AG laboratuvarı İspanya Nükleer Güvenlik Konseyi tarafından finanse edilmektedir. T.A. ve A.G. Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503) tarafından tanınan bir araştırma grubunun üyeleridir. MT Bilimsel Vakfı Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR] tarafından finanse edilen bir sözleşme tutar. G.F. sözleşmesi Cellex Vakfı'nın hibesi ile finanse edilmektedir.

Aşağıdaki deneylerde kullanılan insan örnekleri clínica Pilar Sant Jordi 'de (Barselona) standart prosedür onayı altında yapılan mammoplastilerden elde edilmiştir. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini'nde gerçekleştirilir.
1. İnsan meme epitel hücrelerinin in vitro kültür ve büyüme eğrisi arsa birikimi
<ol><li>
Meme primer epitel hücrelerinin in vitro kültürü (BPEP): hücre geçişi NOT: BPEC türetme ve hücre kültürü için Ince ve ark., 20076tarafından açıklanan talimatları izleyin.<ol>
<li>Orta hazırlık.<ol>
<li>Ek WIT bazal P veya T takviyeleri ile tanımlanan orta, üretici tarafından sağlanan, birincil veya dönüştürülmüş BPECs kültürlü olup olmadığına bağlı olarak.</li>
			<li>Takviye WIT ortamına, birincil veya dönüştürülmüş BPEC'ler için 25 ng/mL için 100 ng/mL'lik son konsantrasyona kolera toksini ekleyin. DİkKAT: Kolera toksini yutulursa ölümcüldür. Kişisel koruyucu ekipman kullanın. Çevreye salınmasından kaçının.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hücre kültürü bakımı ve geçişi. NOT: Aşağıdaki adımlar için hücrelerin bir T25 şişesinde büyüdüğünü unutmayın. Bununla birlikte, hacimler yüzey alanı açısından orantılılığı koruyan diğer hücre kültürü biçimlerine uyarlanabilir.<ol>
<li>Her gün hücre birleşimini kontrol edin. Kültür %90'ı dindiğinde, hücre geçişini gerçekleştirin.</li>
			<li>Her şişe için 1x PBS, 3x tripsin, orta ve 2 mL Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren 15 mL konik tüp elde edin.</li>
			<li>Ortamı şişeden çıkarın ve FBS içeren 15 mL konik tüpte saklayın.</li>
			<li>Hücreleri 1x PBS ile durula.</li>
			<li>1 mL 3x tripsin ekleyerek hücreleri yüzeyden ayırın. 37 °C'de 5 dk kuluçka.</li>
			<li>Hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin. Hücreler tamamen ayrılmış değilse güçlü sallayarak uygulayın.</li>
			<li>FBS ile desteklenen ayrılmış ortamı ekleyerek trypsin'i inaktive edin.</li>
			<li>Hücresel süspansiyonu hasat edin ve 15 mL konik tüpe yerleştirin.</li>
			<li>5 dk için 500 x g santrifüj, supernatant ortadan kaldırmak ve bir parmak ile tüp alt flicking tarafından peletli hücreleri yeniden askıya.</li>
			<li>Pelete 1-2 mL taze ortam ekleyin ve otomatik hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu ölçün. Bu veriler daha sonra popülasyon iki katına hesaplamak ve büyüme eğrisi çizmek için kullanılacaktır. Değiştirilmiş hücre kültürü yüzey şişelerinde 12.000 hücre/cm2 (örneğin, bir T25 şişesi için 300.000 hücre) (Bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Konsantrasyon uygun nicelleştirme sağlamak için çok yüksek ise hücre süspansiyon çözeltisi seyreltin.</li>
			<li>5 mL'lik son hacme orta ekleyin ve hücreleri 37 °C ve %5 CO2 atmosferinde kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Her 48 saatte bir hücre kültür ortamını değiştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Popülasyon katlama hesaplama ve veri görselleştirme
	<ol>
<li>1.1.2.10 adımında elde edilen hücre sayısı verilerini kullanarak, birikmiş popülasyon ikikatına (PH) değerleri elde etmek için aşağıdaki formülü uygulayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ01.jpg"> Nerede, PDi önceki alt kültüre kadar hücreler tarafından elde edilen popülasyon ikikatına sayısını gösterir (önceki alt kültürde biriken PD anlamına gelir), Nh hasat edilen hücrelerin sayısı dır ve Ns tohumlu hücrelerin sayısıdır.</li>
		<li>Kültürdeki gün sayısının(x-ekseni)ve birikmiş PD'nin(y-ekseni) temsil edildiği xy grafiğini kullanarak belirli bir zaman aralığı için verileri temsil eder.</li>
		<li>En uygun çizgiyi ve montaj denklemini alın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ02.jpg"> NOT: Artan eğim (b) artan çoğalma oranı anlamına gelir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bodrum membran matrisinde üç boyutlu (3D) kültür ve immünfloresan protein tespiti
<ol><li>Bazal membran matrisinde 3B kültür NOT: Bu protokol Debnath vd., 200310'dan uyarlanmıştır ve 24 kuyu plakası için optimize edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>Deneyden bir gün önce malzemeyi hazırlayın: 4 °C'de bir gecede soğutun ve pipet uçları, mikrosantrifüj tüpleri ve kuyu tabaklarının dondurucuda soğumasını bekleyin. NOT: Matris uzun süreli depolama için -20 °C'de tutulmalıdır. Birden çok donma-çözülme döngüleri önlemek için aliquots olun.</li>
		<li>Deney günü, önceden soğutulmuş malzemeyi buzüzerine yerleştirin.</li>
		<li>Yüzey gerilimini azaltmak için kuyuları soğuk steril 1x PBS ile durula.</li>
		<li>Her kuyunun altını 100 μL'lik bodrum membran matrisi ile kapatın. NOT: Matrisi yavaşça dağıtın ve kuyuya yaydı; tek katmanlı hücre kültürünün büyümesini önlemek için alt tabakada kabarcık oluşumunu önlemek için çok önemlidir.</li>
		<li>Matris tabakasının katılaması için plakayı 37 °C'de kuvöze yerleştirin. NOT: Genellikle katılaşmak için yaklaşık 20 dakika sürer.</li>
		<li>Bu arada, daha önce adım 1.1'de açıklandığı gibi hücreleri trypsinize. 5 dk için 500 x g hücreleri santrifüj ve orta resuspend. 400.000 hücre/mL süspansiyon hazırlayın ve boru lama ile herhangi bir hücre yığınını nazikçe ayrıştırın.</li>
		<li>Orta yı %8'lik bazal membran matrisi ile hazırlayın ve %4 matriste 200.000 hücre/mL çözeltisi elde etmek için 1:1 (v/v) hücresel süspansiyonla karıştırın. NOT: Matris gereksiz atıkları önlemek için gereken ortam miktarını hesaplayın.</li>
		<li>Matris çözeltisine 500 μL'lik hücre süspansiyonunu yerleştirin ve toplam 100.000 hücreyi %4'lük bazal membran matrisi ile orta alanda tohumlayın.</li>
		<li>Hücreleri 37 °C'de birkaç dakika kuluçkaya yatırın ve ardından %4'lük bazal membran matrisi ile ortamın 500°L'sini ekleyin. Hücreleri 37 °C'de bir kuvözde %5 CO2 ile 14 gün kuluçkaya yatırın. Tohumlu hücreler, acinibenzeri yapılardan kaynaklanacak şekilde gruplanır ve çoğalır. NOT: Hücre hareketliliği ve agregasyonu 3B oluşum işlemi sırasında zaman atlamalı olarak izlenebilir. Bu olayları değerlendirmek için görüntü analizi yazılımLarını (örneğin, Fiji/ImageJ veya Imaris) kullanın. Acini sayısı ve boyutu toplama sürecine ve çoğalma hızına bağlıdır ve hücre tipleri arasında değişebilir. İstenilen 3D yapıları elde etmek için temel membran matris konsantrasyonu ve tohumlu hücreleri ayarlayın.</li>
		<li>Haftada 2-3 kez% 4 bodrum membran matris ile orta 500 μL ekleyin. NOT: Manipülasyon sırasında plakayı hafifçe taşıyan tabakaların bozulmasını önleyin.</li>
		<li>İstenirse, acini sayısı ve boyutu kültür döneminde ölçülebilir. Bunu yapmak için, faz kontrastı veya DIC ters mikroskobu kullanarak tohumlamadan sonra farklı zamanlarda rastgele fotoğraflar çekin. 100-200 3B yapıların çapını ölçmek için görüntü analizi yazılımını kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>İmmünoboyama NOT: Protokolün bu bölümünde steril koşullar aranmaz.<ol>
<li>Kültür ortamını kaldırın.</li>
		<li>Bodrum membran matrisini p200 pipet ucunu kullanarak, ucu kesilmiş olarak yırtın. Bir cam kaydırak üstüne ~ 50 μL disaggregated matris yerleştirin ve1-2cm 2 bir alana smear .</li>
		<li>Numunenin oda sıcaklığında tamamen kurumasını veya işlemi hızlandırmak için 37 °C'de Bir ısıtma plakası kullanmasına izin verin. 30 dakika boyunca -20 °C'de metanol:aseton (1:1, v/v) ile numuneleri düzeltin. NOT: Hücreler tarafından ifade edilen floresan proteinler gibi önceki belirteçlerin floresan sinyali silinir. DİkKAT: Metanol yanıcıdır, solunduğunda, yutulduğunda veya deriyle temas ederse toksiktir. Kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir duman başlık içinde çalışmak.</li>
		<li>Fiksasyon çözümlerini atın ve varsa fazlalığı filtre kağıdına kaydırarak çıkarın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Kurutuldıktan sonra, slaytlar -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.</li>
		<li>Blok örnekleri epitops % 5 normal keçi serumu ve % 0.1 triton-X-100 1x PBS (bloklama çözeltisi) oda sıcaklığında 2 saat.</li>
		<li>Bu arada, bloklama çözeltisinde istenilen konsantrasyonda birincil veya ikincil antikorları seyrelterek antikorların çalışma çözümlerini hazırlayın. NOT: Antikor konsantrasyonu hücre tipine ve antikor referansına bağlı olarak doğru bir şekilde ayarlanmalıdır. Kılavuz olarak, BPEC'teki luminal ve miyoepitelyal soylardan hücreleri tanımlamak için primer anti-Sitokeratin 14 ve anti-Claudin-IV antikorları (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılabilir. Önerilen çalışma çözeltisi konsantrasyonu bu birincil antikorlar için 1:100 ve anti-Fare ve anti-Rabbit ikincil antikorlar için 1:500'dür (bkz.</li>
		<li>30 μL primer antikorlar çözeltisi ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için bir laboratuvar sarma filmi şeridi ile kaplayın. Nemli bir odada 4 °C'de bir gece kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Her biri 1 saat için 1x PBS ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>İkincil antikorlar için adım 2.2.7'yi tekrarlayın. Kuluçka karanlıkta yapılmalıdır.</li>
		<li>2 saat boyunca 1x PBS ile yıkayın. NOT: Belirli numuneler için sinyal/gürültü oranını artırmak için antikor konsantrasyonunu, kuluçka süresini ve yıkama sertliğini ayarlayın.</li>
		<li>Kalan PBS'yi çıkarın ve kurutuldıktan sonra, antifade montaj ortamında seyreltilmiş 0,25 g/mL'de DAPI ile karşı lekesi kurutun. Basınç uygulamadan yerleşmesine izin vererek slaytları bir kapak kayma ile kapatın. Ojeli fok. NOT: Numuneler 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir. Uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Konfokal mikroskop kullanarak her akok için floresan sinyal dağılımını analiz edin. NOT: Konfokal mikroskop konfigürasyonu, kullanılan ekipmana ve numuneye uygulanan antikorlara bağlı olarak doğru bir şekilde belirlenmelidir. Kılavuz olarak, Malzeme Tablosu'ndaayrıntılı olarak yer alan ekipman ve reaktiflerle 40x objektif ve aşağıdaki lazer ve dedektör ayarlarını kullanın: DAPI için 405 lazer (%3-5) ile uyarma, PMT dedektörü (800V, Ofset: -9) ve 410 nm'den 500 nm'ye kadar spektral bant ile algılama; A488 (Claudin-IV) için 488 lazer (%7-%10) ile uyarma kullanımı, PMT dedektörü (800V, Ofset: -20) ve 490 nm'den 550 nm'ye kadar bir spektral bant; ve Cy3 (Cytokeratin 14) için 555 lazer (%2-10) ile uyarma, PMT dedektörü (800V, Ofset: -35) ve 560 nm'den 600 nm'ye kadar bir spektral bant ile algılama.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ankrajbağımsız test, MTT boyama ve otomatik koloni nicelleştirme
<ol><li>Anchorage-bağımsız töz: agar ve hücresel süspansiyon kaplama NOT: Protokol Borowicz ve ark., 201411'den BPEC'lerde deneyler yapmak üzere uyarlanmıştır.<ol>
<li>Steril bir şişede ultra saf suda seyreltilmiş %1,2 agar çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi otomatik olarak tökezle ve deney sırasında 42 °C'de muhafaza edin. Agar çözeltisi 4 °C'de saklanabilir; gerektiğinde, agar çözeltisini tekrar sıvı hale gelene kadar ısıtın. DİkKAT: Otoklav dan sonra yanmayı önlemek için ısıya dayanıklı eldivenler kullanın. NOT: Bundan sonra steril koşullar korunmalıdır.</li>
		<li>1:1 (v/v) komple önceden ısıtılmış orta ve %1,2 agar çözeltisini karıştırarak %0,6 agar çözeltisi hazırlayın. Erken katılaşmayı önlemek için 42 °C'de koruyun. NOT: Orta daha önce tam olarak tamamlanmış% 0.6 agar + orta çözelti bir kez karışık elde etmek için çift takviye edilebilir.</li>
		<li>Orta çözeltide %0,6 agar ile 35 mm'lik bir kuyunun altını kapatın ve oda sıcaklığında katılamasına izin verin. Agar katılaşmaönce plakanın alt tamamen kaplı olduğundan emin olun, aksi takdirde, hücreler plaka yapışabilir ve monolayer büyüyebilir. NOT: Yapışık ve yapışmaz yüzey plakaları kullanılabilir.</li>
		<li>Bu arada, trypsine hücreleri ve, bir kez santrifüj ve orta yeniden askıya, bir 50.000 hücre / ml çözelti hazırlamak ve yavaşça tekrar tekrar borulama tarafından herhangi bir hücre kümeleri ayrıştırmak.</li>
		<li>25.000 hücre/mL nihai konsantrasyonda ortamda %0,3 agar + hücre süspansiyonu hazırlayın. NOT: Optimal hücre konsantrasyonu hücre tipleri arasında farklılık gösterebilir. Bireyselleştirilmiş koloniler oluşana kadar farklı konsantrasyonları deneyin.<ol>
<li>50 mL steril bir tüpün üzerine 40 m'lik bir süzgeç filtresi yerleştirin ve 50.000 hücre/mL çözeltisini filtreleyin ve tüpün dibine düşmesini sağlayan bir filtre uygulayın.</li>
			<li>Filtreyi 50 mL steril tüpten çıkarın, hücre içeren tüpü 45° açıya doğru yatırın ve tüpün iç duvarından dökülen %0,6 agar + orta çözeltihacmini bırakın. Bu, agar çözeltisinin hücrelere zarar vermemek ve erken katılaşmasını önlemek için yeterli derecede soğumasını sağlayacaktır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Karışımı homojenize ve mevduat 1 mL 0.3% agar + hücre süspansiyon orta (içeren 25.000 hücreleri) daha önce katılaşmış alt agar tabakasının üstüne.</li>
		<li>Hücrelerin bireyselleştirdiğinden emin olmak için ters bir mikroskop kullanarak tohumlu hücreleri görselleştirin. Aksi takdirde, deneme tekrarlanmalıdır.</li>
		<li>Agar tabakası tamamen katılaşmış kadar bekleyin, sonra dikkatle altında hassas agar katmanları rahatsız etmeden üstüne taze orta 1 mL ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri 3 7 °C ve %5 CO2'de bir kuvözde 3 hafta kuluçkaya yatırın. NOT: Koloni oluşumu için gereken süre farklı hücre tipleri arasında değişebilir, ancak genellikle 3 hafta yeterlidir.</li>
		<li>Haftada iki kez orta değiştirin. Bunu yapmak için, yavaşça size doğru plaka yatırın, alt köşesinde orta aspire, ve taze orta 1 mL ekleyin. NOT: Agar katmanlarına dokunmaktan kaçının, çünkü plakadan kolayca kopabilirler.</li>
	</ol></li>
	<li>MTT boyama
	<ol>
<li>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromür (MTT) stok çözeltisini steril bir şişede ultra saf suda 6 mg/mL'de hazırlayın ve 0,2 μm filtreler kullanarak filtre çözeltisi hazırlayın. Bu MTT çözeltisi -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir. DİkKAT: MTT tahrişe neden olabilir ve genetik bozukluklara neden olduğundan şüpheleniliyor. Güvenlik gözlüğü, eldiven ve solunum filtresi kullanın. NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının.</li>
		<li>Stok çözeltisini steril ultrasaf su ile seyrelterek 1 mg/mL'de MTT'nin çalışma çözeltisini hazırlayın.</li>
		<li>Koloni oluşum süresi sona erdikten sonra, ortayı plakadan çıkarın ve her kuyuya 1 mg/mL MTT 1 mL ekleyin.</li>
		<li>Kuluçka makinesinde 24 saat kuluçka. MTT çözümlerini hafifçe azarlayarak çıkarın. Plakalar 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir. NOT: Spesifik olmayan kristal oluşumunu önlemek için ışığa maruz kalmaktan kaçının.</li>
	</ol></li>
	<li>Koloni nicelleştirme
	<ol>
<li>Ters bir mikroskop kullanarak her plakanın görüntülerini alın. Daha az görüntüyle maksimum görüş alanını elde etmek ve hala küçük kolonileri (genellikle 4x veya 10x hedefleri) algılayabilmek için büyütmeyi ayarlayın. NOT: Görüntülerin homojen bir arka plan olduğundan emin olun. Lekeli olmayan koloniler sayısallaştırılamayacağından ne faz-kontrast ne de diferansiyel girişim kontrastı gerekmez.</li>
		<li>Koloni sayısını ve her MTT pozitif koloninin alanını saymak için ImageJ/Fiji yazılımı12'ye resim yükleyin. NOT: Otomatik niceleme için bir komut dosyası Ek Dosyaolarak sağlanır. Kodu yürütmek için makro düzenleyiciye yapıştırın (Eklentiler | Yeni | Makro) ve yönergeleri izleyin.<ol>
<li>Orijinal görüntüyü eşleyerek ikili maske elde edin (Resim | | ayarlama Eşik) iyi sınırlı koloniler elde etmek için (Şekil 1). NOT: Bu adımı gerçekleştirmek için genellikle 8 veya 16 bit lik görüntüler gereklidir. "Minimum eşik" yöntemi önerilir.</li>
			<li>Biovoxxel plugin13 'den Genişletilmiş Parçacık Analizörü çalıştırın (Eklentiler | BioVoxxel | Genişletilmiş Parçacık Çözümleyicisi) MTT pozitif kolonileri tanımlamak için(Şekil 2). İlk rehberlik koşulları: Boyut (μm2) = 250–Sonsuzluk; Sağlamlık = 0.75-1.00.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Formüle göre her koloni alanı değerinden (A) ortalama çapı (D) tahmin edin: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ03.jpg">
</li>
		<li>Düşük proliferatif kolonileri (örn. düşük çap) dışlayarak filtre sonuçları.<ol>
<li>Değerlendirilmek üzere haftada en az sayıda bölüm(m)seçin (örn. 1).</li>
			<li>Aşağıdaki formüle göre n hücreleri ile bir koloninin(R)yarıçapını tahmin edin: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ04.jpg"> Nerede, r süspansiyon bireysel hücrelerin ortalama yarıçapı, n kültürde w hafta boyunca her hafta m bölünmeleri acı bir koloni oluşturan hücrelerin sayısıdır. Üstel büyümede: n = 2(m*w). ρ Ambalaj verimliliğidir. Rasgele hareket halinde, ambalaj verimliliği ~ 0,64 ve aynı küreler için en yoğun olası ambalaj fraksiyonu 0,7414olduğunu unutmayın.</li>
			<li>Hücreleri adım 3.3.4.1'de kabul edilen en az bölünme sayısını elde etmemiş olduğundan, çapı 2R'dan daha düşük olan tüm kolonileri atın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Stampfer, M. R., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+models+of+human+mammary+epithelial+cell+transformation.">Culture models of human mammary epithelial cell transformation.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).</li><li>Schinzel, A. C., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+transformation+and+experimental+models+of+human+cancer.">Oncogenic transformation and experimental models of human cancer.</a> Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).</li><li>Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+process+of+human+tumorigenesis.">Modeling the process of human tumorigenesis.</a> Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).</li><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Ince, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+different+human+breast+epithelial+cell+types+leads+to+distinct+tumor+phenotypes.">Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes.</a> Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).</li><li>Repull&#233;s, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+malignant+transformation+of+preneoplastic+and+normal+breast+primary+epithelial+cells.">Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells.</a> Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soft+agar+colony+formation+assay.">The soft agar colony formation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brocher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BioVoxxel+Image+Processing+and+Analysis+Toolbox.">The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox.</a> European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).</li><li>Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+random+close+packing+of+spheres+well+defined.">Is random close packing of spheres well defined.</a> Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture.">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+promote+transition+of+ductal+carcinoma+in+situ+to+invasive+ductal+carcinoma+by+inducing+myoepithelial+cell+apoptosis.">Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede açıklanan deneysel protokoller in vitro kültür hücrelerinin onkojenik dönüşümünü değerlendirmek için yararlı araçlar sağlar. Her teknik dönüşüm sürecinin belirli yönlerini değerlendirir ve bu nedenle tek bir analizden sonuç çıkarken özel dikkat edilmelidir. Büyüme eğrileri birikme başka amaçlar için hücreleri biriktirme zaman zaten mevcut bilgi gerektiren bir yaklaşımdır. Bu, bu tekniği diğer hücre çoğalma tahlillerine göre daha ucuz ve daha kolay uygulanmasını sa?...

Neoplazm gelişimi için birden fazla ardışık olay gereklidir. 2011 yılında Hanahan ve Weinberg dönüştürülmüş hücrelerin büyümesini, hayatta kalmalarını ve yayılmasını sağlayan 10 yeteneği tanımladı: sözde "Kanser Damgaları"1. Burada açıklanan metodoloji, tümör hücrelerinin ayırt edici özelliklerinden bazılarına odaklanarak in vitro hücresel dönüşümü değerlendirmek için üç farklı araç derlemektedir. Bu teknikler hücre çoğalma oranını, 3Boyutlu kültüredildiğinde hücrelerin davranışlarını ve ankraj bağımsızlığı olan koloniler oluşturma kapasitelerini değerlendirir.
Hücre modelleri in in vitro hipotezi test etmek için çok önemlidir. Farklı yaklaşımlar kanser çalışması için hücresel dönüşüm deneysel modeller oluşturmak için geliştirilmiştir2,3,4. Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık görülen kanser olduğundan ve kadınlar arasında kanser ölümlerinin yaklaşık% 15 sorumludur5, meme epitel hücrelerinin uygun hücresel modeller sağlayan daha fazla araştırma için son derece önemlidir. Bu makalede, biz meme primer epitel hücreleri deneysel bir model kullanarak hücresel dönüşümü değerlendirmek için üç teknik potansiyelini resimli var (BPEPs) dönüşüm başlangıçta İnce ve meslektaşları tarafından açıklanan 20076 ve daha sonra bizimlaboratuvardauygulanan 7 . Bu deneysel model üç hedefli genin (SV40 Large T ve küçük t antijenleri burada Ttag, hTERTve HRASolarak anılacaktır) olmayan bpecs genomuna sıralı değişiklik dayanmaktadır. Ayrıca, BPEP'ler türev için kullanılan yöntem, meme bezi fizyolojik özelliklerinin bazılarını koruyan heterojen bir hücre kültürü ile sonuçlanan, luminal veya miyoepitelyal belirteçleri ile meme epitel hücrelerinin bakım yanadır.
Meme bezinde, süt üretiminden sorumlu olan luminal meme epitel hücreleri lümenin yakınında bulunurken, miyoepitelyal hücreler luminal hücrelerin etrafına atılır ve sütü nisine meme ucuna götüren kasılma hareketlerine dikkat eder. Bu hücre soyu arasında uygun organizasyonun kaybedilmesi, 3D hücre kültürlerinde farklı soy belirteçlerinin immünororesan saptanması sonrasında in vitro olarak değerlendirilebilen tümöral transformasyon8'in bir özelliğidir. Tümörhücrelerinin bir diğer önemli özelliği diğer hücrelere bağlanmadan ve hücre dışı matriks1'ebağlanmadan büyüme kapasiteleridir. Sağlıklı hücreler süspansiyon içinde büyümeye zorlandığında, anoikis \u2012 gibi mekanizmalar hücre dışı matris \u2012 ayrılmasına yanıt olarak indüklenen hücre ölümü türü9aktive edilir . Hücre ölümü kaçırma kanserin ayırt edici özelliklerinden biridir ve böylece, dönüştürülmüş hücreler anoikis inaktive ve çapa bağımsız bir şekilde hayatta yeteneğine sahiptir. Bu kapasite, yumuşak agar kullanılarak ankrajdan bağımsız bir teşp ile in vitro olarak değerlendirilebilir. Ayrıca, tümöral dokuların doğal bir özelliği, sadece süspansiyon tahlillerinde değil, aynı zamanda tek katmanlı yapışık kültürlerin büyüme hızını izleyerek, zaman içinde hücre sayısının artışını ölçerek in vitro koşullarda kolayca izlenebilen sürekli proliferatif sinyalizasyon kapasitesidir.
Tümörijenik potansiyeli test etmek için en iyi model murine modellerinde tümör hücrelerinin aşılanması ve yerinde tümör gelişiminin değerlendirilmesi olmasına rağmen, deneysel işlemlerde kullanılan hayvan sayısını mümkün olduğunca en aza indirmek önemlidir. Bu nedenle, in vitro dönüşümü değerlendirmek için uygun testlere sahip olmak en önemli önceliktir. Burada, hücresel dönüşüm modelleri ile çalışan laboratuvarların çoğunda kolayca uygulanabilen kısmen ve tamamen dönüştürülmüş meme epitel hücrelerinin tümörijenik potansiyelini değerlendirmek için bir dizi araç salıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>PLC91001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorfs</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451</td>
			<td>Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l Pipette tips w/o filter</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>20-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml glass bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>With cap, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;l Pipette tips w/ filter</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>LAB1000ULFNL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;l Pipette tips w/o filter</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>20-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>PLC91002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l Pipette tips w/ filter</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>FTR200-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>PLC91005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>211007</td>
			<td>Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>Used for anchorage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Claudin 4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>15104, RRID:AB_301650</td>
			<td>Working dilution 1:100, host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>9220, RRID:AB_307087</td>
			<td>Working dilution 1:100, host: mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>115-165-146, RRID:AB_2338690</td>
			<td>Working dilution 1:500, host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034, RRID:AB_2576217</td>
			<td>Working dilution 1:500, host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVoxxel Toolbox</td>
			<td></td>
			<td>RRID:SCR_015825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture 24-well Plate</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>PLC30024</td>
			<td>Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture 6-well Plate</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>PLC30006</td>
			<td>Used for anchorage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (37 &#186;C and 5 % CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11587522</td>
			<td>Mesh size: 40 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Used to image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Used to supplement cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Herasafe</td>
			<td>HAEREUS HS12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses</td>
			<td>Witeg Labortechnik GmbH</td>
			<td>4600122</td>
			<td>22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>Used to inactivate trypsine action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software (ImageJ)</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>RRID:SCR_002285</td>
			<td>Free download, no license needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11844782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S2000</td>
			<td>Used for immunofluorescence of 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Resistant Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for agar manipulation after autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater bath (37 &#186;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to temper solutions prior to cell subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater bath (42 &#186;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to keep agar warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for Matrigel dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used during Matrigel manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice-box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Optic Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>354234</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131091</td>
			<td>Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>p1000, p200 and p10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>RRID:SCR_016137</td>
			<td>Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Referred to as ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to seal samples after mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-999</td>
			<td>Used to cover antibody solution during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (w/o calcium &#38; magnesium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-056</td>
			<td>Sterile. Used for cell subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353808</td>
			<td>Used for BPEC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Automated Cell Counter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PHCC20060</td>
			<td>Alternatively, use an haemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to cut pipette tips and parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Used to filter MTT solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Store at -20 &#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used for immunofluorescence of 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 10X</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>X0930</td>
			<td>Dilute in PBS to obtain 3X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WIT-P-NC Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0051</td>
			<td>Used for primary BPEC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WIT-T Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0047</td>
			<td>Used for transformed BPEC culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro evaluation of oncogenic transformation in human mammary epithelial cells

Tümörigenez, hücrelerin düşmanca koşullar altında büyüme, hayatta kalma ve yayılmaya izin veren yetenekler edindiği çok aşamalı bir süreçtir. Farklı testler belirlemek ve kanserli hücrelerin bu işaretleri ölçmek için aramak; ancak, genellikle hücresel dönüşümün tek bir yönü üzerinde odaklanmak ve, aslında, birden fazla test onların uygun karakterizasyonu için gereklidir. Bu çalışmanın amacı, araştırmacılara hücresel dönüşümü geniş bir perspektiften değerlendirmek için bir dizi araç sağlamak ve böylece sağlam sonuçlar elde etmeyi mümkün kılmaktır.
Sürekli proliferatif sinyal aktivasyonu tümöral dokuların en önemli özelliğidir ve zaman içinde elde edilen popülasyon sayısı nın hesaplanmasıyla in vitro koşullarda kolayca izlenebilir. Ayrıca, 3D kültürlerde hücrelerin büyüme çevreleyen hücreler ile etkileşimsağlar, in vivo oluşur ne benzer. Bu, hücresel agregasyonun değerlendirilmesini ve farklı hücresel belirteçlerin immünororesan etiketlemesi ile birlikte tümöral dönüşümün bir diğer ilgili özelliği hakkında bilgi edinmesini sağlar: uygun organizasyonun kaybı. Dönüştürülmüş hücrelerin bir diğer dikkat çekici özelliği diğer hücrelere bağlanmadan ve hücre dışı matris, hangi ankraj tsay ile değerlendirilebilir olmadan büyümek için kapasiteleridir.
Hücre büyüme hızını değerlendirmek, 3Boyutlu kültürlerde hücre soyundan belirteçlerin immünororesan etiketlemesini gerçekleştirmek ve yumuşak agarlarda ankrajdan bağımsız hücre büyümesini test etmek için ayrıntılı deneysel prosedürler sağlanmaktadır. Bu metodolojiler meme kanserinde alaka nedeniyle Meme Primer Epitel Hücreleri (BPEC) için optimize edilsin; ancak, bazı ayarlamalardan sonra diğer hücre türlerine yordamlar uygulanabilir.

BpECs üç genetik elementin tanıtımı ile hücresel dönüşüm deneysel bir model onkojenik dönüşümtemsilisonuçlar üretmek için seçildi 6,7 (Şekil 3). Dönüştürülmeyen BPEC'ler(N),İnce vemeslektaşları tarafından açıklandığı gibi hastalıksız meme dokusundan 6 ve burada belirtilen protokolü takip ederek kültürlü olarak elde edilmiştir. STASIS üstesinden...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells at JoVE.com

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

in-vitro-evaluation-oncogenic-transformation-human-mammary-epithelial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

4.4K Görüntüleme.  Universitat Autònoma de Barcelona. Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

Video: In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Kanser Araştırmaları

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and manufacturing optimizations. One challenge for these development efforts, however, has been the establishment of in vitro assays that can robustly inform selection of the optimal CAR T cell products for in vivo therapeutic success. Standard in vitro tumor-lysis assays often fail to reflect the true antitumor potential of the CAR T cells due to the relatively short co-culture time and high T cell to tumor ratio. Here, we describe an in vitro co-culture method to evaluate CAR T cell recursive killing potential at high tumor cell loads. In this assay, long-term cytotoxic function and proliferative capacity of CAR T cells is examined in vitro over 7 days with additional tumor targets administered to the co-culture every other day. This assay can be coupled with profiling T cell activation, exhaustion and memory phenotypes. Using this assay, we have successfully distinguished the functional and phenotypic differences between CD4+ and CD8+ CAR T cells against glioblastoma (GBM) cells, reflecting their differential in vivo antitumor activity in orthotopic xenograft models. This method provides a facile approach to assess CAR T cell potency and to elucidate the functional variations across different CAR T cell products.

Here, we describe an in vitro co-culture method to recursively challenge tumor-targeted T cells, which allows for phenotypic and functional analysis of antitumor T cell activity.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary epithelium using transplantation techniques takes advantage of the hormonal environment provided by the adolescent rodent host. These studies are ideally suited to explore the impact of various biological manipulations on mammary gland development and dissect many aspects of mammary gland biology. A common, but limiting, feature is that transplanted epithelial cells are strongly influenced by the surrounding stroma and outcompeted by endogenous epithelium; to utilize native mammary tissue, the abdominal-inguinal white fat pad must be cleared to remove host mammary epithelium prior to the transplantation. A major obstacle when using the rat model organism is that clearing the developing mammary tree in post-weaned rats is not efficient. When transplanted into gland-free fat pads, donor epithelial cells can repopulate the cleared host fat pad and form a functional mammary gland. The interscapular fat pad is an alternative location for these grafts. A major advantage is that it lacks ductal structures yet provides the normal stroma that is necessary to promote epithelial outgrowth and is easily accessible in the rat. Another major advantage of this technique is that it is minimally invasive, because it eliminates the need to cauterize and remove the growing endogenous mammary tree. Additionally, the interscapular fat pad contains a medial blood vessel that can be used to separate sites for grafting. Because the endogenous glands remain intact, this technique can also be used for studies comparing the endogenous mammary gland to the transplanted gland. This paper describes the method of mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad of rats.

This article describes a transplantation method to graft donor rat mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of recipient animals. This method can be used to examine host and/or donor effects on mammary epithelium development and eliminates the need for pre-clearing, thereby extending the usefulness of this technique.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

Polianhidrit IL-1α Nanopartiküllerinin In vivo Antitümör Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro

Human RB is pediatric cancer, which is lethal if no treatment is administered. As RB originates from cone precursors, which is relatively rare in rodent models, meanwhile regarding the interspecies differences between humans and rodents, a disease model derived from humans is more beneficial for uncovering the mechanisms of human RB and seeking the targets of therapy. Herein, the protocol describes the generation of two gene-edited hESC lines with a biallelic RB1 point mutation (RB1Mut/Mut) and an RB1 knockout mutation (RB1-/-), respectively. During the process of retinal development, the formation of RB is observed. The RB cell lines are also established by segregating from the RB organoids. Altogether, by differentiating the gene-edited hESC lines into the retinal organoids using a 2D and 3D combined differentiation protocol, we have successfully reconstructed the human RB in a dish and identified its cone-precursor origin. It would provide a helpful disease model for observing the retinoblastoma genesis, proliferation, and growth as well as further developing novel therapeutic agents.

We describe a method for generating human retinoblastoma (RB) by introducing biallelic RB1 mutations in human embryonic stem cells (hESC). RB cell lines could also be successfully cultured using the isolated RB in a dish.

İnsan Retinoblastomunu In Vitro Yeniden İnşa Etmek

Human RB is pediatric cancer, which is lethal if no treatment is administered. As RB originates from cone precursors, which is relatively rare in rodent ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after propagation from primary tissue or stem cells. This method of organoid generation forgoes single-cell differentiation through multiple passages and instead uses differential centrifugation to isolate mammary epithelial organoids from mechanically and enzymatically dissociated tissues. This protocol provides a streamlined technique for rapidly producing small and large epithelial organoids from both mouse and human mammary tissue in addition to techniques for organoid embedding in collagen and basement extracellular matrix. Furthermore, instructions for in-gel fixation and immunofluorescent staining are provided for the purpose of visualizing organoid morphology and density. These methodologies are suitable for myriad downstream analyses, such as co-culturing with immune cells and ex vivo metastasis modeling via collagen invasion assay. These analyses serve to better elucidate cell-cell behavior and create a more complete understanding of interactions within the tumor microenvironment.

This protocol discusses an approach for generating epithelial organoids from primary normal and tumor mammary tissue through differential centrifugation. Furthermore, instructions are included for three-dimensional culturing as well as immunofluorescent imaging of embedded organoids.

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play a major role in mammary gland function and are the origin of most mammary tumors. Introducing genes of interest into mouse mammary epithelial cells is a critical step in evaluating gene function in epithelial cells and generating mouse mammary tumor models. This goal can be accomplished through the intraductal injection of a viral vector carrying the genes of interest into the mouse mammary ductal tree. The injected virus subsequently infects mammary epithelial cells, bringing in the genes of interest. The viral vector can be lentiviral, retroviral, adenoviral, or adenovirus-associated viral (AAV). This study demonstrates how a gene of interest is delivered into mammary epithelial cells through mouse mammary intraductal injection of a viral vector. A lentivirus carrying GFP is used to show stable expression of a delivered gene, and a retrovirus carrying Erbb2 (HER2/Neu) is used to demonstrate oncogene-induced atypical hyperplastic lesions and mammary tumors.

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

The present protocol describes intraductal injection of viral vectors via the teat to deliver genes of interest into the mammary epithelial cells.

İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...