1. Nakli Epitel hazırlanması Taze ya da dondurulmuş donör epitel doku temizlenir yağ yastığı içine nakledilen, ama dondurulmuş donör epitelin ön hazırlık nakli verimlilik minimal azalma (&gt;% 85 verimlilik) ile daha rahat olabilir. Dondurulmuş donör epitelin hazırlanması için protokol aşağıdaki gibi: Donör nakli epitel hazırlamadan önce, cryovials içine 1ml hakkında epitel ve kısım için dondurma medya hazırlar. Gerektiği kadar bu 4 ° C&#39;de 6 ay kadar saklanabilir. Freeze medya, Hepes ve NaHCO 3,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sulphoxide (DMSO) ile tampon DMEM/F12 medya içerir . Kısa bir süre önce ötenazi dişi fare meme epitel Hasat. <ol><li> Fare,% 70 EtOH ile yıkayın. </li><li> Ventral vücut boşluğunda seröz membranlar piercing vücut duvarı ile pubis sternum kadar uzanan bir mid-sagital kesim olun. Her arka bacak (Şekil 1) doğru pubis başlangıç ​​kesi oblik bir kesim olun. </li><li> Vücut duvarının alt kısmında fasya bağlı 5. inguinal meme bezi maruz seröz membranlar uzak vücut duvarı soyun. Bunu başarmak için en iyi şekilde delmek ventral vücut boşluğuna değil dikkatli olmak, seröz membranlar kavisli bir forseps bir çift kavisli bölümünü dikkatlice tutarak. Aynı zamanda, kesme kenarı düz dişli forseps ile kabuklarıyla kavramak ve vücut duvarı seröz membranlar uzak çekin. </li><li> Meme bezi içindeki lenf nodu belirleyin. Lenf nodu meme bezi üç önemli kan damarlarının kesişme noktasında yer alır ve yağ yastığı (Şekil 2) içinde yoğun bir nodül olarak hissedilebilir. Ucu ile bir çift göz makas, nip düğüm çevreleyen yağ dokusu. Baş parmak ile cildin epidermal tarafında bir yağ yastığı düğüm dışarı yükseltmek ve bir çift kavisli bir forseps ile çimdik basınç uygulanır. Lenf düğümü atın. </li><li> Cilt kenar boşluklarını tutarken, kavisli kenarı kavisli bir forseps bir çift ve yavaş yavaş yağ yastığı vücut duvarı uzak kabuğu meme yağ yastığı kavramak. Tek parça olarak tüm meme bezi kaldırmak olarak fare dorsal yüzeyine doğru yağ yastığı yönde uygulayın. </li><li> Meme bezi steril bir plastik kesme blok üzerine koyun. Bezinin yüzeyi nemli tutmak için, 200 ul hakkında, medya küçük bir miktar ekleyin. 1mm parçalar halinde taze bir jilet ile bezi Kıyma. Kıyılmış bezi dört parçaya bölün ve forseps ile dondurma medya dört cryovials arasında dağıtmak. Dış izopropil alkol 250ml bir Nalgene &quot;Mr Frosty hücre dondurucu cryovials koyun. Nalgene dondurucuda -70 ° C derin dondurucuda 24 saat koyun. Kadar gerekli, sıvı nitrojen içinde meme parçalarının dondurulmuş şişeleri Mağaza nakli. Her cryovial 4-8 ev sahibi farelerin yağ pedleri temizlenir nakli için yeterli meme bezi parçaları içerecektir. </li></ol> 2. Nakli Hücreler hazırlanması Laboratuar ölümsüzleştirdi meme epitel hücre hatları, meme tümör hücre hatları veya bir fare içine primer meme hücrelerinin yağ yastığı temizledi dahil olmak üzere farklı hücre tipleri, nakledilen vardır. Virgülle D transplantasyon için hücrelerin hazırlanması için protokol aşağıdaki gibi: <ol><li> Virgülle D hücreleri DMEM içeren düzenli MECL medya kültürü: F12,% 2 Yetişkin Sığır Serum (ABS), mEGF, İnsülin, antimikotik / Antibiyotik (AB / AM) ile desteklenmiş. </li><li> Hasat Virgülle D hücreleri hücrelerin 85% -90% konfluent. </li><li> 5 dakika boyunca pelet hücreleri hücre süspansiyon 1200rpm santrifüjleyin. Taze MECL medya hücrelerinin yeniden süspanse edin ve 5 x 10 6 / ml hücre konsantrasyonunu ayarlamak. </li></ol> Primer meme hücrelerinin nakli için, birincil meme epitel hücreleri, fare 5. meme bezlerinin mekanik ve enzimatik dissosiasyon yolu ile izole edilmiştir . F12 medya ve istenen konsantrasyona göre ayarlanır, genellikle 5 x 10 6 / ml: Hücreler DMEM yeniden süspanse edilir. 3. Fare Meme Fat Pad temizlemek için Standart Yöntem <ol><li> Üç hafta eski konak fare anestezisi. Duktal meme büyümesi başlatılan olmamıştır sağlamak için &lt;12 g fareler seçin. Biz 2,2,2-tribromoethanol vücut ağırlığının 200mg/kg kullanın. </li><li> Fare uyuşturulduktan sonra karın alay böylece cerrahi bir sahnede sıkıca uzanmış uzuvları ile, ventral tarafta fare dizginlemek. Ameliyat öncesinde, analjezikler yönetmek; bupivakain (&lt;1mg/kg) veya buprenorfin (0.05mg/kg), subkutan. </li><li> Pelvis birkaç milimetre yukarıda forseps ile cilt kavrayın ve karından yukarı kaldırın<html> . Nip makas ile cilt ve vücut duvarı ile pubis sternum kadar uzanan bir mid-sagital kesim yapmak. Delmek ventral vücut boşluğunda seröz membranlar etmeyin. Yara klipleri fare idrara çıkma yeteneği engel olmaz böylece ilk kesi çok üretra yakın yapmayın. </li><li> Ilk kesi, her arka bacak doğru pelvis boyunca orta hat cilt yoluyla eğik kesikler yapın. </li><li> Yavaşça seröz membranlar kavramak için kavisli bir forseps kavisli alanını kullanın. Deri kesme marjı kavramak ve seröz membranlar uzak vücut duvarı çekin ve vücut duvarının alt kısmında ön panoda bulunan 5 inci inguinal meme bezi maruz doku forseps kullanın. </li><li> Meme, düğüm ve düğüm (Şekil 2) önde gelen iki arter dağlamak </li><li> Dördüncü ve beşinci bezleri ayırın. 6. bezi büyümesinin önlemek için beşinci bezinin marjı dağlamak. </li><li> Düğümün (meme karşı tarafı) sadece ventral makas ile yağ yastığı kesen dördüncü meme bezinin yağ yastığı bölün. Kavisli bir forseps yağ yastığı ventral kısmı sıkıca kavrayın ve tek parça olarak vücut duvarı uzağa çekmek için kullanın. Iki slaytlar arasındaki yağ yastığı ventral kısmı basın ve Carnoy Kullanıcı fiksatif içeren bir cam histoloji boyama çanak koymak. Bu doku, sabit ve daha sonra karmin şap çözüm temizlenir marjları (Şekil 3) kontrol etmek için boyanmış olacaktır. Fasya kaldırılan kısmı kavisli bir forseps ile meme bezinin tüm izlerini silmek için yağ yastığı bölgesi etrafında temizleyin. </li></ol> 4. Fat Pad Takas için alternatif &quot;Ayırma Prosedürü Bir fare meme yağ yastığı temizleme için standart bir prosedür ile yetkili haline gelmiştir sonra, onlar daha az invaziv bir koruyucu prosedür Brill ve ark (2008) 2 tarafından geliştirilen girişimi için tercih edebilirsiniz. <ol><li> Standart prosedür olarak fare hazırlayın. </li><li> Dördüncü inguinal meme bezi meme kavramak ve makas ucu ile meme başı etrafında 3-5 mm çevresi daire kesmek. </li><li> Deri kesme kısmını ayırmak dördüncü inguinal meme bezi ve delikten dışarı çekmek için vücuttan meme çekin. </li><li> Düğüm tanımlayın. Delikten düğüm ve 6 ncı meme bezi dağlamak için koter kullanın. </li><li> 5. meme bezinin düğümün hemen önce en yüzeysel kısmı kesin ve kesin. Meme, cilt ve meme yağ pedi içeren epitel bölümünü dairesel alanda tek parça halinde çıkarılır. </li></ol> 5. Doku / Hücre Transplantasyonu <ol><li> Epitel parçaları nakli için, defrost epitel cryovial ve DMSO sulandırmak için taze medya içeren bir Petri kabı epitel parçaları transfer. Yeni epitel makas ucu ile temizlenir yağ yastığı küçük bir delik veya cep olun. Iğne forseps ile cebine donör epitelin 1mm parçası koyun. Cep doku yerinde kalır, böylece iğne forseps geri doku forseps ile kapalı tutun. </li><li> Hücrelerin nakli için, her bir yağ yastığı içine 22s iğne ile 50μl Hamilton şırınga kullanarak medya 10 ul 50.000 hücreleri enjekte edilir. </li></ol> 6. Kapanış / Mouse Revival <ol><li> Cilt kapatılması için düzenleyin. Cilt marjları karşı tutun, forseps ile onları bir arada tutmak ventral vücut boşluğunda seröz membranlar onları kaldırarak ve yara klipleri ile yakın. Genellikle, mid-sagital insizyon ve standart prosedür için her oblik kesi için tek bir klibin kapatmak için iki klipleri kullanmak için gereklidir. Üretra engellemekten kaçının. Bu, bir dikiş ile orta sagital ve oblik insizyon kesiştiği cilt açıklarını kapatmak için gerekli olabilir. Koruyucu prosedürü her iki tarafı için sadece bir yara klip gerekecektir. </li><li> . Onu kafese yerleştirin ve fare fare gündeme getirdi kadar kafes bir ısıtma lambası altında tutmak. </li><li> Yara klipler, 2 hafta sonra çıkarılmalıdır. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 kesi desen gösterilmesi. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 lenf nodu, kan damarları, meme ve endojen epitel yeri. Yerlerinde belirtilen dağlamak. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Tüm montaj, bu endojen epitel daire içinde alan ile sınırlı ve bu nedenle marjları &quot;açık &#39;gösteriyor . 7. Temsilcisi Sonuçlar _r.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 4 &quot;/&gt; Şekil 4 Tüm montaj temizlenir marjları gösteren 3 haftalık fare kaldırılır yağ yastığı. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 Tüm montaj gösteren bir yağ yastığı endojen meme epitel temizlenir 10 haftalık fare. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 Hematoksilen ve eosin ile boyanan bölümünde, 10 haftalık fare bir temizlenmiş yağ yastığı . <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7 nakledilen epitel geliştirilen normal meme duktal ağaç gösteren bir 10 haftalık fare Tüm montaj. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8 Hematoksilen ve eosin ile boyanan bölümünde nakledilen epitel geliştirilen meme kanalları. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Şekil 9" /> Şekil 9 Hematoksilen ve eosin ile boyanan bölümünde nakledilen epitel geliştirilen bir meme tümörü.

<ol>
	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

Bu raporda, meme epitel nakli için hazırlık fare meme yağ yastığı temizlenmesi için iki alternatif yöntemler sunuyoruz. Standart prosedür DeOme ve arkadaşları tarafından 1959 yılında gelişimi beri kullanımda olan 1 daha invaziv meme bezinin yapısı ve yönünü kolayca ederken görülüyor, çünkü acemi eğitimi için standart bir yöntem tercih edilen bir yöntemdir. Ancak, koruyucu prosedür, çeşitli avantajları 2 nedeniyle daha deneyimli bir cerrah tarafından ter...

mammary epithelial transplant procedure

Bu makalede anlatılan ve DeOme KB ve ark tarafından geliştirilen yağ yastığı izni prosedürü karşılaştırır 1 Brill Yatak ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve tutucu bir prosedür. 2, meme epitel nakli prosedürünün izledi . Ergenlik sonrasına kadar meme epitel önemli bir gelişme meydana gelmeyeceği gerçeğinin yararlanır çünkü meme nakli prosedürünün çok meme biyologlar tarafından kullanılır. 3 hafta yaş, meme epitel ağacının büyüme, meme başının çevresinde sınırlıdır ve yağ yastığı meme epitel büyük ölçüde yoksun, ancak yaşı 7 hafta epitel duktal ağaç tüm yağ yastığı boyunca uzanır. Bu nedenle, yağ yastığı epitel içeren bu küçük bir kısmını, meme ve lenf nodu arasındaki bölge, yaş 3 hafta kaldırılması durumunda, endojen epitel meme yağ yastık doldurmak asla ve yağ yastığı &quot;temizlenmiş olarak tanımlanır &quot;. Bu zamanda, başka bir kaynaktan meme epitel yağ yastığı boyunca meme duktal ağaçları artırma potansiyeline sahiptir temizlenmiş yağ yastığı transplante edilebilir. Bu prosedür 4,5 sınırlı seyreltme hücre nakli tarafından belirlenmesi, meme kök hücrelerin belirlenmesinde, transgenik meme epitel doku tümör fenotip genotip karıştırıcı etkisi olmadan tüm hayvan 3 incelenmesi de dahil olmak üzere pek çok deneysel modellerde kullanılan olmuştur hiperplastik nodüller meme tümörlerinde 6 ilerlemek ve meme epitel 7,8 davranışı önceden hormon maruz kalmanın etkisini değerlendirmek. Üç haftalık ana fareler, anestezi, cerrahi bir sahnede temizlenmeli ve ölçülü. Mid-sagital bir kesi, deri yoluyla yapılmış, ancak değil, periton, pubis sternum uzanan. Eğik keser Her bacak doğru pelvis boyunca mid-sagital kesi deri yoluyla yapılır. Cilt 4. inguinal meme bezi maruz periton uzak çekilir. Yağ yastığı, lenf nodu, yağ ped doku anterior kaldırarak temizlenir. Epitel parçaları veya epitel hücreleri temizlendi kalan yağ yastığı içine nakledilen ve fare kapalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial Transplant Procedure at JoVE.com

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Bu makale DeOme KB tarafından geliştirilen yöntemle gösterir<em&gt; Ve ark.</em&gt; (1959) ve Brill B tarafından geliştirilen koruyucu prosedür<em&gt; Ve ark.</em&gt; (2008), meme parçaları, meme epitel hücreleri, veya meme tümör hücrelerinin nakli için hazırlık Ergenlik fare 4. inguinal meme yağ yastığı temizlenmesi için.

Meme Epitel Nakli Prosedürü

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K Görüntüleme.  University of Massachussetts. Bu makale DeOme KB tarafından geliştirilen yöntemle gösterir Ve ark. (1959) ve Brill B tarafından geliştirilen koruyucu prosedür Ve ark. (2008), meme parçaları, meme epitel hücreleri, veya meme tümör hücrelerinin nakli için hazırlık Ergenlik fare 4. inguinal meme yağ yastığı temizlenmesi için.

Video: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

İmmünolojik Mekanizmalar Altta yatan Organ Nakli Reddetme incelenmesi

Biyoloji

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Fare Meme Epitel Hücreleri lactogenic Farklılaşma sırasında Mammospheres formu

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

Meme Görüntüleme Penceresi yoluyla Dendra2 Photoswitching

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

Damar Zımba kullanarak sağ Hemipedicle Suprahilar İntrahepatik transeksiyonu sağ Hemihepatectomy

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.