Bu çalışma tamamen veya kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 ve U54 AI150472) tarafından desteklenmiştir. Dr. Raymond F. Schinazi ve Sadie Amichai'ye influenza A Virüsü ile enfekte olmuş hücreleri sağladıkları için teşekkür ederiz.

1. Kapak kapakları veya oda slaytları üzerindeki tohum hücreleri (Süspansiyon vs Yapışkan Hücreler) (sunulan protokol kapakları kullanır).
<ol><li>Süspansiyon hücrelerinin tohumlanması<ol><li>Poli-D-lizin (PDL) kaplı örtü kızaklarını hazırlayın (süspansiyon hücrelerinin örtü kaymasına yapışmasını kolaylaştırır) önce 5 dakika boyunca etanol (EtOH) içindeki örtü kaymalarını inkübe ederek (örtü kaymalarını sterilize eder ve herhangi bir kalıntıyı giderir). Daha sonra, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika (dak) boyunca PDL'de (20 μg / mL) örtüleri inkübe etmeden önce fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2x yıkayın.</li>
		<li>PDL'yi çıkarın ve PBS'de 2 kat yıkayın. Pelet hücreleri (istenen görüntüleme koşullarına göre daha önce enfekte edilmiş / tedavi edilmiş) ve 50 μL PBS'de 106hücreyi yeniden askıya alır. Cam üzerinde (PDL kaplı) 50 μL hücre tespit edin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Yapışkan hücrelerin tohumlanması<ol><li>Steril örtü üzerindeki kültür hücreleri, 6 kuyucuklu tabağa yerleştirilir ve hücreleri viral parçacıklarla enfekte eder veya ilgilenilen bileşikle tedavi eder. Görüntüleme deneyleri için numune hazırlamadan önce hücrelerin% 50-70 akıcılığa ulaşmasına izin verin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hücresel fiksasyon: Floresan görüntüleme çalışmaları için hücresel morfolojiyi korumak
NOT: Hücresel fiksasyondan önce RT'de %4 PFA ve PBS'yi en az 30 dakika tutun.
<ol><li>Hücresel ortamı aspire edin, PBS'de kapak kapaklarındaki hücreleri 3 kat yıkayın ve hücreleri 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. PFA'yı aspire edin ve hücreleri PBS 2x'te yıkayın. NOT: Deneyci deneye başka bir tarihte devam etmek isterse, hücreler artık kurutulabilir ve saklanabilir. Sabit hücreler depolamadan önce EtOH'de dehidre edilebilir.<ol><li>Hücresel fiksasyondan sonra yıkamayı takiben PBS'yi çıkarın ve 500 μL% 50 EtOH (suda v / v) ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.</li>
		<li>%50 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %70 EtOH ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.</li>
		<li>%70 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %100 EtOH ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.</li>
		<li>% 100 EtOH'yi çıkarın ve% 100 EtOH ile değiştirin. NOT: Susuz hücreler 6 ay boyunca -20 °C'de saklanabilir. EtOH'nin buharlaşmasını önlemek için depolamadan önce plakaları bant veya parafilm ile kapatın.</li>
		<li>Hücrelerin/virüslerin çoklanmış floresan etiketlemesine geçmek için hücreleri rehidratlayın.</li>
		<li>% 100 EtOH'yi çıkarın ve% 70 EtOH'nin 500 μL'si ile değiştirin. RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Hücrelerin hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin. Tüm hücreleri batırmak için her zaman yeterli çözelti kullanın.</li>
		<li>%70 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %50 EtOH ile değiştirin. RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>% 50 EtOH'yi çıkarın ve 1x PBS ile değiştirin. NOT: Proteaz seyreltme, hibridizasyon probları ve yıkama tamponunu proteaz tedavisi (Adım 4) ve hedef prob uygulamasından (Adım 5) önce hazırlayın. Reaktif hazırlama ile ilgili özel talimatlar, ilgili her adımın başında sunulmaktadır.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Diğer Notlar</td>
		</tr><tr><td>Proteaz çözeltisi</td>
			<td>1X PBS'de hazırlanın</td>
		</tr><tr><td>Hedef oligonükletodie probu(ları)</td>
			<td>Hibridizasyon tamponunda seyreltin</td>
		</tr><tr><td>Yıkama tamponu</td>
			<td>Hedef hibridizasyon adımlarını izleyerek yıkarlar</td>
		</tr><tr><td>Hibridizasyon tamponu</td>
			<td>Tablo 3'te sunulan tarif</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: MICDDRP protokolündeki anahtar reaktifler.
3. Hücre geçirgenliği: Büyük moleküllerin (antikorlar, nükleik asit hibridizasyon probları) girişi için hücre ve hücresel organellere erişimi arttırır
<ol><li>Hücresel fiksasyon veya rehidrasyondan sonra 1x PBS'yi çıkarın ve 1x PBS'de 500 μL% 0.1 (v / v) Ara-20 ile değiştirin. RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Tek tek değiştirin. 500 μL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve taze 1x PBS ekleyin.</li>
</ol>4. Hibridizasyon verimliliğini artırmak için sabit viral/hücresel nükleik asitten nükleik asit bağlayıcı proteinleri uzaklaştırmak için cam slayt üzerinde coverslip immobilizasyonu ve proteaz işlemi
NOT: Hücresel geçirgenlik sırasında seyreltilmiş Proteaz III (Malzeme Tablosundaki reaktifin özelliklerine bakınız) çözeltisini hazırlayın. Proteazın geçirgenlikten önce 10 dakika boyunca RT'ye ulaşmasına izin verin.
<ol><li>Sterilize edilmiş bir cam slaytın üzerine küçük bir damla oje yerleştirin. Arkanızı kurutun (hücre tabakası olmayan taraf) ve kapak kaymasının kenarını oje damlasının üzerine, yapıştırılmış hücrelerin yukarı baktığı tarafı olacak şekilde yerleştirin. Kurumayı önlemek için hareketsiz kapak kapağına birkaç damla PBS ekleyin.<ol><li>Hidrofobik bariyer kalemi (reaktifleri hücreler üzerinde lokalize tutan su itici kalem) kullanarak slayta yapıştırılan kapak kaymasının çevresine bir daire (kapak kaymasından yaklaşık 3 mm uzaklıkta) çizin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protease III'ü 1x PBS (100 μL/coverslip) içinde seyreltin. NOT: Proteaz konsantrasyonunun, ampirik optimizasyon yoluyla hücre tipleri, problar veya hedef nükleik asit (ler) deki farklılıklara bağlı olarak ayarlanması gerekebilir ( Bkz. Tartışma). Farklı viral sistemlerde en verimli RNA / DNA etiketlemesi için, aşağıdaki Tablo 2'de sunulan aşağıdaki seyreltmelerle, (1 ila 2 ) - (1 ila 15) (proteaz ila 1x PBS) arasında değişen seyreltmelerle başarı elde ettik.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Prob Hedefleri</td>
			<td>1X PBS'de Proteaz Seyreltme (Proteaz III - 1X PBS)</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 DNA/RNA</td>
			<td>1 ila 5</td>
		</tr><tr><td>HTLV-1 DNA/RNA</td>
			<td>1 ila 5</td>
		</tr><tr><td>HBV pgRNA ve toplam HBV RNA</td>
			<td>1 ila 15</td>
		</tr><tr><td>IAV RNA</td>
			<td>1 ila 15</td>
		</tr><tr><td>ZIKV RNA</td>
			<td>1 ila 2</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: PBS'de viral nükleik asit hibridizasyonu için proteaz III dilüsyonları.
<ol start="3"><li>İmmobilizasyonu takiben 1x PBS'yi kapak kapağı üzerinde boşaltın ve seyreltilmiş Proteaz III'ü uygulayın.</li>
	<li>Nemlendirilmiş bir fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Dekant proteaz çözeltisi ve daldırma slaytları 1x PBS'de. RT'de 2 dakika boyunca sallanan bir tabakla çalkalayın. Yeni 1x PBS ile tekrar yıkayın.<ol><li>Sadece DNA tespiti için, numuneleri her biri 2 dakika boyunca nükleaz içermeyen suyla üç kez yıkayın, ardından 37 ° C'de 30 dakika boyunca PBS'de seyreltilmiş 5 mg / mL RNaz A ile inkübasyon yapın.</li>
		<li>Decant RNase Bir çözelti ve ultra saf su ile 2 dakika boyunca 3x yıkayın. Hedef probun (lar) ın ISH ile devam edin. NOT: Hibridizasyon tamponu, sunulan sonuçlar için vRNA boyama verimliliğini etkilemeden vDNA tespitini geliştirir (Temsili Sonuçlar). DNA Kanal 1 (C1) probları 1:1'i hibridizasyon probu ile seyreltin. RNA C2 ve C3 problarını hibridizasyon tamponunda seyreltin. Görüntüleme çalışmalarımızda kullanılan C2 ve C3 probları 50X çözeltilerdedir (1:50; hibridizasyon tamponuna hedef prob).</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adım adım prosedürü izleyerek nükleaz içermeyen suda hibridizasyon tamponunu hazırlayın:<ol><li>15 mL'lik bir tüpte, 700 μL nükleaz serbest su, 300 μL% 50 (ağırlık / hacim (w / v)) dekstran sülfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM sodyum sitrat (pH 6.2) ve 375 mg (toz) etilen karbonat ekleyin.</li>
		<li>Etilen karbonatı çözmek için bir vorteks kullanarak iyice karıştırın (tüm tozun çözündüğünden ve berrak bir çözelti olduğundan emin olun).</li>
		<li>Ara-20'nin 25 μL'si (hacim/hacim (v/v)) %10 (hacim/hacim (v/v)) ve 2,5 mL'yi (2x çözelti) tamamlamak için yeterli nükleaz içermeyen su ekleyin. NOT: Sunulan hibridizasyon tamponunun tarifi aşağıdaki Tablo 3'te bulunabilir. Çözüm bir hafta boyunca kararlıdır. Çözeltinin köpürmesini önlemeye dikkat ederken, Tween-20 deterjanının yeterli miktarda karıştırıldığından emin olun.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Stok Konsantrasyonu</td>
			<td>Ek Notlar</td>
		</tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Dextran sülfat</td>
			<td>%50 (w/d)</td>
			<td>Çok viskoz</td>
		</tr><tr><td>Sodyum klorür</td>
			<td>5 milyon</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sodyum sitrat (pH 6.2)</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>4 °C'de depolayın</td>
		</tr><tr><td>Etilen karbonat</td>
			<td>NA</td>
			<td>Toz</td>
		</tr><tr><td>Ara-20</td>
			<td>%10 (d/d)</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Reaktiflerin hibridizasyon tampon listesi.
5. DNA / RNA hedef hibridizasyon probları ile inkübasyon: Hedef oligonükleotid probları, ilgilenilen bölgelere bağlanır ve ön amplifikatörlerin, amplifikatörlerin ve floresan probların bağlanması için moleküler bir iskele oluşturur.
NOT: DNA / RNA problarını 40 ° C'de 10 dakika boyunca (Hücre Geçirgenliği sırasında) ısıtın ve RNaz tedavisi dahil değilse en az 10 dakika boyunca RT'ye soğutun. Hedef prob hibridizasyonundan önce RNaz tedavisi veya daha fazla numune tedavisi gerekiyorsa, buna göre probları ısıtın. Isındıktan sonra C2 ve C3 problarını döndürün ve hibridizasyon tamponunda seyreltin. Seyreltmeden sonra, C2 ve C3 probları kısaca ısıtılabilir. Sıcak 50x yıkama tamponu (Daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakınız) 40 ° C'de 10-20 dakika boyunca ve moleküler biyoloji sınıfı suda 1x'e kadar seyreltin.
<ol><li>Hibridizasyon prob(lar)ının eklenmesinden önce 10 dakika boyunca 67 °C'de 200 μL hibridizasyon tamponunu inkübe edin. Probu hibridizasyon tamponunda seyreltin ( Tablo 2'de listelenen tarif). 50 μL/coverslip ekleyin.</li>
	<li>Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 2 saat (s) boyunca inkübe edin. Dekant problar ve daldırma kızakları 1x yıkama tamponuna. RT'de 2 dakika boyunca tabağı sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile tekrar yıkayın.</li>
</ol>6. Amplifikatör (Amper) 1-FL Hibridizasyonu: Hedef DNA / RNA problarının kuyruk dizisine tamamlayıcı olan ön amplifikatörün eklenmesi (Adım 5)
NOT: Amplifikatörler kullanılmadan önce RT'de olmalıdır. Her bir amplifikatörü kullanmadan 30 dakika önce buzdolabından çıkarın ve RT'deki bankta bırakın.
<ol><li>Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.</li>
	<li>Kapak kapağına 1 damla Amper 1-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Decant Amp 1-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.</li>
</ol>7. Amper 2-FL Hibridizasyonu: Ön amplifikatörlere konyak tanıma sırasına sahip sinyal amplifikatörü ile inkübasyon (Amp 1-FL)
<ol><li>Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.</li>
	<li>Kapak kapağına 1 damla Amp 2-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Decant Amp 2-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.</li>
</ol>8. Amper 3-FL Hibridizasyon: İkinci sinyal amplifikatörü ile inkübasyon
<ol><li>Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.</li>
	<li>Kapak kapağına 1 damla Amper 3-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Decant Amp 3-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.</li>
</ol>9. Amper 4-FL Hibridizasyon: Floresan etiket ve son hibridizasyon adımı
NOT: İlk olarak, hedef probun (lar) kanallarına göre uygun Amp 4 (A, B veya C) - FL'yi seçmek için Tablo 4'e bakın. İlgilenilen DNA / RNA'yı etiketlemek için hangi Amp 4-FL'nin gerekli olduğunu değerlendirin. Aşağıdaki tabloda bir örnek verilmiştir:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>DNA Kanal 1 (C1)</td>
			<td>488</td>
			<td>550</td>
			<td>550</td>
		</tr><tr><td>DNA/RNA Kanal 2 (C2)</td>
			<td>550</td>
			<td>488</td>
			<td>647</td>
		</tr><tr><td>RNA Kanal 3 (C3)</td>
			<td>647</td>
			<td>647</td>
			<td>488</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 4: Çoklanmış ISH için Amp 4 (A, B veya C)-FL floresan probu seçimi.
NOT: Çoğullanmış FISH (birden fazla hedef) için, doğru Amp 4 (A, B veya C)- FL'yi seçmek, ilgilendiğiniz hedefi (hedefleri) doğru şekilde etiketlemek için kritik öneme sahiptir. Hedef problar (Adım 5), seçilen Amp 4-FL'ye bağlı olarak ilgili floresan etiketlerini (Alexa 488, Atto 550 veya Alexa 647) dikte eden farklı renk kanallarına (C1, C2 veya C3) sahiptir. Çoklanmış görüntüleme için florofor kombinasyonlarının seçilmesine ilişkin örnekler Şekil 2 ve Şekil 3 açıklamalarında verilmiştir. Ek bir örnek olarak, Amp 4B-FL seçimi, DNA C1 problarını Atto 550 ile ve RNA C3 problarını Alexa 647 ile seçici olarak etiketleyecektir.
<ol><li>Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.</li>
	<li>Kapak kapağına 1 damla Amper 4-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Adım 9.2'yi takiben, örnekleri ışıktan korunarak kapalı tutun.</li>
	<li>Decant Amp 4-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de 2 dakika boyunca tabağı sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. 1x PBS (2 dakika) ile yıkayın ve PBS'de saklayın.</li>
</ol>10. Protein immün boyama: İlgilenilen proteinleri etiketlemek için
<ol><li>PBS'yi boşaltın ve kapak kapağına 200 μL blokaj tamponu ekleyin (%1 BSA ile, %10 v/v FBS ile PBS'de %0,1 v/v Ara-20 (PBST)). RT'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Dekant bloke edici tampon ve PBST'de seyreltilmiş 200 μL primer antikor + % 1 w / v BSA uygulayın. RT'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Slaytı PBST ile RT'de sallayarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
	<li>PBST'de RT'de 1 saat boyunca tercih edilen sekonder antikoru + BSA ile% 1 uygulayın.</li>
	<li>Slaytı PBST ile RT'de sallayarak 10 dakika yıkayın.</li>
</ol>11. Nükleer boyama: İmmün boyama sonrası karşı leke çekirdekleri
<ol><li>PBST'yi boşaltın ve RT'de 1 dakika boyunca DAPI veya nükleer leke seçin.</li>
	<li>Slaytı PBS ile RT'de sallayarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
</ol>12. Montaj
<ol><li>Yeni steril cam sürgü üzerine 1 damla antifade çözeltisi (örneğin, Uzatma Altın) yerleştirin (İlk olarak, EtOH ile kaydırağı temizleyin ve cam üzerinde kalıntı kalmamasını sağlamak için kurumaya bırakın). Aynı uçla, antifade çözeltisi damlasını, yaklaşık olarak kapak kaymasının büyüklüğünde bir alanı kaplayacak şekilde yayın. NOT: Antifade çözeltisi çok viskozdur ve pipet uygulaması zor olabilir. Pipetlemeden önce ucun 200 μL'lik bir uçtan kesilmesi bu sorunları hafifletebilir.</li>
	<li>Slayttan hücre örneği içeren kapak kaymasını çıkarın ve forseps ve PBS kullanarak arkadaki artık ojeyi çıkarmak için PBS'ye batırın. Kuru forseps ve bir Kimwipe kullanarak kapak kaymasının arkası.</li>
	<li>Antifade çözeltisinin damlasına hafifçe yerleştirilmiş örtü kayması, damla üzerine kapak kaymasının numune tarafını (hücre tabakası ile yan taraf) yerleştirin).</li>
	<li>Numunelerin gece boyunca kurumasını bekleyin.</li>
</ol>13. Görüntüleme
<ol><li>Epifloresan mikroskoplu görüntü.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging.">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li><li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection.">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).</li><li>Ukah, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+HIV-1+RNA+Transcription+from+Integrated+HIV-1+DNA+in+Reactivated+Latently+Infected+Cells.">Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Positive+and+Negative+Sense+Viral+RNA+for+Probing+the+Mechanism+of+Direct-Acting+Antivirals+against+Hepatitis+C+Virus.">Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus.</a> Viruses. 11 (11), (2019).</li><li>Achuthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid-CPSF6+Interaction+Licenses+Nuclear+HIV-1+Trafficking+to+Sites+of+Viral+DNA+Integration.">Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution.">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li><li>Bushnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+HIV-1+Genomic+DNA+from+Entry+through+Productive+Infection.">Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection.</a> Journal of Virology. 91 (9), (2017).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26 (1), 10-18 (2002).</li><li>Francis, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains.">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).</li><li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus.">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi genellikle kapsamlı optimizasyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan iki yöntem 5-etinil-2-deoksiüridin (EdU) etiketleme ve DNA FISH'tir. EdU etiketlemesi, viral DNA ve proteini aynı anda görselleştirmek için uygulanmıştır, çünkü EdU yeni ortaya çıkan DNA'ya dahil edilir ve daha sonra tıklama kimyası yoluyla azid içeren floresan boyalarla etiketlenir. Bu nedenle EdU etiketlemesi, DNA virüslerinin veya virüslerin yerel virüs rep...

Geleneksel immün boyama yaklaşımlarıyla proteinleri spesifik olarak etiketlemek için binlerce ticari antikor mevcut olsa da ve füzyon proteinleri, bir örnek1'deki birden fazla proteini izlemek için foto-optimize floresan etiketlerle tasarlanabilirken, proteinin mikroskobik görselleştirilmesi genellikle geleneksel DNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH) ile uyumlu değildir2 . Floresan tabanlı yaklaşımlar kullanılarak DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesindeki teknik sınırlamalar, virüs replikasyonunun derinlemesine anlaşılmasını engellemiştir. Enfeksiyon sırasında hem viral nükleik asidin hem de proteinin izlenmesi, virologların virüs replikasyonu ve montajı 3,4,5,6'nın altında yatan temel süreçleri görselleştirmelerini sağlar.
Nükleik asit tespitinin duyarlılığını artırmak için dallanmış DNA (bDNA) in situ teknolojisini kullanan DNA, RNA ve Protein'in (MICDDRP)3'ün multiplex immunofloresan cell tabanlı detection'u adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik 7,8,9 . Ek olarak, bu yöntem gelişmiş özgüllük için eşleştirilmiş problar kullanır. bDNA dizisine özgü problar, yoğun ve lokalize bir sinyal üretmek için dallanma preamplifikatörü ve amplifikatör DNA'larını kullanır ve DNA9'da tekrarlanan bölgeleri hedeflemeye dayanan önceki hibridizasyon yöntemlerini geliştirir. Klinik bağlamda enfekte olmuş hücreler genellikle bol miktarda viral genetik materyal içermez ve tanısal ortamlarda floresan nükleik asit tespiti için hassas bir yöntem için bir emtia sağlar. bDNA teknolojisinin RNAscope7 ve ViewRNA10 gibi yaklaşımlarla ticarileştirilmesi bu nişi doldurmuştur. bDNA floresan görüntülemenin duyarlılığı, hücre kültürü modellerinde kıt nükleik asit türlerinin tespit edilmesine izin veren hücre biyolojisinde de önemli bir faydaya sahiptir. Duyarlılığın büyük ölçüde artması, bDNA tabanlı görüntüleme yöntemlerini virüsleri incelemek için uygun hale getirir. Bununla birlikte, potansiyel bir eksiklik, bu yöntemlerin RNA veya RNA ve proteini görselleştirmeye odaklanmasıdır. Tüm çoğalan hücreler ve birçok virüs, DNA genomlarına sahiptir veya replikasyon döngüleri sırasında DNA oluşturur, bu da hem RNA hem de DNA'yı ve proteini görüntüleyebilen yöntemleri oldukça arzu edilir hale getirir.
MICDDRP protokolünde, RNAscope yöntemini kullanarak viral nükleik asidin tespiti için bDNA FISH'imodifikasyonlar 7 ile gerçekleştiriyoruz. Bu protokoldeki en önemli değişikliklerden biri, kimyasal fiksasyonu takiben proteaz tedavisinin optimizasyonudur. Proteaz tedavisi, prob hibridizasyon verimliliğini artırmak için nükleik aside bağlı proteinlerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Proteaz tedavisini dallı oligonükleotid prob (lar) ile inkübasyon izler. bDNA problarının uygulanmasından sonra, numuneler yıkanır ve daha sonra sinyal ön amplifikatörü ve amplifikatör DNA'ları ile inkübe edilir. Çoklu gen hedeflerinin etiketlenmesi olan multipleks in situ hibridizasyon (ISH), spektral farklılaşma için farklı renk kanallarına sahip hedef problar gerektirir7. DNA amplifikatörleri ile inkübasyonu immünofloresan (IF) takip eder.
bDNA ISH, hedefe özgü sinyallerin amplifikasyonu ile sinyalden gürültüye iyileştirmeler sağlar ve spesifik olmayan hibridizasyon olaylarından kaynaklanan arka plan gürültüsüne bir azalmasağlar 7,11. Hedef problar, spesifik olmayan hibridizasyon olaylarının olasılığını tahmin eden ve prob-hedef hibrid 7,11'in erime sıcaklığını (T m) hesaplayan halka açık yazılım programları kullanılarak tasarlanmıştır. Hedef problar, hedef DNA / RNA dizisini tamamlayan 18 ila 25 bazlı bir bölge, bir ara dizi ve 14 bazlı bir kuyruk dizisi içerir. Her biri ayrı bir kuyruk dizisine sahip bir çift hedef prob, bir hedef bölgeye (~ 50 baza yayılan) melezleşir. İki kuyruk dizisi, amplifikatör probları için 20 bağlama bölgesi içeren ön amplifikatör probları için bir hibridizasyon bölgesi oluşturur ve bunlara ek olarak etiket probu için 20 bağlama bölgesi içerir. Örnek olarak, nükleik asit molekülü üzerindeki bir kilobaz (kb) bölgesi, 20 prob çifti tarafından hedeflenir ve ön amplifikatör, amplifikatör ve etiket probu ile sıralı hibridizasyon için moleküler bir iskele oluşturur. Bu nedenle, nükleik asit molekülü başına 8000 floresan etiketin teorik verimine yol açabilir, bu da tek moleküllerin tespitini ve geleneksel FISH yaklaşımları7'ye göre büyük gelişmeler sağlar (bDNA sinyal amplifikasyonunun şeması için Şekil 1A'ya bakınız). Çoklanmış ISH için problar kurmak üzere her hedef probun farklı bir renk kanalında (C1, C2 veya C3) olması gerekir. Farklı renk kanallarına sahip bu hedef problar, farklı 14 tabanlı kuyruk dizilerine sahiptir. Bu kuyruk dizileri, farklı floresan problarla farklı sinyal amplifikatörlerini bağlayacak ve böylece birden fazla hedef arasında kolay spektral farklılaşmayı mümkün kılacaktır. Sunulan Protokolde, Adım 9'daki Tablo 4, hedef probların floresan olarak etiketlenmesi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Ek olarak, Şekil 2 ve Şekil 3, HIV-1 ve HTLV-1 enfeksiyonlarını takiben çoklu viral nükleik asit hedeflerinin spesifik floresan etiketlemesini elde etmek için uygun Amplifikatör 4-FL (A, B veya C) (floresan probu ve son hibridizasyon adımı) 'nı nasıl seçtiğimize dair örnekler sunmaktadır.
RNA, DNA ve proteinlerin eşzamanlı floresan görselleştirmesinin çeşitli uygulamalarını gösterdik ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlük 3,4,5 ile virüs replikasyonunun kritik aşamalarını gözlemledik. Örneğin, viral RNA, sitoplazmik ve nükleer DNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesi, nükleer girişten önce sitoplazmada RNA içeren çekirdekleri takip etmek ve proviral DNA3'ün entegrasyonu da dahil olmak üzere HIV-1 enfeksiyonu sırasındaki önemli olayları görselleştirmemize izin vermiştir. Ayrıca konakçı faktörlerin ve ilaç tedavisinin viral enfeksiyon ve replikasyon üzerine etkilerini karakterize etmek için MICDDRP uyguladık 4,5. Ukah ve ark.'da, HIV transkripsiyonunu ve gecikme tersine çevirmesini görselleştirmek için farklı gecikme tersine çevirici ajanlarla tedavi edilen gecikmeli hücre modellerinde HIV-1 transkripsiyonunun reaktivasyonunu izledik4. Ek olarak, MICDDRP, küçük molekül tedavisine veya konakçı faktörü kısıtlamasına atfedilen antiviral inhibisyonla ilişkili fenotipik değişiklikleri görselleştirmemize izin verebilir. Yaklaşımımızın sağlamlığına ve geniş uygulanabilirliğine kavramın bir kanıtı olarak, sadece insan immün yetmezlik virüsünde (HIV)-1'de değil, aynı zamanda insan T-lenfotropik virüsünde (HTLV)-1, hepatit B virüsünde (HBV), hepatit C virüsünde (HCV) enfeksiyonu takip etmek için viral nükleik asidi etkili bir şekilde etiketlemek için protokolümüzün modifikasyonlarını kullanabileceğimizi gösterdik. Zika virüsü (ZIKV) ve influenza A virüsü (IAV). HIV-1 yaşam döngüsü hem viral DNA hem de RNA türlerinden oluştuğundan, HIV-1 replikasyon kinetiğini takiben MICDDRP optimizasyonumuzun çoğunu gerçekleştirdik. Bununla birlikte, ek olarak, viral transkripsiyon ve replikasyonu izlemek için ZIKV, IAV, HBV ve HCV gibi virüslerde her iki duyu (+) ve antisens (-) sarmallılığın farklı viral RNA transkriptlerinin sentezini izleyebileceğimizi gösterdik 3,4,5,6. Çalışmalar, çeşitli viral süreçlerin mekanik anlayışını geliştirmeyi ve bu floresan görüntüleme teknolojisini çok çeşitli hücresel modellere uygulamak için bir kılavuz görevi görmeyi amaçlamaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% dextran sulfate</td>
			<td>Amreso</td>
			<td>198</td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X wash buffer</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>320058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 1-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 2-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 3-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 4-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Consult Amp-4 table in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HCV NS5a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13833</td>
			<td>Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mov10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80613</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PB1 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX125923</td>
			<td>Antibody against flu protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking reagent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell media with supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media appropriate for cell model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td>No calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand colorfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-17/18/19</td>
			<td>Precleaned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV-GT2a-sense-C2 probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441371</td>
			<td>HCV(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-gagpol-C1</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317701</td>
			<td>HIV-1 cDNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-nongagpol-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317711-C</td>
			<td>HIV-1 RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ hybridization oven</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>321710/321720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine (PDL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Coat coverslips in 20 &#181;g/mL of PDL for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe diluent</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>300041</td>
			<td>For diluting RNA C2 or C3 probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>322337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope&#174;&#160;Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate, pH 6.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer and PBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441351</td>
			<td>Total HBV RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD-01-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>465531-C2</td>
			<td>HBV pgRNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HCV-GT2a probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441361</td>
			<td>HCV(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495071-C3</td>
			<td>HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495051-C2</td>
			<td>HTLV-1 DNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495061</td>
			<td>HTLV-1 (+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td>IAV RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>464531</td>
			<td>Zika(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>478731-C2</td>
			<td>Zika(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection

Virüslerin dinamik replikasyon ve montaj süreçlerini yakalamak, viral nükleik asit ve proteinin hassas ve eşzamanlı olarak etiketlenmesini sağlayan sağlam in situ hibridizasyon (ISH) teknolojilerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Konvansiyonel DNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri genellikle immün boyama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesini sağlayan MICDDRP (MULTIPLEX IMMUNOFLUORESCENT CELL-BASED D ETECTION OF DNA, RNA ve protein) adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik. Geleneksel DNA FISH'lerle karşılaştırıldığında, micddrp, oligonükleotid probu duyarlılığını ve tespitini önemli ölçüde artıran dallanmış DNA (bDNA) ISH teknolojisini kullanır. MICDDRP'nin küçük modifikasyonları, viral proteinlerin farklı sarmallara sahip nükleik asitlerle (RNA veya DNA) eşzamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bu protokolleri, insan immün yetmezlik virüsü (HIV)-1, insan T-lenfotropik virüsü (HTLV)-1, hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV), Zika virüsü (ZKV) ve influenza A virüsü (IAV) dahil olmak üzere çoklu viral patojenlerin yaşam döngülerini incelemek için uyguladık. Viral nükleik asitleri ve proteinleri çeşitli virüslerde etkili bir şekilde etiketleyebileceğimizi gösterdik. Bu çalışmalar bize çoklu viral sistemlerin gelişmiş mekanik anlayışını sağlayabilir ve ek olarak, DNA, RNA ve proteinin çok katlı floresan görüntülemesinin geniş bir hücresel sistem spektrumunda uygulanması için bir şablon görevi görebilir.

MICDDRP'nin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. DNA ve RNA'nın etiketlenmesini immün boyama izler. Dallanma yükselteçlerinin kullanımı sinyali arttırır ve tek nükleik asit moleküllerinin tespit edilmesini sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg"> Şekil 1: MICDDRP şeması ve adım adım iş akışı. (A) bDNA sinyali, viral DNA (1) ve...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infectio

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

single-cell-multiplexed-fluorescence-imaging-to-visualize-viral

Research

JoVE Journal

Biology

2.7K Görüntüleme.  Emory University School of Medicine. Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Video: Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biyoloji

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Viral Enfeksiyon Üzerine m6A ve m5C Epitranscriptomes'i Keşfetmek: HIV ile Bir Örnek

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...