Bu protokol, aday genlerin moleküler evrimini ve ekspresyonunun araştırılması için biyoinformatik adımları özetlemektedir. Burada, en az biyoinformatik deneyime sahip herkesin bu protokolden geçebilmesi için kapsamlı talimatlar sunuyoruz. Bu boru hattı herhangi bir organizmaya ve herhangi bir gen ailesine uygulanabilir.
Biyoinformatik yaparken sık karşılaşılan bir sorun kabuk komut dosyalarının başarısız olmasıdır. Bu protokolü denerken, en güncel yazılıma sahip olduğunuzdan emin olun, hata dosyalarını okuyun ve kılavuzu dikkatlice kontrol edin. Başlamak için, terminal veya PuTTY uygulama penceresinde bilgisayar kümesi hesabında oturum açın.
Terminalde, Wget kullanarak SRA Toolkit sürüm 2.8.1'i indirin, ardından programı yüklemeyi bitirin. İstenen örnekler için SRA katılım numarasını NCBI'de arayın, ardından terminal penceresinde RNA sıra verilerini alın. Eşleştirilmiş uç dosya türü için iki FASTQ dosyası edinin.
Varsa, referans genomun çevrimiçi olduğunu bulun. Başvuru derlemesi elde etmek için, terminal penceresine wget yazın ve bağlantı adresini yapıştırın. Varsa, referans genom için GTF dosyasını ve protein FASTA dosyasını da kopyalayın.
Genom dizin, sonra harita okur ve her örnek için ifade hesaplamak. Sonuç dosyasını açıklayıcı bir şeyle yeniden adlandırın ve tüm sayımların matrisini oluşturun. Bir internet tarayıcısı penceresi açın ve NCBI GenBank'a gidin.
Arama çubuğuna, ilgi geninin adını ve sıralanmış yakından ilişkili türlerin adını yazın. Arama çubuğunun solunda Protein'i seçin ve Ara'yı tıklatın. Gönder'i tıklatıp Dosya'yı seçerek sıraları ayıklayın.
Biçim'in altında FASTA'yı seçin ve Dosya Oluştur'u tıklatın. Yerel bir terminal penceresi veya FileZilla kullanarak FASTA homologues dosyasını bilgisayar kümesine taşıyın. Daha sonra, BLAST +Bilgisayar kümesinde kullanarak aday genleri arayın, genomdan veya transkriptom çevrilmiş protein FASTA'dan bir BLAST veritabanı yapın.
NCBI'den ilgi çekici türlerin veritabanına homolog gen dizilerini BLAST, ardından komutu daha fazla kullanarak çıktı dosyasını görüntüleyin. İlgi çekici türlerden benzersiz gen kimliklerini yeni bir metin dosyasına kopyalayın. Aday genlerin dizilerini çıkarın.
Karşılıklı BLAST kullanarak gen ek açıklamalarını onaylamak için BLAST Yerel Hizalama Arama Aracı'na gidin, BLASTP'yi seçin, sonra aday dizilerini yapıştırın, yedekli olmayan protein dizisi veritabanını seçin ve BLAST'ı tıklatın. MEGA'yı açın, Hizala'ya tıklayın, sonra Yapı Hizalamasını Düzenle'ye tıklayın, Yeni hizalama oluştur'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Protein'i seçin. Hizalama penceresi açıldığında Düzenle'yi tıklatın.
Dosyadan Dizi Ekle'ye tıklayın ve aday genlerin protein dizileri ve olası homologlarla FASTA'yı seçin. Tüm sıralar'ı seçin. Kol sembolünü bulun ve üzerine gelin.
Kas algoritması kullanarak dizileri hizala demeli. Kol sembolüne tıklayın ve sonra dizileri hizalamak için Proteini Hizala'yı tıklatın Parametreleri düzenle veya varsayılan parametreleri kullanmak için Tamam'ı tıklatın. Bu protokol, phylum Cnidaria'ya ait bir tatlı su omurgasızı olan Hydra vulgaris dokularına uygulanmıştır.
Opsin genleri, hayvanlarda gözlerin evrimi ve ışık tespiti hakkında fikir edinmek için araştırıldı. H.vulgaris ve diğer türlerin opsin ile ilgili genleri için diziler NCBI GenBank'tan bir FASTA dosyasına çıkarıldı. Opsin genleri MEGA'da hizalandı, bu da ışığa duyarlı bir molekülü bağlamak için gerekli korunmuş bir lizin amino asidi eksik olan Hydra opsinlerini tanımlamayı mümkün hale getirdi.
Hydra vulgaris ve diğer türlerden opsin dizileri kullanılarak maksimum olasılıklı bir ağaç oluşturuldu. Filogeneni, opsin genlerinin cnidarians'ta soyuna özgü tekrarlarla ve potansiyel olarak H.vulgaris'te tandem çoğaltma ile geliştiğini göstermektedir. Daha sonra, opsin genlerinin mutlak ekspresyonunun araştırılması için edgeR'de diferansiyel ekspresyon analizi yapıldı.
Hipostome veya kafada bir veya daha fazla opsin'in yukarı doğru düzenlenip düzenlenmediğini belirlemek için, hipostom ile vücut kolonu, tomurcuklanma bölgesi, ayak ve dokunaçların çift yönlü karşılaştırmaları yapıldı. 1.774 transkriptin hipostom ve vücut sütunu arasında farklı şekilde ifade edildiği bulunmuştur. Birden fazla karşılaştırmada yukarı yönlü olarak düzenlenen genler belirlendi ve Blast2GO'da fonksiyonel bir zenginleştirme yapıldı.
Son olarak, opsin genlerinin mutlak ekspresyosu, tomurcuklanmanın farklı aşamalarında ve farklı rejenerasyon zaman noktalarında farklı dokularda araştırılmıştır. Hizalama ve ağacın görsel incelemesi, aday genlerin ilgi ailesine ait olup olmadığını doğrulayacaktır. Sırayla çok farklı olan genler veya her şeyin dışında bir grup, muhtemelen farklı bir gen ailesinin parçasıdır.
Bu protokolden elde edilen sonuçlar hipotez üreten olarak kabul edilebilir. Bu boru hattı, gelecekteki çalışmalarda işlevsel olarak çalışmak için aday genleri vurgulayabilir. Hydra opsin ekspresyonunu keşfettikten sonra, şimdi benzer teknikleri kullanarak türler arasındaki ilgili genleri araştırıyoruz.
