Prototip von Frey filamentlerini geliştirdiği için Thomas Wang'a, mekanik prob testini geliştirdiği için Patrick J. Huang'a, kontrol için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne(w1118)ve ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP sinek stoklarına ve Galko laboratuvar üyelerine el yazmasını eleştirel bir şekilde okuduklarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma R21NS087360 ve R35GM126929 tarafından MJG'ye desteklendi.

1. Mekanik prob yapımı
<ol><li>Her nitinol filamentini (Şekil 1B), uzun eksenine dik olarak, küçük bir tel kesici (Şekil 1C) kullanarak belirtilen uzunluğa (Şekil 1M-N) kesin. Filamentler önceden ayarlanmış üç farklı çapta gelir (Şekil 1B). NOT: Burada belirtilen uzunluklar, montajın inşası için benzer bir protokol kullanarak belirtilen yaklaşık basınçları elde etmek için bir kılavuzdur. Sonuç olarak, filament kesiminin uzunluğuna ve montajdaki deliğin derinliğine bakılmaksızın, filamentler tam kuvvet / basınç değerini elde etmek için bir denge üzerinde ölçülmeli / kalibre edilmelidir.</li>
	<li>Larvaların cildinde doku hasarına neden olabileceği ve kalibrasyona müdahale edebileceğinden keskin veya düzensiz kenarların kalmadığından emin olmak için filamentin ucunu stereomikroskop altında inceleyin.</li>
	<li>Keskin düzensizlikler devam edene kadar bir bileme taşı kullanarak mekanik probun keskin kenarlarını manuel olarak pürüzsüzleştirin(Şekil 1D).</li>
	<li>Hipodermik bir iğne kullanarak ahşap bir dondurma çubuğunun sonuna doğru bir delik açın (Şekil 1E) (bkz. Malzeme Tablosu). İğneyi dondurma çubuğunun yüksekliğinin en az yarısına yerleştirin (Şekil 1E). Bu, nitinol filamentinin yerleştirilmesi için bir oda oluşturur.</li>
	<li>Tek bir nitinol filamentine ahşap tutkal uygulayın (Şekil 1F) ve tutkal kaplı filamenti ahşap bir dondurma çubuğuna(Şekil 1G)iğne yuvasına yerleştirin. ~5 saat kurumaya bırakın.</li>
	<li>Her mekanik probu, mekanik prob bükülene kadar bir teraziye bastırarak kalibre edin(Şekil 1H-L). Bu, gram olarak kaydedilebilecek maksimum kuvvet noktasıdır. Filament çaplarına (önceden ayarlanmış) ve uzunluklara (kullanıcı tarafından belirlenen) bağlı olarak tam bir kuvvet ve basınç aralığı oluşturulabilir.</li>
	<li>Adım 1.6'da kaydedilen kütleyi f = ma formülünü kullanarak milinewton (mN) cinsinden kuvvete dönüştürün (Kuvvet kütleçekimsel ivme ile çarpılan kütleye eşittir). f: kuvvet; m: kütle; a: yerçekimsel ivme (9,8 m/sn2) (Şekil 1M).</li>
	<li>Son olarak, ölçülen kuvveti filament ucunun yüzey alanına bölerek kilopaskal (kPa) cinsinden hesaplanan kuvveti basınca (kuvvet/alan) dönüştürün (Şekil 1M). Alanı hesaplamak için, farklı nitinol filamentlerinin çapını inçten (0,04", 0,06" ve 0,08") santimetreye dönüştürün. Daha sonra πr2 (burada, r = nitinol filament yarıçapı) alanı belirler (bkz. Şekil 1M). Farklı çaplarda ve uzunluklarda filamentler kullanarak birden fazla prob hazırlamak, Drosophila larvaları için duyarlı aralığı kapsayan tam bir set oluşturacaktır (Örnek seti Şekil 1N'degösterilmiştir). NOT: Her mekanik probu en az 3-4 haftada bir kontrol edin. Basınç orijinal ölçüden % 3'± fazla saptığında, yeni bir mekanik prob üretilmelidir.</li>
</ol>2. Larvaların hazırlanması
<ol><li>25°C inkübatörde standart gıdalar üzerinde ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (duyusal nöronların hasarını görselleştirmek için) transgenes içeren larva soyu veya larvaları yükseltin. Tipik olarak, stoklar rutin olarak 18 ° C'de tutulur, ancak hem ebeveynler hem de larva yavruları deneyler için standart mısır unu yiyecekleri üzerinde 25 ° C'de yetiştirilir. NOT: Yetişkin sinekler (beş erkek ve on dişi, 1:2 oranı) yaklaşık 24 saat boyunca yumurtlamaya izin vermek için sinek şişelerinde tutulur. Yumurtlamadan sonraki zaman (AEL) yetişkinlerin çıkarıldığı zamandan başlar.</li>
	<li>Yaklaşık 96 saat yumurtlamadan sonra, larvaları içeren yumuşak sinek mamasına hafifçe musluk suyu fışkırtarak üçüncü başlangıç larvalarını toplayın. Yiyecekleri terk eden veya hiç ön veya arka spiracles olan gezgin larvalar, bu test için çok büyük / eskidir. İkinci instar larvaları (~ 4 mm'den daha kısa boy) çok küçüktür.</li>
	<li>Yumuşak sinek mamasının içeriğini temiz standart boyutta petri kabına (100 mm x 15 mm) dökün.</li>
	<li>Asaları kullanarak, orta üçüncü instar, orta büyüklükteki larvaları (bkz. Şekil 2A)daha küçük (ikinci instar ve erken üçüncü instar) veya daha büyük (geç veya dolaşan üçüncü instar) larvalardan sıralayın. Larvalara herhangi bir doku hasarını önlemek için asaletlerle nazik manipülasyon önerilir. NOT: Kümes uçları kullanılarak yapılan transfer çoğunlukla su gerilimine dayanır ve larvalara kanatların bıçaklarıyla basınç uygulayarak değil. Larvaların manevrası için forseps kullanımına bir alternatif yumuşak boya fırçalarıdır. Her iki araçla da, kullanıcı davranışsal ölçümleri zorlaştırabilecek istenmeyen doku hasarına neden olmamak için hayvanları aktarma alıştırması yapmalıdır.</li>
	<li>Orta üçüncü başlangıç larvalarını, kümes uçlarını kullanarak, oda sıcaklığında suyla nemlendirilmiş küçük bir sinek yemi fişi içeren küçük bir Petri kabına (30 mm x 15 mm) aktarın. Larvaları deneyler yapılana kadar küçük Petri kabında tutun, ancak 20 dakikadan uzun değil. NOT: Genellikle, 20-30 larvanın gıda fişine aktarılması, 20 dakikalık davranışsal tahliller için yeterli bir sayı verecektir.</li>
</ol>3. Mekanik nociception tahlil
<ol><li>Parlak bir alan stereomikroskopu altında ince bir siyah veya koyu vinil pedi üzerine üçüncü bir başlangıç larvası (kümesps kullanarak) yerleştirin. Koyu renk, larvaların görselleştirilmesini geliştiren kontrast sağlar. Serbestçe hareketli bir koyu vinil parçasına sahip olmak tercih edilir, çünkü kullanıcının larvaya dokunmadan veya zarar vermeden hizalamasını sağlar.</li>
	<li>Optik fiber ışıkları mikroskop objektif lensler ile siyah veya koyu vinil ped arasına koyun; bu, larvayı görmek için yeterli yüksek kontrastlı aydınlatmaya izin verecektir.</li>
	<li>Ped'e transferden sonra normal hareketlenmeyen larvaları atın. Bunlar normal nosceptive davranışsal tepkiyi engelleyebilir. Normal hareket için, bkz: Video 1.</li>
	<li>Bir kağıt havlu kullanarak, larvaların vinil ped üzerinde yüzmesine neden olabilecek larvaları çevreleyen fazla suyu silin.</li>
	<li>Koyu vinil pedi hareket ettirerek larvayı yönlendirin. Sağ elini kullanıyorsanız larva başı/ağzı sola, solaksanız ise tam tersini göstermelidir(Şekil 2A–B).</li>
	<li>Seçilen mekanik probu, tipik olarak 1-2 s için, larvaların arka sırt tarafına yaklaşık karın segmenti A8'de uygulayın (bkz. Şekil 2B),prob bükülene ve önceden ölçülen basınç miktarını ortaya çıkarır (Şekil 2C). Probun larvaların dorsal yüzeyine bastırması ve larvaları prob teması noktasında alttaki ped içine sıkıştırması önemlidir. NOT: Nitinol filamentinin ucu ile dorsal lütikül-epidermisin arasındaki temas noktasında, 2.300 kPa'dan daha düşük problar, esas olarak lütikül ve alttaki dokulara nüfuz etmeden bükülür. Bu tür problar nadiren larva mortalitesini etkiler4. Daha yüksek basınçlarda (>5.000 kPa) problar hem bükülür hem de bazen manikül ve alttaki dokulara nüfuz eder. Larvaların delinmesi larva sağkalımını bozar4 ve gözlemlenirse, bu larvalar tipik olarak davranışsal analizden atılır.</li>
	<li>Her larva için davranışsal yanıtı kaydedin. Larva 3 s içinde vücudunun ekseni boyunca 360 ° 'lik tam bir rulo gösterirse pozitif bir nosceptif yanıt (Video 2) belirtilir. Diğer yanıtlar (dönmeye çalışmak, hızlı gezinmek ve kıpırdamak) bu tahlil amaçları için olumsuz olarak kabul edilir. NOT: Bir subthreshold mekanik uyaran (200 kPa) ile uyarılan larvalar tipik nosceptive veya yuvarlanan yanıtı ortaya çıkarmadı (Video 3). Bazı larvalar, hareket yönünde değişiklikler gibi hızlı ileri veya hafif dokunma tepkileri sergiledi.</li>
	<li>Larvaları atın ve bir sonrakini test için hazırlayın, 3.1 ile 3.7 arasında adımları tekrarlayın.</li>
	<li>İstenilen larva sayısına ulaşılana kadar 3.1-3.7 adımlarını tekrarlayın (her prob için burada üç ila altı n = 10 larva kümesi kullanılmıştır). NOT: Daha düşük basınçlı mekanik problar (174-462 kPa) kullanırken, test larva başına daha fazla zaman alacaktır. Bunun nedeni, daha uzun filamentlerin ucunun daha fazla salınarak larvaları A8 segmentinin merkezinde dürtmeyi zorlaştırır. Bu problarda pratik yapmak gereklidir.</li>
</ol>4. Nöronal morfolojiyi değerlendirmek için konfokal mikroskopi
<ol><li>Daha önce nitinol filamenti ile uyarılmış bir larvayı (duyusal nöronları etiketlemek için genotip ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP) bir Coplin kavanozunun içindeki bir eterizasyon odasına yerleştirin ve ~1 mL dietil eter ile ıslatılmış bir pamuk topu taşıyan 10 mL'lik bir beher içerir. Larvaların odada ~ 5 dakika oturmasına izin verin. NOT: Grubumuz tarafından yayınlanan önceki bir çalışmada eterizasyon için ayrıntılı bir protokolsağlanmıştır 12.</li>
	<li>Larvaları eterizasyon odasından küçük bir Petri kabına hafifçe durulayın.</li>
	<li>Hazır bir mikroskop slaytı, iki küçük kapak kılıfı (22 x 22 mm) ve bir uzun kapak parçası (22 x 54 mm) (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Slaytın her iki ucuna küçük eter damlaları ekleyin:yağ çözeltisi (1:5 etil eterin halokarbon yağı çözeltisine oranı, bkz. Malzeme Tablosu)ve ardından küçük kapakları küçük damlacıkların üzerine yerleştirin. Bu düzenleme larvaların sığabileceği küçük bir alan boşluğu oluşturur. NOT: Küçük kapakları mikroskop kaydırana karşı, kayması zor olana kadar bastırın.</li>
	<li>Mikroskop slaydının ortasına bazı eter damlaları:yağ çözeltisi ekleyin ve ardından larvaları forseps kullanarak mikroskop slaytının ortasına (küçük kapaklar arasına) yerleştirin. Larvaların anteroposterior ekseninin slaytın kısa tarafına paralel olduğundan ve sırt tarafının yukarı dönük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Larvaları, larvaların üzerine yerleştirilen uzun kapakla ve iki küçük kapakla örtün. NOT: Larva neredeyse düz olana kadar uzun kapak zarını cömertçe bastırın.</li>
	<li>Lazer dalga boyu 488 (GFP) kullanarak konfokal mikroskop kullanarak larvaların görüntü segmenti A8 (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Eter yoluyla anestezi hızlı bir şekilde kaybolacağından (~5-10 dk) ve larva uyanıp hareket edeceğinden larvaları hemen görüntüleyin, bu da daha fazla görüntülemeyi zorlaştıracaktır.</li>
	<li>1x yakınlaştırmada 20x sayısal diyafram açıklığı (NA) 0,7 kuru objektif lens kullanarak 1024 x 1024 piksel çözünürlükte Z yığını görüntüler yakalayın, adım boyutu 1,5 μm.</li>
</ol>5. Doku hasarının niceliği
<ol><li>Bölüm 4.8'deki Z serisi yığın görüntülerini toplayın ve tek bir Z projeksiyonuna dönüştürün (farklı odak düzlemelerde çekilen birden fazla görüntünün düzleştirerek tek bir bileşik görüntüye dönüştürülmesi). Bu, piyasada bulunan yazılımlar (örneğin, Olympus Fluoview) veya fiji/Image J gibi herhangi bir eşdeğer açık kaynak platformu kullanılarak gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Görüntü analiz programı Fiji/ImageJ'yi açın.</li>
	<li>Menü çubuğundan Dosya'yı tıklatın ve görüntülenen pencereden Aç'ı seçin.</li>
	<li>Analiz edilecek TIFF biçiminde kaydedilmiş depolanan tek görüntü projeksiyonu seçin.</li>
	<li>Menü çubuğundan Düzenle 'yitıklatın ve görüntülenen pencerede Ters Çevir seçeneğini belirleyin.</li>
	<li>Menüçubuğundan Görüntü 'ye tıklayın, sonra görüntülenen pencereden Ayarla 'yı seçin ve son olarak Parlaklık/Karşıtlık seçeneğini belirleyin.</li>
	<li>Boşluğun alanını ölçmek için araç çubuğundan Serbest Şekil seçeneğini belirleyin (varsa).</li>
	<li>Menü çubuğundan Çözümle'ye tıklayın ve Ölçü seçeneğini belirleyin. Bu, boşluğun veya yaranın alanını gösterecektir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">Painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li><li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pickpocket+is+a+DEG/ENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae.">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).</li><li>Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+chemical+nociception+in+Drosophila+larvae.">An assay for chemical nociception in Drosophila larvae.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).</li><li>Lopez-Bellido, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+signaling+regulates+mechanical+nociception+in+flies+and+vertebrates.">Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates.</a> Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+and+neuromodulatory+feedback+facilitate+Drosophila+mechanonociceptive+behavior.">Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).</li><li>Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Drosophila+Piezo+in+mechanical+nociception.">The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception.</a> Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization.">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li><li>Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-induced+cold+sensitization+in+Drosophila+larvae+involves+behavioral+shifts+that+require+the+TRP+channel+Brv1.">Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1.</a> PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).</li><li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila.">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> eLife. 4, 10735 (2015).</li><li>Cervero, F., Merskey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+noxious+stimulus.">What is a noxious stimulus.</a> Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).</li><li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae.">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).</li><li>Follansbee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+nociceptive+sensitization+requires+BMP+signaling+via+the+canonical+SMAD+pathway.">Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway.</a> Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).</li><li>Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+insulin+receptor+regulates+the+persistence+of+injury-induced+nociceptive+sensitization.">Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (5), (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+caspase+activity+is+required+independently+of+apoptosis+to+produce+active+TNF/Eiger+during+nociceptive+sensitization.">Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), 2786 (2017).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li><li>Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PPK26+in+Drosophila+larval+mechanical+nociception.">The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception.</a> Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).</li><li>Takagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+connectivity+of+homologous+command-like+neurons+mediates+segment-specific+touch+responses+in+Drosophila.">Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila.</a> Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Nitinol filamentlerinden üretilen özelleştirilmiş mekanik problar kullanarak yerleşik bir mekaniktest1,2,16'yı değiştirdik. Bu metal alaşım, Drosophila larvalarının büyüklüğüne uygun daha küçük çaplı filamentler kullanmamızı sağlar. Balıkçılık hattı tabanlı monofilamentler bugüne kadar sinek mekanik nosiception alanına hakimdir2,5,6,16. Nitinol filamentlerimiz yaklaşık ~3-5 ay boyunca şekillerini korur ve basıncı ölçer (deneyimlerimize göre). Nitinol filamentlerinin uzunluğunu ve çapını değiştirerek, kullanıcı alt gövdeden neredeyse eksiksiz bir yuvarlanma tepkisine kadar geniş bir basınç yelpazesi üretebilir. Özellikle, alt koruma probları yapmak daha küçük çaplı nitinol filamentleri ile daha kolaydır. Bu probları kullanarak, kuvvet yerine basıncın daha tutarlı nosifensif davranışsal yanıtlar ortaya çıkardığı bulundu4. Burada, iyi kurulmuş bir UV kaynaklı nosceptive duyarlılık modeli7,10,13kullanarak, bu filamentlerin mekanik aşırı duyarlılığı (asidiyans ve hiperaljezi) incelemek için de yararlı bir araç olduğunu gösteriyoruz.
Oltadan üretilen mekanik probların kullanılarak yapılan önceki çalışmalar davranışsal yanıt verme 2 , 6,16,17'debelirli bir değişkenliğe yol açmıştır. Bunu çeşitli faktörler hesaba katabilir. İlk olarak, basınç önemli değişken olduğundan, filament ucunun yuvarlatılmış ve keskin kenarları olmayacak şekilde kabarması kritik öneme sahiptir. İkincisi, deneylerin tekrarlanabilirliği için sadece kuvvet yerine basınç değerlerini raporlamak önemlidir, çünkü benzer kuvvetler üreten farklı mekanik problar farklı basınçlar ortaya çıkabilir4. Üçüncüsü, zararlı problar kullanarak larva başına sadece bir mekanik stimülasyon uygulamak önemlidir, çünkü bu tür problar epidermal4 ve duyusal nöronal seviyelerde doza bağımlı bir doku hasarı üretir (Şekil 2E). Doku hasarı indüklendikten sonra ikinci veya sonraki zararlı mekanik uyaran, etkilenen periferik duyusal nöronların işlevini bozabilir ve değiştirilmiş bir davranışsal yanıt ortaya çıkabilir. Başka bir çalışmada, zararlı mekanik problarla iki kez uyarılan larvalar çoğunlukla gelişmiş bir davranışsal yanıt gösterdi5, ilk zararlı mekanik uyaranın neden olduğu doku hasarından kaynaklanabilecek akut mekanik duyarlılık (hiperaljezi) gelişimini düşündürmektedir. Tersine, diğer yazarlar6, değişen davranışsal yanıtın nöronal dokunun hasarına / işlev bozukluğuna bağlı olabileceğini gösteren karışık (artmış veya azalmış) bir davranışsal yanıt bildirmiştir. Her larvayı sadece bir kez uyarmak, duyarlılık veya doku hasarından kaynaklanan davranışsal yanıtlardaki olası varyansı ortadan kaldırır. Dördüncüsü, önceki çalışmalara göre daha arka olan A8 segmentini mekanik olarak uyardık (tercih edilen alanlar A3–A4)2,5,16. A2 veya A8 segmentine uygulanan ~3.900 kPa ile 5.300 kPa arasındaki problar herhangi bir davranışsal farklılık göstermedi4. Ek olarak, A8, A2-A4 ile karşılaştırıldığında, daha düşük basınçlar (<300 kPa) üreten mekanik problarla uyarılması daha kolaydır, çünkü larva bu bölgede daha incedir ve böylece daha kolay sıkıştırılır. Diğer çalışmalar, larvaların arka ucunun zararlı mekanik stimülasyonunun (forseps ile tutulan sert bir böcek iğnesi tarafından teslim edildiğini) çoğunlukla averatif veya yuvarlanan bir yanıt yerine ileriye doğru hareket uyandırdığını göstermiştir18. Bu farklı davranışsal yanıt, kullanılan malzemelerin özelliklerindeki farklılıklardan (bükülebilir nitinol filament vs sıkıştırılamaz böcek pimi) veya larvalara verilen farklı basınçlardan kaynaklanabilir (böcek piminin basınç değeri bildirilmedi).
Drosophila larvaları için mekanik bir nosiception tahlilinin geliştirilmesi, alanın farklı mekanik duyusal iyon kanallarının ve sinir devrelerinin mekanik nociception 5 , 6,16,17'yearacılıkettiğini keşfetmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, mekanik aşırı duyarlılık (allodynia ve hiperaljezi) çalışması, diğer duyusal yöntemlerin duyarlı hale getirilmesine kıyasla geri kaldı - ısı7, 8,10,13,14, soğuk9ve kimyasal3. Bu gecikme kısmen, suprathreshold basınçlarına kadar uzanan tam bir tepki aralığı oluşturabilecek uygun mekanik probların yokluğundan kaynaklanıyor olabilir. Özellikle mekanik asidiyatı değerlendirmek için özel bir öneme sahip olan, yaralanmamış larvalardan aversif bir yuvarlanma tepkisi vermeyen alt gövde problarıdır. Geliştirilmiş mekanik problarımızın önemi, zararsız uyaranları (subthreshold ~174 kPa–200 kPa) veya düşük ila yüksek zararlı aralığı (suprathreshold ~225 kPa ila ~ 5.116 kPa) kapsayacak şekilde üretilebilmesidir. Burada, Drosophila larvalarının UV ışınlamadan sonra hem mekanik allodynia hem de mekanik hiperaljezi geliştirdiği nitinol von Frey benzeri filamentleri kullanarak gösteriyoruz. Mekanik duyarlılık, termal duyarlılıkla karşılaştırıldığında bazı farklılıklar gösterir. Mekanik duyarlılığın hem başlangıcı hem de zirvesi termal (ısı) duyarlılıkla karşılaştırıldığında daha erkendir (~4 h) (hiperaljezi için ~ 8 h ve allodynia için ~ 24 saat)7. Ek olarak, mekanik asidina ve hiperaljezi eşlik edendir (her ikisi de ~4 saat zirvede). Ayrıca, ısı duyarlılığı (allodynia ve hiperaljezi) daha sonraki zaman noktalarında tamamen çözülürken7, mekanik aşırı duyarlılık taban çizgisinin biraz üzerinde kalan uzun bir kuyruk sergiledi. Drosophila'daki soğuk duyarlılık, soğuk uyarılmış davranışlar9'da bir geçiş ve mekanik stimülasyonla gözlenmemiş bir fenomen olan yeni soğuk çağrışımlı davranışların ortaya çıkmasını içerir. Başlangıç, süre ve gözlemlenen davranışlardaki bu farklılıklar, her duyusal modalitenin farklı sinyal yolları tarafından kontrol edilebileceğini göstermektedir. Burada açıklanan duyarlılık testini Drosophila'da bulunan güçlü genetik araçlarla birleştirmek, gözlenen mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperalgezi) kesin bir genetik diseksiyonuna izin vermelidir.

Drosophila larvaları, farklı zararlı uyaranlara maruz kaldığında karakteristik bir aversif yuvarlanma davranışı sergiler: termal1, mekanik2ve kimyasal3. Bu davranış normal hareketten açıkça farklıdır. Burada mekanik nosiception ve mekanik duyarlılık değerlendirmek için kullanılabilecek geliştirilmiş bir mekanik tahlil açıklıyoruz.
Yeni bir çalışmada, nitinol telleri kullanarak von Frey benzeri filamentler imal ettik4. Farklı kuvvetler ve basınçlar uygulayan problar, her probu oluşturan nitinol tellerinin uzunlukları ve çapları değiştirerek yapılmıştır. Mekanik problar kalibre edildi ve ölçülen kuvvet değerleri (milinewton, mN cinsinden) her probun uç alanına göre basınca (kilopascal, kPa) dönüştürüldü4. Mekanik probların özel imalatı, prensip olarak mekanik aşırı duyarlılığı incelemek için yararlı olabilecek suprathreshold (225 kPa ila 5318 kPa) basınçlarına subthreshold (≤200 kPa) üretmemize izin verdi. Bu geliştirilmiş mekanik von Frey benzeri filamentleri kullanarak, basınç 4 Daha önce incelenen kuvvet2,5,6'nın aksine, Drosophila larvalarında aversif davranışsal yanıt verme ile daha tutarlı bir şekilde ilişkili olduğunu gösterdik. Burada açıklanan geliştirilmiş mekanik tahlil ayrıca, sineklerde ve sıçanlarda mekanik nosiception'ı düzenleyen bir yola işaret eden korunmuş bir Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) ile ilgili reseptör tirozin kinazını tanımlamaya yardımcı oldu4.
İki aşırı duyarlılık yöntemi olan mekanik asidina ve hiperaljezi, Drosophila larvalarında termal (ısı ve soğuk) ve kimyasal duyusal yöntemler 3,7 ,8,9,10ile karşılaştırıldığında nispeten yetersizdir. Bu muhtemelen zararsız uyaranlardan yüksek zararlı aralık 2,5,6'yakadar uzanan spesifik mekanik probların eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Drosophila larvaları doku hasarı yaşadıktan sonra tipik aversif yuvarlanma davranışını ortaya çıkarır normalde zararsız bir uyaran3,7 allodynia olarak adlandırılır. Tipik olarak zararlı bir uyarana abartılı bir yuvarlanma yanıtı hiperaljezi7olarak bilinir. Zararlı uyaranlar, doku hasarı ortaya çıkan ve noseptörleri aktive debilenler olarak tanımlanır11. Drosophila larvalarına teslim edilen zararlı uyaranlar bariyer epidermisine, periferik nosiseptif duyusal nöronlara3, 4,7veya her ikisine de zarar verir.
Bu yazıda, Drosophila larvaları için uygun olan von Frey benzeri mekanik probların nasıl özel olarak üretilir ve kalibre edilir. Ayrıca, Drosophila larvalarında mekanik nosiseptif yanıtları test etmek için bu probların nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Son olarak, Drosophila larvalarındaki doku hasarını takiben hem allodynia hem de hiperaljezi olmak üzere mekanik aşırı duyarlılık varlığını göstermek için bunları kullanarak bu probların yararını daha da gösteriyoruz (bkz. Temsili Sonuçlar).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540C</td>
			<td>Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black (Arkansas) bench stone</td>
			<td>Dan&#8217;s Whetstone</td>
			<td>SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C</td>
			<td>Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Any equivalent confocal microscope will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-816</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E138-500</td>
			<td>For anesthetizing larvae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherization chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Guide</td>
			<td>Schott AG</td>
			<td>A08575</td>
			<td>Schott Dual Gooseneck 23 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>FS-1670</td>
			<td>For transferring larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Aleene&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aleene&#39;s&#174; Wood Glue, formerly called (Aleene&#39;s All-Purpose Wood Glue) 
			https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graspable holder</td>
			<td>Loew Cornell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle 30G 1/2&#34;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1471286</td>
			<td>BD Precisionglide&#174; syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Zeiss) Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td>NT55-605</td>
			<td>Any equivalent microscope will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x40</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-224</td>
			<td>Tickness 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Globe Scientific Inc.</td>
			<td>1358Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Diagonal Cutter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S43981</td>
			<td>For cutting nitinol filaments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitinol filaments, Diameters: 0.004&#8221;, 0.006&#8221;, 0.008&#8221;</td>
			<td>Mailin Co</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fifteen pieces of each diameter of 12&#8221; length were ordered. 
			https://malinco.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piece of black vinyl</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td>35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td>Control strain for behavioral assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ppk-Gal4&#62;UAS-mCD8-GFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>8749</td>
			<td>Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved assay and tools for measuring mechanical nociception in drosophila larvae

Drosophila'da mekanik nosiception için yayınlanan tahliller, davranışların değişken değerlendirmelerine yol açmıştır. Burada, Drosophila larvaları, özelleştirilmiş metal nikel-titanyum alaşımları (nitinol) filamentleri ile kullanılmak üzere imal ettik. Bu mekanik problar, mekanik nosiception'ı ölçmek için omurgalılarda kullanılan von Frey filamentlerine benzer. Burada, bu mekanik probların nasıl oluşturulacağı ve kalibre edeceğinizi ve subthreshold'dan (zararsız veya zararlı olmayan aralık) suprathreshold (düşük ila yüksek zararlı aralık) uyaranlarına tam bir davranışsal doz-yanıtın nasıl oluşturulacağı gösterilmektedir. Probların yararını göstermek için Drosophila larvalarında doku hasarına bağlı aşırı duyarlılığı araştırdık. Drosophila larvalarında mekanik asidiya (normalde zararsız bir mekanik uyarana aşırı duyarlılık) ve hiperaljezi (zararlı mekanik uyarana abartılı yanıt verme) henüz kurulmamıştır. Normalde zararsız olan mekanik problar veya tipik olarak aversif bir davranış ortaya çıkan problar kullanarak, Drosophila larvalarının doku hasarından sonra mekanik aşırı duyarlılık (hem allodynia hem de hiperaljezi) geliştirdiğini gördük. Bu nedenle, burada gösterdiğimiz mekanik problar ve testler, mekanik aşırı duyarlılığın temel moleküler / genetik mekanizmalarını parçalamak için önemli araçlar olacaktır.

Mekanik olarak çağrıştırılan davranışları ortaya çıkarmak için nitinol filamentleri (Şekil 1A,N) kullanarak özelleştirilmiş mekanik problar geliştirdik ve bu probların temel(yaralanmayokluğunda) mekanik nociception'ı incelemek için kullanılabileceğini gösteren hem zararsız hem de zararlı mekanik probları kullanarak tam bir davranışsal doz yanıt eğrisi oluşturduk.
Davranışsal test sonuçlarımız, Drosophila larvalarına uygulandığında 200 kPa (~1,57 mN) (Şekil 1M)altında basınç uygulayan probların aversif bir yuvarlanma tepkisine neden olmadığını belirledi (Şekil 2D ve Video 3). Beklendiği gibi, bu subthreshold veya zararlı olmayan mekanik problar (175 kPa veya 200 kPa) görünür nöronal doku hasarı ortaya çıkarmadı (Şekil 2E). Hasara neden olmadıkları için, bu tür problar mekanik asidyayı (normalde zararlı olmayan mekanik uyaranlara aşırı duyarlılık) değerlendirmek için yararlı olabilir. Tersine, suprathreshold veya zararlı problar (462 kPa'dan 5.116 kPa'ya kadar), daha yüksek basınçların daha güçlü davranışsal tepkiler ortaya çıkardığı, doza bağlı bir şekilde artırılmış bir davranışsal yanıt(Şekil 2D)ortaya çıkarmıştır. Beklendiği gibi, suprathreshold mekanik basıncı da periferik duyusal nöronların kendi doz bağımlı doku hasarına neden oldu(Şekil 2E). Her grup için dört larvadan alınan ölçülen doku hasarı alanı(μm 2 ± standart sapmada) şu şekildeydi: 2.051,03 ± 703,81 (462 kPa), 5,102 .29 ± 1.004,67 (2.283 kPa) ve 12.238,83 ± 3.724,11 (5.116 kPa). Bu nedenle, 462 kPa'dan (~63 mN) daha büyük veya buna eşit basınçlar, aversif bir yuvarlanma tepkisini çağrıştırır (larvaların% 25'inde veya daha fazlasında) ve görünür nöronal doku hasarına neden olur (Şekil 2E), mekanik hiperaljeziyi (normalde zararlı mekanik uyaranlara aşırı duyarlılık) incelemek için uygun olabilir. Nosceptive mekanik problar (≥462 kPa) her zaman doku hasarına neden olur (n = 10, nitel olarak değerlendirilir) ancak her zaman averatif bir yuvarlanma tepkisine neden olmaz.
Mekanik aşırı duyarlılığı (allodynia ve hiperaljezi) değerlendirmek için, doku hasarına neden olmak için ultraviyole ışık (UV) ışınlama kullanan iyi kurulmuş bir Drosophila larva larva modeli kullandık7,12. Bu tahlil, termal nosceptif aşırı duyarlılık 8 ,9 , 10 ,13,14,15'ingenetik ve hücresel mekanizmalarınıparçalamayayardımcıolmuştur. UV tedavisinin mekanik allodyniaya neden olup olmadığını belirlemek için, orta üçüncü instar kontrolü (w1118) larvalar sahte ışınlandı veya UV ışınlandı (15-20 mJ / cm2) (Şekil 3A). Daha sonra larvalar, normalde subthreshold mekanik prob (200 kPa, 1.57 mN) ile tedavi sonrası 2 saat, 4 saat, 8 saat, 16 saat ve 24 saat davranışsal olarak test edildi. Larvaların yaklaşık % 20'si UV tedavisinden sonra 2 saat kadar erken yanıt verirken, % 50'si 4 saatte yanıt verirken, sırasıyla% 6.6 ve% 8.3 sahte UV ışınlanmış hayvanlara karşılık gelir (Şekil 3B). Bu, UV kaynaklı doku hasarının ışınlama sonrası 4 saatte mekanik allodyniaya neden olduğunu gösterir. Daha sonraki zaman noktalarında (8 h, 16 h ve 24 h) UV ile tedavi edilen larvaların davranışsal tepkisi% 16-20 yanıt veren aralığındaydı (her biri ortalama n = 3-6 10 larva kümesi), sahte ışınlanmış kontrol grubuna kıyasla (ancak istatistiksel olarak anlamlı değil) (yanıt verenlerin% 3-6'sı aralığında), ortalama ortalama n = her biri 10 larvadan oluşan 3-6 set) (Şekil 3B).
Mekanik hiperaljeziyi araştırmak için, normalde larvaların ~% 20'sinde (Şekil 2D) averaj tepkisine neden olan ve nöronal doku hasarına neden olan bir suprathreshold basıncı(462kPa, 3.63 mN) kullanılmıştır (Şekil 2E). 462 kPa probunun UV kaynaklı doku hasarı olan veya olmayan larvaların dorsal tarafına uygulanması (Şekil 3A). UV tedavisinden sonra 4 saat, 8 saat ve 16 h'de araştırılan larvaların, 4 h'nin davranışsal aşırı duyarlılığın zirvesi (~% 60 duyarlı) ile aversif yuvarlanma yanıtında önemli bir artış gösterdiğini bulduk; sahte UV ışınlanmış hayvanlar aversif yanıtın ~% 27'sini gösterdi (Şekil 3C). Mekanik asidiya benzer şekilde, UV ile tedavi edilen hayvanların 8 saat, 16 saat ve 24 saat davranışsal tepkisi (%36-%42 aralığında) tedavi edilmeyen larvalardan istatistiksel olarak ayırt edilemezdi (%20-%26 aralığında). Geç üçüncü instar aşamasındaki larvalar, orta üçüncü instar aşaması ile karşılaştırıldığında temel davranışsal tepkide hafif bir azalma göstermiştir. Bunun larvaların artan büyüklüğü (Şekil 2A) veya vücudu kaplayan kütikül kalınlığının artmasıyla olabileceğini vardır. Bu gerçek, gelişimin daha sonraki bir aşamasında UV tedavisinin, UV sonrası 4 h tedavide gözlemlendiği gibi neden daha fazla mekanik hassasiyete neden olmadığını açıklayabilir.
Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız Drosophila larvalarının UV kaynaklı doku hasarından sonra hem mekanik allodynia hem de mekanik hiperaljezi geliştirdiğini göstermektedir. Mekanik asidina ve hiperaljezinin en yoğun zamanı aynıdır, UV tedavisinden sonra 4 saat; bununla birlikte, mekanik hiperaljezi, mekanik asidina kıyasla daha yavaş taban çizgisine geri döndüğü için daha belirgin bir zamansal kuyruğa sahiptir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig01.jpg"> Şekil 1: Drosophila larvalarında mekanik nosiception değerlendirmek için Von Frey benzeri bir aletin geliştirilmesi. (A) Drosophila larvalarında mekanik nosikür üzerinde çalışmak için kullanılan mekanik bir probun resmi. (B) Nitinol filamentleri ve bağıl çapları göreli ölçeğe gösterilir. (C) Nitinol filamentlerini kesmek için kullanılan diyagonal tel kesicinin resmi. (D) Kesilen nitinol filamentinin keskin kenarlarının bir bileme taşı ile yumuşatılır. (E) Probun ahşap dondurma çubuğu sapına delik açmak için kullanılan hipodermik iğne. İğnenin ucunun, güvenli filament yerleştirme için sap çubuğunun en az yarısına ulaşması gerekir. (F–G) Nitinol filamentinin ekleme deliği ile ahşap bir dondurma çubuğu sapına yapıştırılarak bağlanması. (H–L) Mekanik probların bir teraziye bastırılarak kalibrasyonu. (M) Farklı mekanik problar tarafından üretilen kuvvet değerleri (mN olarak) ve basınç (kPa'da). Probları oluşturmak için kullanılan her nitinol filamentinin uzunluğu (P1–P10; P: prob) santimetre (cm) olarak ayrıntılı olarak açıktır. (N) 174 kPa ila 5.116 kPa arasında değişen eksiksiz bir mekanik prob setinin resmi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig02v2.jpg"> Şekil 2: Mekanik nociception tahlil: Von Frey benzeri filamentler, aversif yuvarlanma davranışının doz-tepki eğrisini oluşturur ve duyusal nöronlarda doku hasarına neden olur. (A) Drosophila larvalarının farklı aşamalarının (ikinci ve üçüncü instar) resimleri. Ölçek çubuğu: 2 mm. (B) Üçüncü instar Drosophila larvalarının dorsal görünümünün karikatürü. Kırmızı nokta, mekanik probun uygulandığı karın segmentini gösterir. T: torasik segment; A: karın segmenti. Diğer anatomik yerler etiketlenmiştir. (C) Test karikatürü: Larvanın sırt tarafına, aşağıdaki yüzeye doğru bükülene kadar mekanik bir prob uygulanır ve daha sonra 2 s boyunca tutulur. Basınç yeterince yüksekse, bu serbest bırakıldığında aversif bir yuvarlanma tepkisi ortaya çıkarır. (D) Davranışsal doz yanıtı; her mavi nokta, 10 hayvandan oluşan bir set içindeki mekanik stimülasyona aversif haddeleme ile yanıt veren larvaların yüzdesini temsil eder. Farklı mekanik problar tarafından indüklenen aversif yuvarlanma davranışının yüzdesinin keman arsası. kPa: kilopascals. Kutu çizimleri ortanca (yeşil), bıyıklar (kırmızı) 10. (E) Doku hasarı: Üçüncü instar larvaları (genotip ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP'nin noseptif duyusal nöronları etiketlemek için) belirtilen basınçlarla dorsal segment A8'de araştırıldı. Floresan etiketli eşleştirilmiş ddaC sınıfı IV duyusal nöronlar (sırt orta çizgisi boyunca) incelendi (bkz. bölüm 4 ve 5). Beyaz alanlar (kırmızı yıldız işaretleri) boşlukları veya doku hasarını temsil eder. Ölçek çubuğu: 100 μm. B panelinde larva dorsal görünümde gösterilirken, C'de yanal görünümdür. Larvaların dorsal lütikül-epidermis tarafına bastırılan mekanik problar, probun ucunun ve çevresindeki alanların temas noktasında cep gibi bir çöküstü üretir. Ventral tarafa doğru kavisli düz siyah çizgi cebin üstüdür, kesikli gri yanal çizgi ise yanal tarafı ve cebin altını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig03v2.jpg"> Şekil 3: UV hasarından sonra mekanik aşırı duyarlılık. (A) Duyarlılık test etmek için deneysel tasarımın şeması. Orta üçüncü instar sahte tedavi edildi (UV olmayan) veya UV ışınlandı. Mekanik nosiception tahlil daha sonra sahte tedavi veya ışınlama sonrasında farklı zaman noktalarında (2 saat, 4 saat, 8 saat, 16 saat ve 24 saat) gerçekleştirildi. (B) Mekanik allodynia: Sahte tedavi veya UV ışınlamadan sonra belirtilen zaman noktalarında normal bir subthreshold veya zararlı olmayan mekanik uyaran (200 kPa, 1.57 mN) ile problamadan sonra averajlı yuvarlanma sergileyen larvaların yüzdesi. (C) Mekanik hiperaljezi: Sahte tedavi veya UV ışınlamadan sonra belirtilen zaman noktalarında normalde suprathreshold veya zararlı mekanik uyaran (462 kPa, 3.63 mN) ile problamadan sonra aversif yuvarlanma gösteren larvaların yüzdesi. Hata çubukları ortalamayı gösterir +/- SEM. İstatistiksel analiz için iki kuyruklu eşleşmeyen t-testi kullanıldı: *p < 0.05, **p < 0.01; ns: önemli değil. Her kırmızı nokta, B ve C panellerinde, zaman noktası/koşul başına 10 larva, n = 3-6 setlerinin ortalama oranını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: Drosophila larvalarının normal locomotion. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_1_regresolu.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Video 2: Drosophila larvalarının zararlı mekanik uyarılması. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_2_regresol.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Video 3: Drosophila larvalarının mekanik stimülasyonunu subthreshold. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_3_Subthreshold_short.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Bu protokolün amacı, Drosophila larvalarında mekanik nosiception için geliştirilmiş bir tahlilin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Buradaki tahlilleri, Drosophila larvalarında mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperaljezi) var olduğunu göstermek için kullanıyoruz.

Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

an-improved-assay-tools-for-measuring-mechanical-nociception

Research

JoVE Journal

Behavior

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

4.7K Görüntüleme.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. Bu protokolün amacı, Drosophila larvalarında mekanik nosiception için geliştirilmiş bir tahlilin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Buradaki tahlilleri, Drosophila larvalarında mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperaljezi) var olduğunu göstermek için kullanıyoruz.

Video: An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Measuring Attentional Biases for Threat in Children and Adults

Investigators have long been interested in the human propensity for the rapid detection of threatening stimuli. However, until recently, research in this domain has focused almost exclusively on adult participants, completely ignoring the topic of threat detection over the course of development. One of the biggest reasons for the lack of developmental work in this area is likely the absence of a reliable paradigm that can measure perceptual biases for threat in children. To address this issue, we recently designed a modified visual search paradigm similar to the standard adult paradigm that is appropriate for studying threat detection in preschool-aged participants. Here we describe this new procedure. In the general paradigm, we present participants with matrices of color photographs, and ask them to find and touch a target on the screen. Latency to touch the target is recorded. Using a touch-screen monitor makes the procedure simple and easy, allowing us to collect data in participants ranging from 3 years of age to adults. Thus far, the paradigm has consistently shown that both adults and children detect threatening stimuli (e.g., snakes, spiders, angry/fearful faces) more quickly than neutral stimuli (e.g., flowers, mushrooms, happy/neutral faces). Altogether, this procedure provides an important new tool for researchers interested in studying the development of attentional biases for threat.

Here we describe a touch-screen visual search paradigm that can be used to study threat detection across the lifespan. The paradigm has already been used in various studies demonstrating that both children and adults detect threatening stimuli like snakes, spiders, and angry faces faster than non-threatening stimuli.

Çocuklarda ve Yetişkinlerde Tehdit Dikkat eksikliği önyargıları Ölçme

Investigators have long been interested in the human propensity for the rapid detection of threatening stimuli. However, until recently, research in this ...

Davranış

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure multiple dimensions of unconditioned behavior in small laboratory mammals (e.g., mice, rats, tree shrews and small primates). This paradigm is a valuable alternative for the use of a behavioral test battery, since a broad behavioral spectrum of an animal&#8217;s behavioral profile can be investigated in one single test.
The apparatus consists of a box, representing the &#8216;protected&#8217; area, separated from a group compartment. A board, on which small cylinders are staggered in three lines, is placed in the center of the box, representing the &#8216;unprotected&#8217; area of the set-up. The cognitive abilities of the animals can be measured by baiting some cylinders on the board and measuring the working and reference memory. Other unconditioned behavior, such as activity-related-, anxiety-related- and social behavior, can be observed using this paradigm. Behavioral flexibility and the ability to habituate to a novel environment can additionally be observed by subjecting the animals to multiple trials in the mHB, revealing insight into the animals&#8217; adaptive capacities.
Due to testing order effects in a behavioral test battery, na&#239;ve animals should be used for each individual experiment. By testing multiple behavioral dimensions in a single paradigm and thereby circumventing this issue, the number of experimental animals used is reduced. Furthermore, by avoiding social isolation during testing and without the need to food deprive the animals, the mHB represents a behavioral test system, inducing if any, very low amount of stress.

This protocol describes the modified hole board, which is a behavioral test set-up that comprises the characteristics of an open field and a traditional hole board. This set-up enables the differential analysis of unconditioned behavior of small laboratory mammals as well as the analysis of cognitive abilities.

Modifiye Delik Kurulu - Fareler ve Sıçanlarda Davranışı, Biliş ve Sosyal Etkileşim Ölçme

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

An Innovative Running Wheel-based Mechanism for Improved Rat Training Performance

This study presents an animal mobility system, equipped with a positioning running wheel (PRW), as a way to quantify the efficacy of an exercise activity for reducing the severity of the effects of the stroke&#160;in rats. This system provides more effective animal exercise training than commercially available systems such as treadmills and motorized running wheels (MRWs). In contrast to an MRW that can only achieve speeds below 20 m/min, rats are permitted to run at a stable speed of 30 m/min on a more spacious and high-density rubber running track supported by a 15 cm wide acrylic wheel with a diameter of 55 cm in this work. Using a predefined adaptive acceleration curve, the system not only reduces the operator error but also trains the rats to run persistently until a specified intensity is reached. As a way to evaluate the exercise effectiveness, real-time position of a rat is detected by four pairs of infrared sensors deployed on the running wheel. Once an adaptive acceleration curve is initiated using a microcontroller, the data obtained by the infrared sensors are automatically recorded and analyzed in a computer. For comparison purposes, 3 week training is conducted on rats using a treadmill, an MRW and a PRW. After surgically inducing middle cerebral artery occlusion (MCAo), modified neurological severity scores (mNSS) and an inclined plane test were conducted to assess the neurological damages to the rats. PRW is experimentally validated as the most effective among such animal mobility systems. Furthermore, an exercise effectiveness measure, based on rat position analysis, showed that there is a high negative correlation between the effective exercise and the infarct volume, and can be employed to quantify a rat training in any type of brain damage reduction&#160;experiments.

This study presents an innovative running wheel-based animal mobility system to quantify an effective exercise activity in rats. A rat-friendly testbed is built, using a predefined adaptive acceleration curve, and a high correlation between the effective exercise rate and the infarct volume suggests the protocol&#39;s potential for stroke prevention experiments.

Geliştirilmiş Rat Eğitim Performans Yenilikçi Running Tekerlek tabanlı Mekanizma

This study presents an animal mobility system, equipped with a positioning running wheel (PRW), as a way to quantify the efficacy of an exercise activity ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

Ateş, Drosophila modeli yetişkin tırmanma davranışı çözümlemek için bir otomatik hızlı yinelemeli negatif Geotaxis tahlil

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation in mouse models is a non-invasive and reproducible activity assay that is directly analogous to measures of patient ambulation such as the 6-minute walk test and related mobility scores. Many common methods for testing mouse ambulation speed and distance are based on the open field test, where an animal&#39;s free movement within an arena is measured over time. One major downside to this approach is that commercial software and equipment for high-resolution motion tracking is expensive and may require transferring mice to specialized facilities for testing. Here, we describe a low-cost, video-based system for measuring mouse ambulation that utilizes free and open-source software. Using this protocol, we demonstrate that voluntary ambulation in the dystrophin-null mdx mouse model for Duchenne muscular dystrophy (DMD) is decreased relative to wild-type mouse activity. In mdx mice expressing the utrophin transgene, these activity deficits are not observed and the total distance traveled is indistinguishable from wild-type mice. This method is effective for measuring changes in voluntary ambulation associated with dystrophic pathology, and provides a versatile platform that can be readily adapted to diverse research settings.

This protocol describes a flexible, low-cost system for measuring mouse ambulation in an open field activity assay. We show that a 6-minute ambulation assay based on this system detects a decrease in voluntary movement in mdx mice, and accurately distinguishes improvement in a muscle-specific rescue of these animals.

Ambulation kas distrofisi, fare modellerinde ölçmek için basit ve düşük maliyetli bir tahlil

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen distribution. It is also possible that aberrant behavior of oxygen-sensing neurons could induce hypoxia-like behavior in the presence of normal oxygen levels. In D. melanogaster, development at low oxygen levels results in inhibition of growth and sluggish behavior during the larval phases. However, these established manifestations of oxygen deficit overlap considerably with the phenotypes of many mutations that regulate growth, stress responses or locomotion. As result, there is currently no assay available to identify i) cellular hypoxia induced by a mutation or ii) hypoxia-like behavior when induced by abnormal neuronal behavior.
We have recently identified two distinctive behaviors in D. melanogaster larvae that occur at normal oxygen levels in response to internal detection of hypoxia. First, at all stages, such larvae avoid burrowing into food, often straying far away from a food source. Second, tunneling into a soft substratum, which normally occurs during the wandering third instar stage is completely abolished if larvae are hypoxic. The assay described here is designed to detect and quantitate these behaviors and thus to provide a way to detect hypoxia induced by internal damage rather than low external oxygen. Assay plates with an agar substratum and a central plug of yeast paste are used to support animals through larval life. The positions and state of the larvae are tracked daily as they proceed from first to third instar. The extent of tunneling into the agar substratum during wandering phase is quantitated after pupation using NIH ImageJ. The assay will be of value in determining when hypoxia is a component of a mutant phenotype and thus provide insight into possible sites of action of the gene in question.

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

The protocol describes a simple assay to identify Drosophila melanogaster larvae that are experiencing hypoxia under normal atmospheric oxygen levels. This protocol allows hypoxic larvae to be distinguished from other mutants that show overlapping phenotypes such as sluggishness or slow growth.

Bir oyuk/tünel tahlil için algılama hipoksi Drosophila melanogaster larva içinde

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two behavioral components: a reluctance to avoid humans (passive tameness) and a motivation to approach humans (active tameness). To quantify these components in mice, we previously developed behavioral tests for active tameness, passive tameness, and the willingness to stay on a human hand, each designed to be completed within 3 min. The data obtained were used for selective breeding, with a large number of mice analyzed per generation. The active tameness test measures the movement of the mouse toward a human hand and the contact it engages in. The passive tameness test measures the duration of time that a mouse tolerates human touch. In the stay-on-hand test, a mouse is placed on a human hand and touched slowly using the thumb of that hand; the duration of time that the animal remains on the hand is measured. Here, we describe the test set-up and apparatus, explain the procedures, and discuss the appropriate data analysis. Finally, we explain how to interpret the results.

Tameness in animals includes a reduction of avoidance responses to humans (passive tameness) and an increase in active approaches to humans (active tameness). Here, we describe detailed protocols for three behavioral tests (active tameness, passive tameness, and stay-on-hand tests) to separately measure the active and passive tameness of mice.

Aktif ve pasif Tameness ayrı olarak farelerde ölçme

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two ...

Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities

A crayfish is a pivotal aquatic organism that serves both as a practical biological model for behavioral and physiological studies of invertebrates and as a useful biological indicator of water quality. Even though crayfish cannot directly specify the substances that cause water quality deterioration, they can immediately (within a few seconds) warn humans of water quality deterioration via acute changes in their cardiac and behavioral activities.
In this study, we present a noninvasive method that is simple enough to be implemented under various conditions due to a combination of simplicity and reliability in one model.
This approach, in which the biological organisms are implemented into environmental evaluation processes, provides a reliable and timely alarm for warning of and preventing acute water deterioration in an ambient environment. Therefore, this noninvasive system based on crayfish physiological and ethological parameter recordings was investigated for the detection of changes in an aquatic environment. This system is now applied at a local brewery for controlling&#160;quality of the water used for beverage production, but it can be used at any water treatment and supply facility for continuous, real-time water quality evaluation and for regular laboratory investigations of crayfish cardiac physiology and behavior.

This article presents a noninvasive biomonitoring system for the continuous recording and analyses of crayfish cardiac and locomotor activities. This system consists of a near-infrared optical sensor, a video-tracking module, and software for evaluating crayfish heartbeats that reflects its physiological condition and characterizes crayfish behavior during heartbeat fluctuations.

Kerevit kardiyak ve davranışsal faaliyetlerinin sürekli noninvaziv ölçme

A crayfish is a pivotal aquatic organism that serves both as a practical biological model for behavioral and physiological studies of invertebrates and as ...

Measuring the Functional Abilities of Children Aged 3-6 Years Old with Observational Methods and Computer Tools

The analysis of functional abilities and their development in early childhood (0-6 years old) are fundamental aspects among young children with certain types of developmental difficulties that can facilitate prevention, through programmed interventions adapted to the needs of each user (student or patient). There are, however, few investigations to date, that have analyzed the use of automated tools for recording and interpreting the results of the initial assessment. Here, a protocol is presented to examine the functional abilities in early childhood in young children, aged between 3-6 years old, with intellectual disabilities, but the protocol can also be used for ages 0 to 6 years. The protocol makes use of a computer application, eEarlyCare, that facilitates the interpretation of the results of systematic observations, which are recorded in natural environments by professionals trained in early intervention. The software can be used to analyze 11 functional areas (Food Autonomy, Personal Care and Hygiene, Dressing and Undressing Independently, Sphincter Control, Functional Mobility, Communication and Language, Daily Life Routines, Adaptive Behavior and Attention) and a total of 114 different behaviors. Its use facilitates the analysis of the observed abilities and greatly assists early intervention. Compared to other observational methods, it allows a more efficient use of personal and material resources. The use of the computer application facilitates the recording of the observation results, which helps with organization and reflection on the observations. The software displays the observation results on-screen compared to normal developmental parameters. This information can be referred to for decision-making about the most suitable intervention program for each user (student or patient). Likewise, clustering techniques are applied to analyze the relation between the type of intellectual disabilities and functional development identified with the software, a relation that is intended to serve as a guide for early-care professional intervention.

We present a protocol to use a computational tool to record and analyze the functional abilities of children aged 3-6 years old. The protocol facilitates the comparison of these abilities throughout their development and can be used to assess developmental difficulties.

3-6 Yaş Arası Çocukların İşlevsel Yeteneklerini Gözlemyöntemleri ve Bilgisayar Araçları ile Ölçme

The analysis of functional abilities and their development in early childhood (0-6 years old) are fundamental aspects among young children with certain ...

An Experimental Paradigm for Measuring the Effects of Ageing on Sentence Processing

Previous studies have found that older adults have greater difficulties in processing syntactically complex sentences than younger adults. However, the exact regions where the difficulties arise have not been fully identified. In this study, a maze task was implemented to investigate how older adults and younger adults differentially processed two types of sentences with different levels of syntactic complexity, namely subject relative clauses and object relative clauses. Participants were asked to choose between two alternatives at each segment of the sentences. The task required participants to engage in a strictly incremental mode of processing. The reading times for each segment were recorded, allowing the quantification of the difficulty of sentence reading. The task allowed us to identify the exact locations of the processing difficulty and thus facilitate a more accurate assessment of the age-related decline in sentence processing. The results indicate that the effect of ageing was found mainly at the head nouns, but not at other regions of the sentences, a finding which suggests that the maze task is an effective method to identify the exact location of the ageing effect on sentence processing. The implications of this experimental paradigm for investigating the effect of ageing on sentence processing are discussed.

Here, we present a protocol to examine the age-related decline in sentence processing using a maze task that allowed us to localize the processing difficulty at each word of the sentences during reading.

Yaşlanmanın Cümle İşleme Üzerindeki Etkilerini Ölçmeye Yönelik Deneysel Bir Paradigma

Previous studies have found that older adults have greater difficulties in processing syntactically complex sentences than younger adults. However, the ...