Bu protokolde, iki bölümden içeren bir yordamı tanımlıyoruz. İlk olarak, temas inhibisyonu ile in vitro bir monolayer 2D keratinosit diferansiyasyon yöntemi. İkincisi, RNA-seq ile moleküler karakterizasyonu.
2D in vitro diferansiyasyon yöntemi basit ve kolay bir şekilde gerçekleştirilir. Özellikle çok sayıda hücre gerektiğinde epidermal farklılaşmayı incelemek için kullanılabilir. Örneğin, epigenomik analizde.
Ayrıntılı RNA-seq analiz boru hattı, temel biyoinformatik becerileri olan araştırmacılar için açık ve şeffaftır ve herhangi bir toplu RNA-seq analizi için kullanılabilir. Farklılaşma protokolünü ilk kez gerçekleştirirken, tohumlama yoğunluğunun zor olabileceğini unutmayın. Hücre çizginizle hangisinin en iyi çalıştığını bulmak için birden fazla tohumlama yoğunluğudeneyin.
Keratinosit büyüme ortamı veya KGM ve 500 mililitre her bir proliferasyon orta ve farklılaşma orta el yazması talimatlara göre hazırlayarak başlayın. 5 ila 20, santimetre karebaşına 000 hücre yoğunluğunda tohum birincil keratinositler ve hücreleri kapsayacak kadar çoğalma ortamı ekleyin. Tohumlamadan iki gün sonra hücreleri çoğalma ortamı ile yenileyin.
Hücreleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin ve her gün ortamı yenileyin. Hücreler %90 biraraya geldiğinde, ortayı farklılaşma ortamına değiştirerek farklılaşmaya neden olur. Daha fazla RNA analizleri için hücreleri toplamak için, DPBS ile hücreleri iki kez yıkayın ve sonra lysis tampon ekleyin.
Farklılaşma gün sıfır, iki, dört ve yedi hücreleri toplamak. RNA izolasyonundan sonra çift iplikli cDNA dönüştürülecek ve yeni nesil sıralama için RNA-seq kütüphaneleri hazırlanacaktır. Sıralamanın ardından, sıra lar indirilecek ve insan genomuna eşlenecektir.
R paketlerini indirip yükledikten sonra readspergene.out'tan hesap tablosu oluşturun. sekme dosyaları ve tüm dosya adlarını içeren bir örnek veri dosyası yazmak, farklılaşma günü ve diğer ilgili örnek verileri. Bir örnek için ek kodlama dosyalarına bakın.
Daha sonra hem sayılabilir hem de örnek verileri içeren bir deseq2 nesnesi oluşturmak için sayım tablosunu ve örnek verileri kullanın. Gen ekspresyonu normalizasyonu için deseq2RLD veya VST normalleştirme yi kullanarak deseq2 nesnesindeki sayım tablosunu normalleştirin. RLD normalizasyonu tercih edilirken, VST normalizasyonu çok daha hızlıdır.
Normalleştirilmiş okuma sayısı yoğunluklarına göre örnek mesafesini çizmek için R'deki dist işlevini kullanın, ardından örnek uzaklığı temel alınarak hclust kümeleme gerçekleştirin. Ardından, ısı haritasını pheatmap işlevini kullanarak çizin. Son olarak, deseq2 plotPCA işlevini kullanarak normalleştirilmiş okuma sayısı yoğunluklarının bir ilke bileşeni analizi veya PCA arsa oluşturun.
PCA, araştırmacı veri analizinde bir araç olarak hizmet vermektedir ve farklı numuneler arasındaki mesafeyi ve bağlantıyı görselleştirmek için kullanılabilir. Farklı zaman noktalarından gelen örnekler arasındaki varyans üzerine sıralayarak ilk 500 son derece değişken geni ayıklayan rowVars fonksiyonu ile son derece değişken gen ekspresyonu analizi yapın. Bu genler, farklılaşma günlerinde normalleştirilmiş yoğunluklarının en yüksek standart sapmasına sahiptir.
Farklı ifade desenlerine göre kümelemek için çok değişken genler üzerinde kümeleme k-anlamına gelir gerçekleştirin. Pheatmap paketi ile bir ısı haritası nda genleri görselleştirin. Isı haritasında çizilen yoğunluk, ortanca değeri çıkarılmış deseq2 normalleştirilmiş yoğunluk.
Tek bir örnekte 10'dan fazla sayı içeren tüm genleri içeren ifade edilmiş arka plan genlerinin bir listesini oluşturun ve her kümeden genlerle bir liste yapın. Son olarak, GOrilla kullanarak Gen Ontoloji analizi gerçekleştirin. Arka plan gen listesini arka plan kümesi olarak ve hedef kümeler halinde ki yüksek değişken genlerin listesini hedef küme olarak kullanın, ardından arama zenginleştirilmiş GO terimlerine tıklayın.
Alternatif olarak, daha gelişmiş R kullanıcıları GO terim zenginleştirme analizini otomatikleştirmek için paket clusterProfiler'ı kullanabilir. RNA-seq analizlerinde farklılaşma için beş kişiden elde edilen keratinosit çizgileri kullanılmıştır. Ana bileşen analizi, farklılaşma geçiren keratinositlerin bağlı ancak farklı genel gen ekspresyonu profilleri olduğunu göstermiştir.
Çok değişken genler farklılaşma sırasında gen ekspresyonu dinamiklerini ve desenlerini görselleştirmek için kümelenmiştir. Genlerin her kümesi keratinosit farklılaştırma özelliği genleri ile temsil edildi ve Gen Ontoloji ek gösterimi gen fonksiyonlarında açık bir fark gösterdi. İkinci deneyde ise sağlıklı kontrollerden alınan keratinositler ile P63 mutasyonu taşıyan hastalardan elde edilen hücre hatları arasında hücre morfolojisi ve gen ekspresyonu farklılıkları karşılaştırıldı.
Ana bileşen analizi, kontrol hücre hatlarının açıkça bir farklılaşma deseni izlediğini, ancak farklılaşma sırasında mutant hücrelerin gen ekspresyonu deseni büyük ölçüde çoğalan veya farklılaşmamış hücrelere benzer olduğunu göstermiştir. Kümeleme analizinde, küme 1'deki genler kontrol hücrelerinde alt regüle edildi ve R204W ve R279H mutasyonları taşıyan hasta hücrelerinde kısmen indirgendi, ancak R304W taşıyan hücrelerde yüksek kaldı. Bu genler büyük olasılıkla Gene Ontoloji analizinde gösterildiği gibi hücre çoğalmasında rol oynamaktadır.
Küme iki gen ilk tanıtıldı ve daha sonra kontrol hücrelerinde downregulated. Epidermal farklılaşma ve keratinizasyon fonksiyonları bu küme için yüksek zenginleştirilmiş olarak bu genler büyük olasılıkla keratinosit farklılaşma dahil. Küme üçdeki genler sadece kontrol hücrelerinde farklılaşma sonunda indüklendi ler ve bu da epidermisin en dış tabakasında rol oynayabileceklerini gösteriyor.
RNA-seq verilerini analiz ederken, ne beklemesi gerektiğini önceden bilmek önemlidir. Bu hem kalite kontrolü ve PCA arsa yorumlama ve sonuçları mantıklı olup olmadığını değerlendirmede size yardımcı olacaktır. Yöntemlerimiz hem epidermal biyolojide hem de diğer biyolojik sistemlerde gen transkripsiyonlarını incelemek için kullanılabilir.
