağlıdır ve önceki test gerektirebilir. <ol><li> Örneğin, 1 mg / ml polietilenimin (PEI) 2.5 ul kullanımı ve DNA / PEI 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın inkübe edin. </li></ol></li><li> Hücrelere damlacıklar transfeksiyon karışımı ekleyin ve hafifçe elle plaka sallayarak karıştırın. 9.6 cm 2 ~ bir kuyu için karışımın 100 ul ekleyin. Geçici olarak transfekte hücreler için ayrı ayrı görüntüleme odaları için transfeksiyon karışımı 10 ul kullanın. Not: 24-48 saat sonra, hücreler, safra asidi sensörü ifade edecektir ve deneyler için de kullanılabilir. </li></ol> 2. Kararlı Transfeksiyon <ol><li> % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 Fetal Sığır S için uygun komple kültür ortamında pelet seyreltinERUM,% 1, ml başına 150.000 hücre konsantrasyonunda L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) ve 6 oyuklu bir kültür plakasına (2 mi ucu hacim) oyuk başına yaklaşık 300,000 hücre ekleyin. </li><li> Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir. </li><li> CytoBAS veya NucleoBAS DNA 0.5 mikrogram ekleyerek steril tüpe tranfeksiyon karışımı hazırlayın kültür ortamında 100 ul (serum / antibiyotik ücretsiz) için (Malzeme Tablosuna bakınız). Iyi girdap. Bir transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks karıştırın. <ol><li> Örneğin, 1 mg / ml polietilenimin (PEI) 2.5 ul kullanımı ve DNA / PEI 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın inkübe edin. </li></ol></li><li> Hücrelere damlacıkları içinde transfeksiyon karışımı 100 ul ekleyin ve hafifçe elle plaka çalkalayarak karıştırın. Stabil bir hücre dizisi oluşturmak her zaman bir transfekte edilmemiş kontrol içerir. </li><li> 37 ° C&#39;de hücreler O / N büyütün,% 5 CO2. </li><li> Hücreleri tripsinize edin üreticinin protokolüne uygun olarak (37 ° C w hücreleri inkübei 1.5 ml 25 cm 2 hücre kültürü başına tripsin önceden ısıtılmış) ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 250 xg&#39;de onları aşağı doğru döndürün. Tam kültür ortamı içinde 13 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Çeşitli 10 cm çapında kültür yemekleri üzerine hücreler bölün: 0.5 ml (düşük yoğunluklu), 1.5 ml (orta yoğunlukta) ve 4.5 ml (yüksek yoğunluklu). 6.5 ml kalan için de yapın. </li><li> 10 ml nihai hacme kadar kültür ortamı. U2OS hücreleri için, örneğin CytoBAS olarak neomisin direnç kaseti ile plasmidler için 800 ug / ml G418 kullanmak NucleoBAS pozitif hücreleri seçmek için inşa eder. Bu konsantrasyonlar hücre tipi bağlıdır ve transfekte edilmemiş hücreler, 2 ila 10 gün (U2OS hücreleri için 800 ug / ml G418) içinde öldü düşük antibiyotik (G418) konsantrasyonu seçilerek belirlenebilir. </li><li> Untransfected hücreler ölene kadar uygun antibiyotik (G418) ile kültür ortamı her 72 saat yenileyin. </li><li> 20X bir amaç için mikroskop altında kültürü plakası inceleyinpozitif koloniler (floresans, yeşil, mavi veya sarı floresan için kullanılan en filtre kümesi kullanılarak izlenebilir). </li><li> Kültür çanak dış altındaki bir kalemle diğer kolonilerden izole yalan olumlu koloniler işaretleyin. </li><li> Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile iki kez plaka yıkayın ve aspire. Yaklaşık 15 steril klonlama silindirleri alın ve steril silikon içine batırın. Petri yemek hafifçe basılarak seçilen kolonilerin etrafında onları uygulayın ve birden fazla koloni klonlama halkada yer olduğundan emin olun. </li><li> Pipet 20 klonlama silindirde önceden ısıtılmış tripsin (1 x, 0.25%) ve ul ve yuvarlanır hücrelerin çoğu (mikroskopla dikkat edin) kadar 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Klonlama silindir (U2OS ve Huh7 hücreleri,% 10 FBS ve 800 ug / ml G418) serumu ve uygun antibiyotik ile kültür ortamında 150 ul ilave edin ve aşağı hücreleri tekrar süspansiyon ve 96- aktarmak birkaç kez pipetleyin veiyi plaka. 4-24 saat sonra orta yenileyin ve hücreler önümüzdeki birkaç gün (37 ° C, U2OS ve Huh7 hücreleri için% 5 CO 2) &#39;de konfluent büyümeye olanak sağlar. </li><li> Her 3 veya 4 gün antibiyotik ile orta yenileyin. Hücreler konfluent büyüdü sonra, daha geniş bir plaka aktarabilirsiniz. Kültür deneyler için yeterince büyük olana kadar bu adımı yineleyin. Yedekleme için bazı şişeleri cryopreserve. Soğukta saklama ortamı takviyesi olmayan ortam (DMEM) içinde% 20 FBS ve% 20 DMSO içerir. Not: Şimdi, hücre çizgisi monoklonal ve safra asidi Sensor ifade etmek için kararlı olarak düşünülmektedir. Antibiyotik G418 (400 mg / ml) yarısı konsantrasyonu stabil hücre ekspresyonu sağlamak için artık yeterli olmaktadır. </li></ol> 3. Lentiviral İletimi Not: Bazı hücre çizgileri, polietilenimin (PEI) yöntemi gibi geleneksel yöntemler ile transfekte etmek zordur olarak kabul edilir. Hücrelerin viral transdüksiyon etkin alternatif bir araç fveya gen dağıtım ve stabil transgen ekspresyon. <ol><li> % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 FBS,% 1 L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) için tam kültür ortamı içinde hücreler, uygun seyreltilir ve 6 oyuklu bir kültür plakasına oyuk başına yaklaşık 200,000 hücre ekleyin. </li><li> Oyuk başına 2 ml&#39;lik bir nihai hacme kadar kültür ortamı. Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir. </li><li> 500 ul CytoBAS lentivirüs (isteğe bağlı olarak) ihtiva eden ortam ile 4-6 saat boyunca kuluçkaya hücreler viral transductions gerçekleştirme 10 ug / ml dietilaminoetil (DEAE) -dextran ya da başka bir lentiviral içeren tam kültür ortamı ile 1 ml &#39;lik bir toplam miktar kadar doldurulur transdüksiyon arttırıcı. Untransduced kontrol hücreleri ile bir kuyu eklemeyi unutmayın. </li><li> Ortamı çıkarın ve istenen antibiyotik (500 ug / ml higromisin) içeren tam kültür ortamı 2 ilave edin. Temin CytoBAS transdüksiyon bir lentiviral yapı kullanaraks hücrelere direnç higromisin. İstenen şartlar altında hücrelerin büyütün. </li><li> 3 günde antibiyotik (500 ug / ml higromisin) ile orta yenileyin ve% 80 confluent, tüm negatif kontrol hücreleri ölene kadar (çoğu hücre hatları için yaklaşık 1-2 hafta sürer) ne zaman hücreleri bölme. Hücre hattı artık Safra Asit Sensörü ifade etmek için stabil sayılır. <ol><li> Seçenek olarak ise, 1-3 gün viral transdüksiyon sonra deneyler için hücreleri kullanır. Canlı virüs mevcut olabilir gibi, bu uygun güvenlik düzeyine sahip odalarda FRET-okuma ekipmanı gerektirir. </li></ol></li><li> Seçenek olarak ise, stabil hücre hatlarının izolasyonu için hızlı, floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) gerçekleştirmek. <ol><li> Bir konfluan 160 cm 2 şişesi Hasat hücreleri. </li><li> Ml başına en fazla 5 x 10 6 hücre bir konsantrasyona &lt;% 5 serum ile Leibovitz kültür ortamı hücreleri (L-15 ortamı) ile seyreltilir </li><li> Sıralanan hücrelerin toplanması için toplama orta 1 ml (L-1 ile FACS tüpleri doldurmak5 ortamı +% 1.5 pen / strep,% 1 L-fazlalığı ve% 20 serum). </li><li> 405 lazerle heyecanlı sitrin (520-580 nm) veya Cerulean (450-520 nm) için sıralama hücreleri. </li><li> Yaklaşık 500,000 hücre sıralama sonra hücreler (5 dakika, 250 x g) durması ve 5 ml bunları tekrar süspansiyon, normal komple kültür ortamı (% 10 FBS, 250 ug / ml Higromisin U2OS ve Huh7 CytoBAS hücreleri) ve bir T25 kültür onları plaka şişe. İstenen koşullar (37 ° C U2OS ve Huh7 hücreleri,% 5 CO2) altında hücre büyütün. </li></ol></li></ol> Safra Asit Sensör 4. Canlı Hücre Görüntüleme Not: safra asidi taşıyıcıları ihtiva eden hücreler, lipofilik bileşikleri çıkaran% 1-10 kömür filtrelendi serumu ile ortam içinde kültürlenebilir. Normal serum sık sık Safra Asit Sensör hücre içi safra asidi birikimine ve doygunluk yol açabilecek safra asitleri içerir. <ol><li> Konfokal mikroskop kullanılarak FRET ölçümler <ol><li> Sabit olarak veya transie hücreler plakantly steril 8 kuyu lamel dipli haznesi slayt içine istenilen yoğunlukta sensörü ifade (0.8 cm 2). Tüm kültür ortamı hücreleri büyümek (kömür filtrelendi serum kullanılarak), böylece deney gününde, birbirine karışmaya yaklaşık% 60-70 kadardır. </li><li> PBS veya Leibovitz L-15 kültür ortamında 1 x 200 ul ile bir kez oda slayt yapışık hücreler yıkanır. </li><li> Herhangi bir CO2 kontrol edilmesi gereklidir, böylece aspire edin ve 300 ul Leibovitz L-15 kültür ortamı ile değiştirin. Not: fenol kırmızısı olmadan DMEM da kullanılabilir, ancak CO 2 tamponlu koşulları gerektirir. Safra asidi sensörü gösterileri (bazı) pH duyarlılığı öylesine veri toplama sırasında pH sabit tutmak hedefliyoruz. </li><li> L-15 kültür ortamında da konfokal görüntüleme deneyinde kullanılacak bileşikleri seyreltilir. Görüntüleme sırasında, oda içindeki sıvının nispeten büyük miktarlarda numune (50-100 ul), hızlı bir şekilde karışmasını sağlamak için ilave edilmesi gerekir dikkate almakböylece 3-5x çözümler yapmak. </li><li> 37 ° C inkübasyon odası ile bir konfokal mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın ve menekşe 405 nm lazer açın. Amaç üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve bunun üstüne 8 odasına yerleştirin. FRET tek hücre görüntüleme için, 63X yağ objektif kullanın. Sensör başarıyla oda sıcaklığında kullanılır olmuştur, ancak hücre davranışı değişmiş olabilir. </li><li> Düzgün konfokal mikroskop ayarlarını yapın. <ol><li> Set Toplama modu: XYT (tek odak düzlemi zaman atlamalı görüntüleme). </li><li> Denemeyi duraklamadan bileşikler satın almalar arasında eklenecek izin 20 sn aralıklarla görüntüleri edinin. </li><li> Cerulean: Emisyon tespiti için ayarlayın spektral aralık 450-520 nm; Sitrin: 520-580 nm. </li></ol></li><li> Transillüminasyon ışık kullanılarak tek bir hücre tabakası üzerinde odaklanır. Görüntüleme başlatın ve daha doğrusu z-konumunu ayarlamak. Kazanç ayarlayın ve devam ederken arka planda gelen sinyali ayırt etmek her kanal için ofsetilgi hücreleri tüm pikseller için iyi bir doyma aşağıdaki ing. </li><li> Faiz (ROI) bölgeyi tanımlamak için daireler çizin. Benzer floresan gösteren hücreleri seçin. Açıkçası boyut ve şekle ortalama hücre farklı hücreler kaçının. Sensörün photobleaching en aza indirmek için mümkün olduğu kadar kısa bir süre boyunca ışığa hücreleri Açığa. Bu hücre çevresine çok yakın değil ROI&#39;leri çizmek tavsiye edilir. Bu alan, fokal sürüklenme (z-yönünde hareket eden hücreler) daha zor deney sırasında flüoresan oranındaki değişiklikleri izlemek için hale getirmek için flüoresan yoğunluğundaki değişimlerle en duyarlıdır. </li><li> Konfokal mikroskop ile ölçümler başlayın. Gök mavisi ve sitrin floresan sabit olana kadar bekleyin. </li><li> Ölçüm sırasında seçilen zaman noktalarında 50-100 ul safra asitleri veya başka bileşikler ekleyin. Sıvı (nihai hacmin üçte birine beşte biri) nispeten yüksek miktarlarda / p çalkalamadan (10 saniye içinde) de sıvıları karıştırmak için gerekli olanYukarı ve aşağı ipetting. Pipet ile 8-iyi odasının kenarına dokunacak ve hücreler odak dışında alamadım böylece yavaş yavaş sıvı eklemek için emin olun. Plato fazı ulaşılmadan önce yeni bileşikler ilave etmeyin. Bu yaklaşık 200 saniye sürer. </li><li> 100 ul GW4064, son konsantrasyonu 5-10 uM (sensör doyurucu doz) eklenmesi ile her deney sonlandırın ve sensör floresan stabil olana kadar bekleyin. </li><li> Denemeyi kaydedin ve bir AVI dosyası olarak veri ihracat. </li><li> ImageJ aç hem AVI dosyaları (kanal 00, gök mavisi, 01 kanal, sitrin) Eklentiler&gt; Yığınlar&gt; Yığın harmanlayıcıyı seçerek. Alternatif doğrudan Görüntü J, ithalat confocal dosyası (örneğin, .lsm veya .lif dosyaları) (http://www.openmicroscopy.org mevcut) uygun eklentileri kullanarak ve 4.1.14 adıma geçin. <ol><li> Stack 1: Kanal 01 (sitrin) kullanın. </li><li> Stack 2 için: Kanal 00 (cerulean) kullanın. </li></ol></li><li> Düzenle üzerine tıklayın&gt; Seçim&gt; ekleyöneticiye, ROI yöneticisi penceresini açmak için. Onay kutusunu işaretleyin &#39;Tümünü Göster&#39;. </li><li> Oval Seçim aracıyla belirli hücrelerin kapsayan ilgi birkaç bölgelerini (ROI) çizin. Ayrıca hücrelerin dışında veya arka plan sinyalini belirlemek için sensör ifade etmeyen bir hücrenin içerisindeki bir alanda tek daire çizin. Bu bağlı fokal sürüklenme (z-yönünde hareket eden hücreler) ya da hücre göçü için floresan yoğunluğundaki değişiklik belirgin iken deneylerde hücre çevresine çok yakın ROI çizmek için tavsiye edilir. </li><li> Tek hücreyi seçin. Eklentiler&gt; Oran Profiler tıklayın. RAW, oran ve Ratio_Profile Bu 3 ekranlar ile sonuçlanacaktır. RAW penceresi FRET varsa sitrin (mavi çizgi) yoğunluğundaki artış ve cerulean (kırmızı çizgi) bir düşüş göstermektedir. Oran penceresi FRET bir artış ile artacağı cerulean oranı sitrin / hakkında bilgi verir. Ratio_Profile penceresi her iki kanal ölçülen floresan yoğunluğunun gerçek sayısını verir. MICROS EğerDosyaları kanal sırası tersine olabilir kullanılan kurulum özgü dosyaları (örneğin, .lsm veya .lif yerine avi) baş. </li><li> Ek veri olarak ekli e-tabloda Ratio_Profile penceresinden verileri kopyalayın. Diğer tüm hücreler (ve arka plan ROI) için de yapın. Not: Online e-tablo, tüm veri maksimum BAS aktivasyonu beklenen hangi duruma normalize edilir. GW4064 FXR en güçlü bir aktivatör olduğu göz önüne alındığında, GW4064 bir fazlalık ile inkübe edildikten sonra flöresan oranı Bu GW4064 ilavesiyle deney sonuna tek önemlidir 1 olarak ayarlanır. Bunun avantajı, verileri artık daha kolay bir şekilde kıyaslanabilir farklı günlerde lazer yoğunluğu ya da dedektör kazanç ve deneyler bağımlı olmasıdır. Ayrıca, elektronik tablonun alt grafikte, bir çalışan ortalama deneysel gürültü eğrileri düzeltmek için de kullanılabilir. Çalışan Avera beri, kinetik veriler analiz Ancak, bu grafiği kullanmayınge pürüzsüz, hızlı kinetik tepkiler de olacaktır. </li></ol></li><li> Kontrol THP kullanılarak FRET ölçümleri (FACS) <ol><li> Steril FACS alım tamponu (0.3 mM EDTA,% 0.5 BSA,% 0.01 NaN3 ve 10 mM D-glukoz) FACS deneyi için tüm bileşikleri seyreltilir. </li><li> PBS içinde 5 mM EDTA kullanılarak% 80 birbirine bağlı T-160 cm 2 hücre kültür şişesi Hasat hücreleri. 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Oda sıcaklığında 5 ml FACS alım tamponu içinde yıkayın hücre topağı 2x. </li><li> Coulter Sayacı veya sayma odacığı kullanılarak hücre sayımı. </li><li> 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar FACS alım tamponu pelet seyreltin. Tek hücre homojen bir süspansiyon oluşturmak için yukarı ve aşağı pipet ve. Hücreler ayrıştırmak zordur iseniz, meme takunya en aza indirmek için sıralama önce hücre süzgecinden örnekleri koydu. </li><li> Pipet 200 ul FACS tüpü başına hücre ve ışıktan koruyunuz. </li><li> Bileşiğin istenen konsantrasyonu ekleme (örneğin,, Safra asitleri, sentetik FXR ligandlar, taşıyıcı inhibitörleri). Vortex. (Karanlıkta) çalkalayarak oda sıcaklığında 20-30 dakika kuluçkalayın. </li><li> Bu arada, FACS (lazerler ısınmak için zamana ihtiyacım var) başlatın. </li><li> Deney (bakınız Şekil 3) için yolluk parametreleri flow sitometri ayarlayın: <ol><li> Kapıları belirlemek için hücreleri transfekte 100.000-200.000 NucleoBAS veya CytoBAS etrafında yükleyin. </li><li> İlk arsa merkezinde hücreleri çizmek için FSC ve SSC gerilimler ayarlayın. </li><li> Menekşe lazer kullanarak Cerulean (450/40 nm) gerilim değeri ve sitrin (525/20 nm) gerilim ayarlamak ve tüm NucleoBAS veya CytoBAS pozitif hücreler dağılım arsa içinde çizilen emin olun. </li><li> Bakınız Şekil 4, doğru kapıları (Gate P4 kadar Gate P1) ayarlayın. <ol><li> SSC-A / FSC-A arsa ortasında ana nüfusu seçerek genellikle sol alt köşesinde görüntülenen ölü hücreleri, dışlamak için kapı P1 kullanın. </li><li> Gate P2 kullanınFSC-H / FSC-bir pencere analizinden duplets kaldırmak için. Tek hücreler çiftler daha diyagonal çizgi sunulmuştur. </li><li> Sitrin Gate P3 (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) pencere citrine ve gök mavisi yüksek hücrelerin yolluk, NucleoBAS / CytoBAS pozitif hücreleri seçmek için kullanılabilir, bir nüfus sağ üst köşesinde çaprazdan görüntülenen arsa. </li><li> Mümkün olduğunca yakın nüfusun sol üst, kapısının P4 çizin ve hücrelerin en fazla 5% Bu kapının içinde kalan emin olun. </li></ol></li><li> Otomatik floresan belirlemek için bazı untransfected hücreler (CytoBAS veya NucleoBAS hiçbir ifadesi) yükleyin. Untransfected nüfus kapısı P3 bulunan olmayabilir. Otomatik floresan hücreleri hariç gerektiğinde kapı P3 ayarlayın. </li></ol></li><li> FACS tüpleri koymadan önce örnekleri Vortex. Her bir örnek için, kapı P3 en az 10,000 hücre ölçer. Not: Nüfus Hiyerarşi Pencere olayların sayısını verirebeveyn kapısının her kapısı ve% için görüntülenen. Kapının 4&#39;te, ebeveynin% Tüm NucleoBAS pozitif hücrelerin yüzdesi olarak artan bir sitrin / cerulean oranı hücreleri belirtmektedir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics.">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+FRET+sensor+proteins+based+on+mutually+exclusive+domain+interactions.">Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).</li><li>Lindenburg, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Stickiness:+Thermodynamic+Characterization+of+Intramolecular+Domain+Interactions+To+Guide+the+Design+of+Fo&#776;rster+Resonance+Energy+Transfer+Sensors.">Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Fo&#776;rster Resonance Energy Transfer Sensors.</a> Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).</li><li>van der Velden, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+bile+acid+transport+in+single+living+cells+using+a+genetically+encoded+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+sensor.">Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer sensor.</a> J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).</li><li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heteromeric+organic+solute+transporter+&#945;-&#946;,+Ost&#945;-Ost&#946;,+is+an+ileal+basolateral+bile+acid+transporter.">The heteromeric organic solute transporter &#945;-&#946;, Ost&#945;-Ost&#946;, is an ileal basolateral bile acid transporter.</a> J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).</li><li>Meier, P. J., Stieger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salt+transporters.">Bile salt transporters.</a> Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).</li><li>Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mTurquoise-based+cAMP+sensor+for+both+FLIM+and+ratiometric+read-out+has+improved+dynamic+range.">A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range.</a> PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Plass, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesoid+X+receptor+and+bile+salts+are+involved+in+transcriptional+regulation+of+the+gene+encoding+the+human+bile+salt+export+pump.">Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump.</a> J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada canlı hücrelerin safra asidi taşıma uzaysal dinamiklerini izleme yeteneğine sahip yeni bir genetik olarak kodlanmış safra asidi sensörü kullanılması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu biyosensör böylece FRET tabanlı safra asidi sensörüne (BAS) oluşturulması, FXR-LBD&#39;sine füzyonla birleştirilir gök mavisi ve sitrin floresan proteinlerden oluşur. Hücre kültürü ve FACS veya (konfokal) mikroskopi temel deneyime sahip olduğunda Safra Asit Sensör kull...

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) yaygın olarak yüksek zamansal ve uzaysal çözünürlüğü 1 ile canlı hücrelerin hücresel fonksiyonları daha iyi anlayabilmek için kullanılır. FRET olarak uyarılmış bir donor-florofor enerji alıcı bir florofor aktarılır. Verimliliği FRET verici ve alıcı bir florofor ve yönelimi arasındaki mesafe sıkı bir şekilde bağlıdır ve bu nedenle, iki florofor etkileyen konformasyonel değişiklikler duyarlı bir değerini göstermektedir. Bu olay küçük moleküllerin görüntüleme için FRET tabanlı biyosensörler oluşturmak için istismar edilmektedir. Artar / verici florofor 2 karşı alıcısı emisyon şiddeti oranı azaldıkça bunların konsantrasyonundaki değişiklikleri takip edilebilir. Örneğin, FRET bazlı kalsiyum biyosensör hücreler 3 canlı M serbest kalsiyum konsantrasyonlarında hızlı ve kararlı bir tespiti için verir. FRET tabanlı biyosensörler diğer avantajları tek canlı hücrelerinde görüntüleme vardır, tvaris non-invaziv, yetenekleri değişik hücre türleri ve hücre bölmeleri 4 hedeflenmesini. Hücre içi safra asidi dinamiklerinin birçok yönü hala tam olarak anlaşılamamıştır. Örneğin, küçük konjuge ve konjuge olmayan safra asidi taşıma mekanizması altında yatan yönetmelik hakkında bilinmektedir. Teknikleri Mevcut bu taşıma öncelikle lusiferaz-tabanlı gazetecilere, radyoaktif işaretli safra asitlerinin, ya da floresan safra asidi analoglarının faydalanmak izlemek. İkincisi muhtemelen onların özelliklerini etkileyen safra asitlerinin değiştirilmesine gerektirir. Lusiferaz tabanlı muhabirler kötü zaman çözünürlüğe sahip. Bunun yanı sıra, bu teknikler, örneğin kaybına neden olur ve tek hücre görüntüleme için geçerli değildir. Bu nedenle, bu rasyometrik algılama 5, 6 avantajı içerir, çünkü özellikle FRET biyosensörler kullanan taşımacılık faaliyetlerinin canlı tek bir hücre görüntüleme sağlayan yöntemleri kullanmak yararlı olacaktır. Iken CF varyantlarıP / YFP formu en sık FRET çiftleri kırmızı-kaymıştır safra asidi sensörü 7 de dahil olmak üzere yeni sensörler ile FRET araç kutusunun bir genişlemeye yol açmıştır kendini dernek uyaran mutasyonları taşıyan Morange ve mCherry kullanarak yeni stratejiler kullanılmıştır. Daha önce farnesoid X reseptörü (FXR) ligand bağlanma domeni ile kaynaşmış bir donor-florofor (cerulean) ve bir akseptör-floroforu (sitrin) oluşan genetik olarak kodlanmış FRET safra asidi sensörüne (BAS) hazırlandı (FXR-LBD) ve bir peptit, bir LXXLL motifi 8 ihtiva etmektedir. Bir safra asidi bağımlı bir şekilde FXR-LBD This peptid ilişkilendirir. FXR aktivasyonu üzerine, sitrin ve Cerulean arasındaki uzaklık şekilsel bir değişikliğe bağlı değiştirecektir. Memeli hücre hatlarında, sitrin / cerulean oranında açık bir şekilde tespit edilebilir bir artış FXR, etkinleştirme, saflaştırılmış sensör ters yönde çalışır ve FXR aktivasyon üzerine azalan bir FRET oranı neden olurken. Bu sensör (CytoBAS)Sitozolik safra asidi dinamikleri izlenmesine olanak sağlar. Hücre içi hedefleme motifleri karboksil terminal ilavesi ile, BAS konstrukt, farklı hücre bölmeleri safra asidi konsantrasyonlarının ölçülmesini sağlar çekirdeğin (NucleoBAS) ve peroksizom (PeroxiBAS) hedeflenebilir. Peroksisomal hedefleme motifinin eklenmesi safra asitleri olan yanıt zarar vermez, ancak hücre geçirgen FXR-ligandları bir peroksizom 8 içindeki PeroxiBAS değişiklikleri FRET uyarmadı. Bu tutarsızlık doğası bilinmemektedir gibi, protokol aşağıda CytoBAS ve NucleoBAS odaklanmıştır. Bu genetik olarak kodlanmış FRET sensör kullanımı yakın zamanda safra asidi taşıyıcıları + / taurokolat ko-taşıma polipeptid (NTCP), Na ve organik çözücünün taşıyıcı alfa / beta (OSTαβ) 8 ihtiva eden hücreler gösterilmiştir. NTCP başlıca karaciğer safra asidi ithalatçı ve OSTαβ bir bazolateral bağırsak safra olduğunuelektrokimyasal safra asidi konsantrasyonu gradyanı 9, 10 bağımlı bir ithalatçı ve ihracatçı hem işlev görebilir asit taşıyıcı. Son veriler NTCP ve / veya OSTαβ safra asidi taşıma sırasında, ligand-FXR-LBD etkileşiminin bir sonucu olarak, FRET oranda sağlam ve hızlı yanıt gözlenebilir gösterdi. Burada, biz böyle odaklı mikroskopik analiz ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) olarak FRET ölçmek için yöntemler ayrıntılı protokoller tanımlayan kritik adımları vurgulamak, olası sorunları çözmek ve alternatif yöntemleri tartışmak. Bu genetik olarak kodlanmış FRET sensörünü kullanarak, FXR-LBD ile safra asidi etkileşimi sayısal ve canlı hücrelerin doğrudan izlenir ve gerçek zamanlı olarak safra asidi taşıma ve dinamiklerini görselleştirme hızlı ve basit bir yöntem sağlar edilebilir. CytoBAS ve NucleoBAS kodlayan memeli sentezleme plasmidleri ticari olarak temin edilebilir. Bu nedenle, bu biyosensör daha katkıdasafra asidi taşıyıcılar veya FXR etkinleştirmek ve safra asidi biyoloji ve sinyalizasyon içine daha derin bir kavrayış sağlayan bileşiklerin anlayış.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">CytoBAS&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:145px;">62860</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoBAS&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Addgene</td>
			<td align="right">62861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Dulbecco&#39;s modified Eagles media (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td>High glucose without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (pen/strep)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">L-glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">102-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">T-25 cell culture flask</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0253</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">T-175 cell culture flask</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0238</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">6-well plate</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">734-0229</td>
			<td>Poly-L-lysine and Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">10cm dish</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0243</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Polyethylenimine (PEI)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Brunschwig</td>
			<td style="width:145px;">23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">G418 (geneticin) 50 mg/ml</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">10131-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Hygromycin B, 50 mg / ml</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Cloning cylinder (6x8 mm)</td>
			<td style="width:173px;">Bellco</td>
			<td style="width:145px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">L-15 Leibovitz culture medium</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">21083-027</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:300px;">Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube</td>
			<td style="width:173px;">Falcon BD</td>
			<td style="width:145px;">352008</td>
			<td>No cap, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Falcon 2063 tubes (5 ml)</td>
			<td style="width:173px;">Falcon BD</td>
			<td align="right" style="width:145px;">352063</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Nunc Lab-Tek 8 well coverglass</td>
			<td style="width:173px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:145px;">155409</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Charcoal-filtered FBS</td>
			<td style="width:173px;">Life technologies</td>
			<td style="width:145px;">12676011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">GW4064</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G5172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">TCDCA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">T6260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">CDCA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">C9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Other chemicals</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">n.v.t.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time monitoring of intracellular bile acid dynamics using a genetically encoded fret-based bile acid sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

Sunulan FRET BAS sensörü, iki florofor sitrin ve gök mavisi) ile bir LXXLL motifi bağlı FXR (LBD-FXR) ligand bağlanma dayanmaktadır. Bu sensör, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe (Şekil 1 A) canlı hücreler safra asidi taşıma soruşturmalar izin verir. Gök mavisi ve sitrin mutasyonlar molekül içi kompleksi (Şekil 1 B) oluşumunu teşvik etmek için uygulanmış...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor at JoVE.com

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

real-time-monitoring-intracellular-bile-acid-dynamics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K Görüntüleme.  Academic Medical Center. We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types. 

Video: Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Multiplexed Transdermal Elektrokimyasal Algılama Hollow microneedle tabanlı Sensör

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Biyomühendislik

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

Genetiği Kodlanmış Sensörleri kullanarak glutamin Akı Görüntüleme

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Yüksek Yoğunluk Gerçek zamanlı izleme Ultrason (HIFU) Ablasyonu Odaklı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Odaklı Ultrason Harmonik Hareket Görüntüleme kullanma Köpek karaciğerler (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing termini of oligo- and polysaccharides, as well as its unique chemical characteristics, sialic acid is involved in a multitude of different receptor-ligand interactions. By modifying the expression of sialic acid on the cell surface, sialic acid-dependent interactions will consequently be influenced. This can be helpful to investigate sialic acid-dependent interactions and has the potential to influence certain diseases in a beneficial way. Via metabolic glycoengineering (MGE), the expression of sialic acid on the cell surface can be modulated. Herein, cells, tissues, or even entire animals are treated with C2-modified derivatives of N-acetylmannosamine (ManNAc). These amino sugars act as sialic acid precursor molecules and therefore are metabolized to the corresponding sialic acid species and expressed on glycoconjugates. Applying this method produces intriguing effects on various biological processes. For example, it can drastically reduce&#160;the expression of polysialic acid (polySia) in treated neuronal cells and thus affects neuronal growth and differentiation. Here, we show the chemical synthesis of two of the most common C2-modified N-acylmannosamine derivatives, N-propionylmannosamine (ManNProp) as well as N-butanoylmannosamine (ManNBut), and further show how these non-natural amino sugars can be applied in cell culture experiments. The expression of modified sialic acid species is quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and further analyzed via mass spectrometry. The effects on polysialic acid expression are elucidated via Western blot using a commercially available polysialic acid antibody.

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid is a typical monosaccharide-unit found in glycoconjugates. It is involved in a plethora of molecular and cellular interactions. Here we present a method to modify cell surface sialic acid expression using metabolic glycoengineering with N-acetylmannosamine derivatives.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...