Bu proje üzerine NIH / NCI hibe sayısı R00 CA127357 ve Kansas Üniversitesi Kanser Merkezi Endowment tarafından finanse edildi.

1. C57BL/6J fareler İzolasyon ve donör kollajen çıkarma <ol><li> Onaylanmış IACUC yöntemler kullanılarak, normal olgun kadın C57BL/6J fareler Kurban. </li><li> Kuyrukları Hasat ve dokuları sterilize etmek için 45 dakika boyunca% 70 etanol içinde bekletin. Kuru kağıt mendil ile kuyrukları, alüminyum folyo ile sarın. -20 ° C kadar gerekli kuyrukları saklayın. </li><li> Steril bir ortamda böyle bir laminer akış kaputu gibi kuyrukları yerleştirin. Makas kullanarak, kuyruk kökünde çatlatmaya ve soyma kuyruk uzakta. Kuyruk her iki ucunda 0,5-1 cm çıkarın ve üç ya da dört parçalar halinde kalan kuyruk bölmek. Kuyrukları tendonları inceleyin ve bir neşter veya traş bıçağı kullanarak bireysel liflerin tendonların ayrı. </li><li> Tendon lifleri steril bir kaba aktarın ve steril distile su ile yıkayın. 5-7 farelerin kuyruk 35 ml steril de-iyonize su içeren 50 ünite / ml penisilin penisilin, 50 mikrogram / ml streptomisin ve 250 ng / ml amfoterisin ve 0,034 K ile seyreltilmiş asetik asit içeren 50 ml konik tüp Transfer tendonları buzul asetik asit (17 K) bir stok solüsyonu. Rocker yerleştirin 4 ° C &#39;de bir hafta boyunca kollajen ayıklayın. </li><li> 3000 g de 15 dakika boyunca bir masa üstü santrifüj enkaz aşağı spin. Süpernatant, yaklaşık 30 ml, 1 saat süreyle 35.000 gr (yaklaşık 17.000 rpm) Beckman 50.2 Ti rotor ve spin için uyarlanmış iki polikarbonat borular aktarın. </li><li> Süpernatantı hacmi azalır, 1-2 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon elde etmek gerekecektir. 4 ultracel 50 k Amicon filtrasyon ünitesi ve 3000 rpm&#39;de bir masa üstü santrifüj spin süpernatantı transfer için 15 ° C Süzüntü, steril bir konik tüpe aktarın ve kaydedin. Santrifüj hacmi 5-6 ml kadar tekrarlayın. </li><li> Protein konsantrasyonu okuyun. Biz BSA standartları (Biorad) ve sulandırılmamış örnekleri kullanarak, standart bir Bradford assay (Biorad) kullanın. Negatif kontrol olarak sizin süzüntü bir örnek ölçün. </li><li> Ayrıca% 6 SDS-poliakrilamid jel, 10 şeritli, 1,5 mm jel kalınlığında kollajen saflaştırılmış bir örnek çözme ekstraksiyon saflık için kontrol edin. 63 mM Tris HCl% 10 gliserol,% 2 1,5 ml Eppendorf tüpleri SDS 0,0025% Bromophenol Mavi içeren 30 ul 1x SDS-PAGE yükleme tamponu 20 mg örnek hazırlayın. Sıçan kuyruğu kollajen tip bir pozitif kontrol olarak eşdeğer bir miktarda protein hazırlayın. Buna ek olarak, 2.5, 5, 10, PBS ve 1X yükleme tamponu sulandırılmış 20 mg BSA standartlarının bir dizi hazırlamak. Numuneleri 95 ° C 5 dakika kaynatın. </li><li> Yoğuşma aşağı spin (10 saniye süreyle maksimum hızda) örnekleri serin ve kısaca mikrofuge&#39;de edelim. </li><li> Moleküler ağırlık belirteci ile birlikte örnekleri örnekleri yükleyin. Örneğin, 5 Kaleidoscope Biorad protein standart ul yükleyin. , Yaklaşık 1 saat için 150 volt veya boya ön kadar Electrophorese alt ulaşır. </li><li> Jel çıkarın ve Coomassie mavi tampon leke. 2 g Coomassie mavi, 75 ml buzul asetik asit, de-iyonize su içeren toplam hacmi 1000 ml, 500 ml etanol karıştırma bu tampon hazırlayın. Ayrıca, Coomassie mavi reaktif olmadan dışında tarifi kullanarak destain tampon aynı miktarda hazırlar. Jel Coomassie mavi ve bir rocker yer için yeterli bir hacmi ile kaplayın. </li><li> Leke RT ve süzün az 1 saat için hafifçe sallayın. Koyu maviye dönüşürken destain çözüm değiştirin. Gecede jel gözaltına aldı ya da bireysel bantları, jel giderilinceye kadar. Iki kollajen bantları (molekül ağırlığı = 90 kDa ve 130 kDa) standartları ve kontrollere karşı bantları gücü bulun ve not edin. Resim jel, jel doc sistemini kullanarak gerekirse. </li></ol> 2. İzolasyon ve kültür normal ve PyVmT C57BL/6J farelerden alınan donör meme kanseri hücreleri ve fibroblastlar <ol><li> Tümörler belirgin ve onaylanmış IACUC yöntemler kullanılarak PyVmT transgenik farelerin hissediliyor Kurban yaş yaşı 10 hafta sonra kadın normal veya PyVmT transgenik fareler eşleştirilir. </li><li> Düz bir yüzey üzerinde fare Açığa sırtında ve bacaklarda yapıştırıcı bant kullanarak hareketsiz. </li><li> Bir baş, göğüs ve kasık meme bezi meme arasında T insizyon aşağı yapın ve meme bezlerinin maruz flep geri çekin. Meme dokuları çıkarın ve cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde kıyma. </li><li> 37 ° 200 mg tripsin, 500 mg kollajenaz, 4 mg DNAz, 3 saat sonra buz üzerinde gece ve 100.000 steril PBS hiyalüronidaz birimleri ve antibiyotikler ° C: 100 ml içeren bir enzimatik sindirim kokteyl hazırlayın </li><li> PBS, 4, 5 dakika için 1500 rpm bir masa üstü santrifüj her bir örnek ve santrifüj hücre pelletini% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 ml ° C </li><li> Süpernatantı yavaşça aspire PBS/10% FBS 5-7 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Spin iki kez daha tekrarlayın ve yıkayın. </li><li> % 10 FB içeren DMEM, 10 ml hücre pelletini tekrarS 50 ünite içeren / ml penisilin, 50 mikrogram / ml streptomisin ve 250 ng / ml amfoterisin kollajen tip I kollajen ile kat plakalar ile kaplı 10 cm yemekler (stok 1.5 mg / ml), 39 içine kollajen 1 ml seyreltilmiş 0,02 N asetik asit ml steril distile su veya PBS içinde seyreltilmesi. Kollajen pipetleyin 5 ml 10 cm &#39;lik plakaların üzerine çözüm. Için en az 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Aşırı kollajen aspire. Parafilm kullanılmayan tabak, 4 ve mağaza ° C de bir hafta boyunca. </li><li> Haftada 3 kez bir medya 2 değiştirin. Dokuların Başarılı sindirim iğsi fibroblastik hücreleri tarafından çevrili epitel odaklarının varlığı ile karakterize edilecektir. </li><li> Seçici tryspinization fibroblastlar ve epitel hücreleri ayırın. Aspire medya ve PBS ile hücreler bir kez yıkayın. Pipetleyin 1 ml% 0.25 &#39;hücreleri ve oda sıcaklığında inkübe üzerine trypsin/0.54 mM EDTA. Fibroblastlar, epitel hücreleri daha gevşek yapışık. 2 dakika sonra mikroskop altında fibroblast ayrılması için kontrol edin; hücreleri süspansiyon içinde yüzen ya da epitel odakları hala yüzeye yapışık olmalıdır yuvarlak olmalıdır. </li><li> Fibroblastlar kaldırmak için çanak çanak serum içeren orta fibroblastlar ve hafifçe pipetlemeyin 10 ml gevşetmek için hafifçe dokunun. </li><li> Pipetleyin 5. adımda açıklandığı gibi 15 ml konik tüp ve santrifüj fibroblastlar içeren medya). Replate kollajen kaplı 10 cm yemekleri üzerine bu hücreler ve fibroblastlar ve epitel hücreleri tamamen ayrılır kadar seçici trypsinization işlemi tekrarlayın. </li><li> CK14, CK18 ve alfa düz kas aktin (α-SMA) olarak fibroblast işaretleri gibi epitelyal belirteçler için immünofloresan boyama hücre saflık için kontrol edin. </li></ol> 3. Kültür hücreleri immünofloresan boyaması <ol><li> 6 cm yemekleri cam lamelleri yerleştirin. Laminer akış kaputu, 5 ila 10 dakika süreyle UV ışınlarına maruz kalma ile sterilize edin. </li><li> Kat 1-2 ml az 10 dakika oda sıcaklığında (RT) için stok kollajen çözüm çalışma lamel. Fazla aspire. </li><li> Örnek başına 200.000 epitel hücreleri ve fibroblastlar Trypsinize ve plaka. 3-5 ml tam medya ekleyin ve 24 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Medya aspire, hücreleri PBS ile yıkama ve -20 ° C&#39;de 7 dakika boyunca buz gibi metanol düzeltmesi. </li><li> PBS ile iki kez 1-2 ml PBS oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 1 FBS içeren etanol, ve blok kaldırmak için hücreleri yıkayın. </li><li> Forseps kullanarak, parafilm veya diğer hidrofobik yüzey ile kaplı geniş bir sığ bir kapta lamelleri ve yer çıkarın. </li><li> Anti-düz kas aktin (α-SMA, anti-CK14 (bazal epitel işaretleyici), anti-CK18 (luminal epitel işaretleyici): 1:100 engelleme çözümü aşağıdaki birincil antikorlar sulandırınız. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle doğrudan lamelleri üzerine antikor pipetleyin 100 ul. Inkübe engelleme çözüm hücre ayrı bir lamel; bu örnek, sekonder antikor kontrol olarak görev yapacak. </li><li> Yıkamak için doğrudan lamel antikor ve pipetlemeyin 1 ml PBS aspire edin. Aspire edin ve 3-5 kez tekrarlayın. </li><li> 1:100 az anti-fare-alexa 488, 1 biotinlenmiş anti-fare:: 500, anti-fare-alexa-568 çözümü engelleme aşağıdaki sekonder antikor sulandırınız. </li><li> Kap, alüminyum folyo lamelleri ile sarın. Pipetleyin doğrudan lamelleri uygun ikincil antikor ul: 100 anti-fare-alexa 568, anti-fare-alexa 488 ile CK 14 biotinlenmiş anti-fare boyama ve CK18 ile α-SMA. Görünür ışık örnekleri korumak için konteyner örtün. </li><li> Aspire antikor) 9. adımı olarak PBS ile yıkayın. CK14 boyanması dışında örnekleri PBS içinde bırakın. </li><li> PBS içinde alexa 568 1:500 konjuge streptavidin sulandırınız. CK14 strepatividin-alexa 568 ile vitray örnekleri, karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Adım 9) PBS içinde yıkayın </li><li> PBS içinde 500: DAPI 1 sulandırınız. Örnekleri PBS aspire ve karanlıkta 10 dakika RT DAPI ile inkübe edin. </li><li> Örnekleri PBS ile durulayın. , Pipetleyin 100 ul, cam Slaytlarınıza anti-solmaya reaktif Prolong böylece hücreler cam slayt bakacak şekilde üzerine lamel açmak. Nazikçe monte medya ile iletişim kurmak için başka bir açıdan lamel yatırın. </li><li> Immünofloresan bir mikroskop kullanılarak örnekleri Resim. Yaklaşık 2 hafta sürecek immünofloresan sinyal korumak için karanlık örnekleri tutun. </li></ol> 4. Aşılama için kolajen gömülü hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Kollajen hücrelerin gömmek için, kollajen bir ayar çözümü ile karıştırılarak polimerizasyon elde etmek için kollajen pH değerini düşürmek için gerekli. 10X Earl Dengeli Tuz Çözeltisi 100 ml (EBSS), NaHCO3, 2.45 g, 7.5 ml 1 M NaOH ve 42.5 ml steril distile su ile karıştırılarak ayar çözüm hazırlayın. Daha steril bir şişe bağlı bir şişe üst 0.22 mikron filtre ünitesi kullanılarak sterilize edin. </li> &lt;1 oranı: li&gt; bir başlangıç ​​4 çözüm ayarı ile kolajen (stok konsantrasyonu 1 mg / ml) karıştırın. Bir greft için, bir Eppendorf tüp çözüm ayarı 25 ul 100 ul kollajen karıştırın. Vorteks kısaca veya pipetlemeyin örnek yukarı ve aşağı örnek iyice karıştırmak için. </li><li> 5-10 ul artışlarla kolajen ya da ayar çözüm ekleyin ve bir nötr pH yansıtan turuncu renk pembe bir ışık karışımı değişiklikler fenol kırmızısı boya kadar iyice karıştırın. , Koyu pembe, bazik pH yansıtır sarı renkli asidik pH gösterir. Polimerizasyonu önlemek için buz karışımı tutun. </li><li> Trypsinization tarafından plaka fibroblastlar ve epitel hücreleri çıkarın. İlk olarak, medya aspirat ve 5 ml PBS ile yıkayın. Pipetleyin 0.25%, yüzey başına HBSS trypsin/0.54 mM EDTA, 1 ml. RT fibroblastlar 2-5 dakika inkübe edin. Epitel hücreleri 2-6 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. Plakalar hücreleri gevşetmek için hafifçe dokunun. Plaka üzerine 9 ml tam orta pipetleme dekolmanı microscope.Quench tripsin kullanarak kontrol edin ve 15 ml steril konik tüp hücreleri aktarmak. </li><li> 50 ul çıkarın ve hemasitometre hücreleri saymak. Her bir tüp içinde hücrelerin toplam hacmi (yaklaşık 10 ml) dikkat edin. </li><li> RT az 5 dakika 1500 rpm&#39;de Pelet hücreleri. Hücre pelletini aspire ve 100.000 cells/100 ul bir konsantrasyon hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Örneğin, toplam hacmi 500 ul eksiksiz bir medya 500.000 hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Ayrı bir tüp içinde 250.000 stromal hücreler (250 ul) ve 100.000 tümör hücrelerinin (100 ul) karıştırın. Mikrofuge&#39;de 10 sn 1000 rpm, pipetleme tarafından supernatant çıkarın. Düzeltilmiş kollajen çözüm hücrelere 50 ul ekleyin. Hücreler eşit olarak dağıtmak için pipetleyin yukarı ve aşağı. Pipetleyin steril 6 cm doku kültürü plakası 50 ul dairesel bir damla şeklinde. 37 ° C de 10 dakika süreyle polimerize greft inkübe edin. </li><li> Yavaşça bir açıyla eğerek plaka plaka eksiksiz bir medya 5 ml ekleyin ve yavaş yavaş yan plakanın bir medya pipetleme. Medya greft kapsar kadar etrafında plaka yatırın. </li><li> 37 az 24 saat inkübe ° C. Hemen nakli. </li></ol> 5. Ortoptik C57BL/6J fareler kollajen gömülü hücrelerinin nakli <ol><li> Nakli ameliyatı için ince bir cam çubuk üretmektedirler. Bunsen beki kullanarak bir bardak yeniden süspanse ısıtın. Forseps kullanarak, 2-3 mm kalınlığında pipetlemeyin sonuna streç. Soğumasını bekleyin ve% 70 etanol ile sterilize edin. </li><li> Otoklav ve% 70 etanol ile aşağıdaki cerrahi aletler sterilize ince cerrahi makas, künt cerrahi makas, künt forseps, ince forseps, yara klipleri, zımba yara </li><li> % Izofluran 2-3 izofluran bir süpürücü makine ile fare kullanarak anestezisi. Kullanılan ortalama O 2 debisi burun konisi ile 1 L / dakika. </li><li> Sırtında fare Lay ve teyp ya da diğer çıkarılabilir yapıştırıcı ile uzuvların hareketsiz. Nair gibi kimyasal saç çıkarıcı ile saç çıkarın. Pamuk,% 70 etanol ve betadin arasında bir hedef gibi moda alternatif sürüntü ile karın sterilize edin. </li><li> Cildin bir parçası, bir yandan künt forseps kullanarak meme bezi tarafından tutun. Diğer elinizle, künt cerrahi makas kullanılarak meme bezlerinin maruz # 9 ve # 10 meme veya # 4 ve # 5 inguinal meme bezlerinin meme arasında T-insizyon aşağı bir ters yapmak. </li><li> , Küçük cerrahi yaylı makas ile lenf nodu ya da meme arter altında bir cep kesi olun. </li><li> Forseps kullanılarak doku kültürü çanak kollajen greft çıkarın. Hafifçe silin ve ince bir cam çubuk kullanarak kollajen greft slayt cebine tamamen steril üzerine dabbing kollajen greft fazla sıvı çıkarın. </li><li> # 2 gut emilebilir dikişlerle veya yara zımba kullanarak flep dikin. </li><li> Fare kafes kurtarmanızı sağlar. </li><li> Tümörler için palpe, en az haftada iki kez fareler izleyin. Tümörlerin çapı 1 cm ulaştığınızda fareler Kurban. Hasat analiz için dokular. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: C57BL/6J fareler İzolasyon ve kollajen çıkarma Bu prosedürler 1 den adapte edilmiştir. - 5-7 fare kuyrukları kollajen protein çıkarımı 6 ml son hacmi yaklaşık 1-1.5 mg / ml, veya 6, 9 mg protein verir. Coommassie olarak 90 kDa ve 130 kDa karşılık gelen leke, bant sırasıyla kollajen tip I ve pro-kolajen varlığını gösteren (Şekil 1), fare kuyrukları çıkarılan örnekleri ile yüklenen şerit tespit edilir. Normal ve PyVmT C57BL/6J farelerde meme kanseri hücreleri ve fibroblastlar izolasyonu ve kültürü. Işlemleri 2 ila adapte edilmiştir. PyVmT karsinom hücreleri ve fibroblastlar, epitelyal ve mezenkimal mar hücre morfolojisi ve ifade farklılıkları ayırt edilebilirKERS. PyVmT karsinom hücreleri arnavut kaldırımlı şekil ve co-express CK18, luminal epitelyal bir işaretleyici ve CK14, bazal epitel işaretleyici, ama ifade α-SMA (Şekil 2) ile tanımlanır. Meme fibroblastlar, iğsi fenotip ile büyük hücreler ve α-SMA, yüksek düzeyde ifade ama CK14 veya CK 18 (Şekil 2) ifade yoktur. Bu veriler özetlenen prosedürlerini kullanarak fibroblastlar ve epitel hücreleri için% 95 hücre saflık üzerinde gösterir. Ortoptik C57BL/6J fareler kollajen gömülü hücrelerinin nakli Bu prosedürler, 3, 4 adapte edilmiştir . Nakli alıcı fareler her iki deney grubunda tümör çapı 1.0 cm, ya da yaklaşık 60 gün ulaştığınızda kurban. Sonra palpabl tümörlerde tek başına PyVmT hücrelerinin nakli 30 - 40 gün iken, 60 gün ortalama 0,335 gram tümör kitlesi ulaşan, meme fibroblastlar sonuçları ile 0,630 gram ortalama tümör kitlesi PyVmT kanseri hücreleri co-nakli, geliştirme belirten fibroblastlar (Şekil 3) tümör büyümesi. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Kollajen tip fare kuyrukları Ben çıkarma Coomassie leke analizi. BSA (~ 66 kDa), ok işareti ile belirtilir . Ticari sıçan kuyruğu kolajen (20 mg protein) ve saflaştırılmış fare kuyruğu kolajen (20 mg protein), kutu (~ 130 kDa, ~ 90 kDa proteinler) ile gösterilir. Std = moleküler ağırlık standardı. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Donör PyVmT meme kanseri hücreleri ve fibroblastlar immünofloresan boyaması a ve b PyVmT meme kanseri hücreleri temsil Panelleri CK14, CK18 karşı antikorlar için immunohistokimyasal. Paneli c, α-SMA için antikor ile boyandı fibroblastlar temsil eder. Görüntüler 20x büyütme DAPI kaplaması ile gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Meme tümör gelişimini fibroblastların varlığı ya da yokluğu C57BL/6J farelerde meme tümörleri, meme fibroblastların varlığı ya da yokluğu PyVmT kanseri hücreleri nakledilen farelerde hasat ve tartıldı . Ortalama ± ortalamanın standart hatası. N = grup başına 6.

<ol>
	<li>Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+adult+human+prostatic+epithelium+and+rat+urogenital+sinus+mesenchyme+in+a+tissue+recombination+model.">Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model.</a> Differentiation. 63, 131-131 (1998).</li><li>Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J., Asch, B. B., Ip, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).</li><li>Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L., Asch, B. B., Ip, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).</li><li>Medina, D., Kittrell, F., Asch, B. B., Ip, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+as+mediators+of+solid+tumor+metastasis.">Immune cells as mediators of solid tumor metastasis.</a> Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).</li><li>Naito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+differentiation+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage differentiation and function in health and disease.</a> Pathol Int. 58, 143-155 (2008).</li><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+cometh:+interplay+between+adaptive+immunity+and+cytokine+networks+in+rheumatoid+arthritis.">The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis.</a> J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).</li><li>Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Hepatocyte+Growth+Factor+Signaling+by+Type+II+Transforming+Growth+Factor-{beta}+Receptor+Knockout+Fibroblasts+Promotes+Mammary+Tumorigenesis.">Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).</li><li>Qiu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+expression+profiling+identifies+signatures+of+tumor+virulence+in+MMTV-PyMT-transgenic+mice:+correlation+to+human+disease.">Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease.</a> Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).</li><li>Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+polyoma+middle+T+antigen+on+signaling+and+transformation:+A+DNA+tumor+virus+contribution+to+the+war+on+cancer.">Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer.</a> Virology. 384, 304-316 (2009).</li><li>Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+neural+cells+via+retrovirus-mediated+oncogene+transduction.">Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction.</a> Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).</li><li>O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+freshly+isolated+human+mammary+fibroblasts+and+endothelial+cells.">Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+molecular+mechanisms+of+human+cell+immortalization.">Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization.</a> Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).</li><li>Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+protocols+used+in+cell+culture+models+of+human+breast+morphogenesis.">Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).</li><li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus.">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li><li>Shen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+endothelial+cells+differentiated+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).</li><li>Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+propagation+of+yolk-sac-derived+endothelial+cells+from+a+hypervascular+transgenic+mouse+expressing+a+gain-of-function+fps/fes+proto-oncogene.">Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).</li><li>Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+for+non-invasive+single+marker+tracking+of+mammary+stem+cells+in+vivo+reveals+stem+cell+dynamics+throughout+pregnancy.">A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy.</a> PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).</li><li>Guzman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracarotid+injection+of+fluorescence+activated+cell-sorted+CD49d-positive+neural+stem+cells+improves+targeted+cell+delivery+and+behavior+after+stroke+in+a+mouse+stroke+model.">Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model.</a> Stroke. 39, 1300-1306 (2008).</li><li>Duda, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transplantability+of+tumor-associated+stromal+cells.">Differential transplantability of tumor-associated stromal cells.</a> Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).</li></ol>

Hayvan deneyleri: Kansas Tıp Merkezi Üniversitesi IACUC komite tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Tümör progresyonu fibroblastların fonksiyonel katkı karsinom ilişkili fibroblastlar, artan tümör büyümesi ve invazivlik 5 iyi huylu meme epitel hücreleri ile birlikte nakledilen hangi transplantasyon modelleri ile kanıtlanmıştır . Konvansiyonel nakli yaklaşımlar, farklı genetik fare geçmişleri ya da farklı türlerin ortak nakli stromal ve epitelyal hücreleri SCID veya çıplak farelerin kullanılması yer var. Immün sistemi baskılanmış farelerde tümör spesifik antijen ve tümör hü...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> C57BL/6N fareler </td><td> Harlan </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> MMTV-PyVmT transgenik farelerde </td><td> Jackson laboratuvarlar </td><td> 002374 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Balıkçı </td><td> SH3039603PR </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> VWR </td><td> 10000113873 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Balıkçı </td><td> MT-30-001 </td><td></td></tr><tr><td> amfoterisin </td><td> balıkçı </td><td> BP2645-20 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon filtrasyon sütun ultracel 50k </td><td> Millipore </td><td> UFC905008 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman TI rotor için tüpleri </td><td> Beckman </td><td> 355618 </td><td></td></tr><tr><td> Rat kuyruk kollajen </td><td> Balıkçı </td><td> CB 40.236 </td><td></td></tr><tr><td> 10x EBSS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7510-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin 1X, HBSS w / o Kalsiyum ve Magnezyum% 0.25 </td><td> Balıkçı </td><td> MT-25-050-CI </td><td></td></tr><tr><td> Asetik sirke asidi </td><td> Balıkçı </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Coomasie mavi </td><td> Balıkçı </td><td> BP101 25 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T3924-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz A </td><td> Sigma AldrichC0130-50 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hyalronidase </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3884 </td><td></td></tr><tr><td> DNaz </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Kaleidoscope Protein standardı </td><td> Biorad </td><td> 1610375 </td><td></td></tr><tr><td> Cam slaytlar </td><td> Balıkçı </td><td> 12545-78 </td><td></td></tr><tr><td> Cam lamelleri </td><td> VWR </td><td> 101400-042 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentin antikor S-20 </td><td> Santa Cruz Biyoteknoloji </td><td> SC-7558 </td><td></td></tr><tr><td> α-düz kas aktin antikor </td><td> Abcam </td><td> ab5694 </td><td></td></tr><tr><td> CK14 antikor </td><td> Santa Cruz Biyoteknoloji </td><td> sc-53.253 </td><td></td></tr><tr><td> CK18 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab668 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare biotinlenmiş </td><td> Vektör laboratuvarlar </td><td> BA9200 </td><td> Fisher aracılığıyla dağıtılmaktadır </td></tr><tr><td> Anti-fare-alexa-568 </td><td> Invitrogen </td><td> A10037 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare-alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11226 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td><td></td></tr><tr><td> Antifade Prolong </td><td> Invitrogen </td><td> P-36.930 </td><td></td></tr><tr><td> Cerrahi makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 91400-12 </td><td></td></tr><tr><td> Güzel bahar makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Blunt forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11002-12 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 ince forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Gut kromik sütür </td><td> Balıkçı </td><td> NC9326254 </td><td></td></tr><tr><td> Cam tamamen yeniden süspanse </td><td> Balıkçı </td><td> 22-042-815 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Balıkçı </td><td> A406P 4 </td><td></td></tr><tr><td> betadin </td><td> balıkçı </td><td> NC9386574 </td><td></td></tr><tr><td> Yara klipleri </td><td> Balıkçı </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Yara elyaf </td><td> Balıkçı </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr></tbody></table>

mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in c57bl/6j mice

Stromal hücreler, fibroblastlar meme tümör progresyonu dahil olmak üzere etkisi özellikle farelerde meme bezi stromal hücreleri ve epitel hücrelerinin nakli yoluyla, fare modellerinin kullanımı ile belgelenmiştir. Şu nakli modelleri genellikle stromal hücreler ve epitel hücrelerinin farklı genetik geçmişleri nedeniyle immün sistemi baskılanmış farelerde içerir. Ekstrasellüler matrisler genelde tutarlı hücre-hücre etkileşimleri için iki farklı hücre tipleri gömmek, ancak Matrigel veya sıçan kuyruğu kollajen, immunojenik substratlar kullanımı dahil etmek için kullanılır. Immünkompromize farelerden elde edilen fonksiyonel T hücre eksikliği, ilaç geliştirme ve etkinliği üzerinde önemli etkileri, in vivo tümör progresyonu meme stromal hücreler doğru bir değerlendirme önler . Ayrıca, immün sistemi baskılanmış farelere, yüksek maliyetli sabit, özel bakım koşullarında ırk ve gerektirir. Bu engelleri aşmak için, biz orthotopically tutarlı tümör oluşumuna neden aynı genetik arka plan, stromal hücre ve epitel hücreleri farelere nakli için bir yaklaşım geliştirdik. Bu sistem, donör C57BL/6J fareler, normal karsinom ilişkili fibroblastlar, PyVmT meme kanseri hücreleri ve kollajen hasat içerir. Hücreler daha sonra kolajen gömülü ve kasık, dişi C57BL/6J farelerin meme bezleri nakledilen. PyVmT hücreleri tek başına Transplantasyon palpe edilebilir tümörler 30-40 gün transplantasyon sonrası oluşturur. 60 gün Son Nokta analizi fibroblastlar ile birlikte transplantasyon yalnız nakledilen PyVmT hücreleri ile karşılaştırıldığında meme tümör büyümesini artırır gösterir. C57BL/6J farelerin hücreleri ve matriks bu çalışmalarda kullanılan iken, hücre ve matriks izolasyonu ve transplantasyonu yaklaşım çok yönlülük gösteren farklı genetik kökenden farelere karşı uygulanabilir. Özetle, bu sistem stromal hücreleri ve epitel hücreleri arasındaki moleküler etkileşimler araştırmak için kullanılan olabilir ve immün sistemi baskılanmış fare modellerinde kritik kısıtlamaların üstesinden gelmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice at JoVE.com

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

Bu raporda, izole etmek için bir sistem ve fare meme bezi kültür donör hücreleri göstermek ve bu hücrelerin orthotopically nakli stromal analiz etmek için alıcı farelerde meme tümör gelişimi sırasında epitelyal etkileşimler.

C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

mammary-transplantation-stromal-cells-carcinoma-cells-c57bl6j

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K Görüntüleme.  University of Kansas Medical Center. Bu raporda, izole etmek için bir sistem ve fare meme bezi kültür donör hücreleri göstermek ve bu hücrelerin orthotopically nakli stromal analiz etmek için alıcı farelerde meme tümör gelişimi sırasında epitelyal etkileşimler.

Video: Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Tıp

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

İnsan internal meme arter (İMA) Transplantasyon ve Stent: In-Stent Restenozis Geliştirme Eğitim Bir İnsan Modeli

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Bağışıklık yetersizliği olan farelere subkutan olarak ve intrahepatik insan hepatoselüler karsinoma ksenograftlarının Üretimi

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies this model by avoiding challenging suture anastomoses of small vessels thereby reducing warm ischemia time. In comparison to abdominal graft implantation the cervical model is less invasive and the implanted graft is easily accessible for further follow-up examinations. Anastomoses are performed by pulling the ascending aorta of the graft over the cuff with the recipient&#8217;s common carotid artery and by pulling the main pulmonary artery over the cuff with the external jugular vein. Selection of appropriate cuff size and complete mobilization of the vessels are important for successful revascularization. Ischemia-reperfusion (I/R) injury can be minimized by perfusing the graft with a cardioplegic solution and by hypothermia. In this article, we provide technical details for a simplified and improved cuff technique, which should allow surgeons with basic microsurgical skills to perform the procedure with a high success rate.

The cuff technique shortens and facilitates the model of heterotopic cervical heart transplantation in mice by avoiding technically challenging suture anastomoses of small vessels. The technical details shown in this video paper should allow researches to establish this model in their laboratories.

Farelerde Heterotopik Servikal Kalp Nakli

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...