Bu çalışma, sadece mikroakışkan bir sistemde doğrudan akım darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral öncül hücrelerin farklılaşması için bir protokol sunun. Bu teknik, deneysel kurulum süresini, örnek hacmi ve reaktif hacmini azaltmak için yararlı bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, MOE çipi konfokal mikroskopi gözlemleri için uygundur.
Basit doğru akım darbe tedavisi fare sinirsel öncül hücrelerin kaderini kontrol edebilir ve sinir sistemi bozuklukları için terapötik stratejiler geliştirmek için kullanılabilir. Başlamak için, uygun yazılımı kullanarak tek tek PMMA katmanları ve çift taraflı bant için desenler çizin. Karbondioksit lazer katipini aç ve kişisel bir bilgisayara bağla.
Yazılımı kullanarak tasarlanmış desen dosyasını açın. PMMA levhalarını veya çift taraflı bandı lazer katibinin platformuna yerleştirin, ardından otomatik odaklama aracını kullanarak lazeri PMMA levhalarının yüzeyine veya çift taraflı bant üzerine odaklayın. Yazıcı olarak lazer katibi seçin, ardından PMMA sayfasında veya çift taraflı bantta doğrudan ablasyonu başlatmak için lazer katibi kullanın.
Koruyucu filmi PMMA levhalarından çıkarın ve azot gazı kullanarak yüzeyi temizleyin. Birden fazla PMMA levha katmanını birleştirmek için, bir milimetre PMMA levhadan üç parça istifleyin ve akış veya elektrik stimülasyon kanalı montajını oluşturmak için 110 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir termal bonder'da santimetrekare başına beş kilogram basınç altında yapıştırın. Hızlı etkili siyanoakrilat tutkallı MOE talaş tertibatının birinci katmanındaki ayrı açıklıklara 12 parça adaptör yapıştırın.
Çipi monte etmeden önce 30 dakika boyunca ultraviyole ışınlama kullanarak bir milimetre PMMA substratlarını, çift taraflı bandı ve üç milimetre optik sınıf PMMA'yı dezenfekte edin. PMMA montajını tamamlamak için üç milimetre optik sınıf PMMA'daki bir milimetre PMMA substratlarını çift taraflı bantla yapıştırın. Temizlenmiş örtü örtüsünü çift taraflı bantla PMMA tertibatine yapıştırın.
Agar köprüsü adaptörlerinin açıklıklarını beyaz parmakla sıkı fişlerle kapatın. Düz alt konektörü orta giriş ve çıkış adaptörleri aracılığıyla MOE talaş tertibatine bağlayın, ardından koni Luer adaptörünü üç yönlü stopcock'lara bağlayın. Orta girişin üç yönlü stopcock'una bağlanan üç mililitrelik bir şırınna kullanarak iki mililitre% 0,01 PLL çözeltisi ekleyin ve orta çıkışın üç yönlü stopcock'una boş bir üç mililitre şırınna bağlayın.
Hücre kültürü bölgelerini PLL çözeltisi ile doldurun ve kaplama solüsyonunun ileri geri yavaşça pompalasının. Çözeltiyi kültür bölgelerinde kapatmak için iki üç yönlü stopcock'u kapatın. MOE çipini%5 karbondioksit atmosferiyle dolu bir inkübatörde bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır.
İki şırınna kullanarak kaplama solüsyonunu kanala ileri geri manuel olarak pompalayarak iki üç yönlü stopcock'u açın ve kanallardaki kabarcıkları boşaltın. Orta girişin üç yönlü stopcock'una bağlanan üç mililitrelik bir şırınna üç mililitrelik tam orta çizin ve hücre kültürü bölgelerindeki kaplama çözeltisini değiştirmek için ekleyin. Beyaz parmakla sıkı fişi Luer adaptörüyle değiştirin ve adaptörü doldurmak için %3 sıcak agarose enjekte edin.
Luer kilit şırıngasını Luer adaptörüne bağlayın ve Luer kilit şırıngasını doldurmak için siyah kauçuk nargileden% 3 sıcak agarose enjekte edin. Agarose'un soğuması ve katılaşması için 10 ila 20 dakika bekleyin. Hücre tohumlu MOE çipini, 37 santigrat derecede tutulan programlanabilir bir XYZ motorlu sahneye tutturulmuş şeffaf ITO ısıtıcısına takın.
MNPC'leri orta çıkış üzerinden MOE çipine manuel olarak pompalayarak aşıleyin, ardından ito ısıtıcısındaki hücre tohumlu MOE çipini dört saat boyunca kuluçkaya bırakın. Çip üzerindeki elektrotlar aracılığıyla MOE çipine bir EF çoklayıcı bağlamak için elektrik kablolarını kullanın. Kare dalga DC darbelerini çıkarmak için bir EF çoklayıcı ve bir fonksiyon üreteciyi bir amplifikatöre bağlayın.
MOE çipi üzerindeki tüm düz alt konektör ve adaptörleri çıkarın ve adaptörleri PBS ile doldurun, ardından adaptör açıklıklarını parafilm ile kapatın. İmmünasyondan sonra, konfokal floresan mikroskop kullanarak hücreleri gözlemleyin. DC darbe stimülasyonu, kök hücre bakım ortamında eşzamanlı mNPC'lerin nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaşmasına neden oldu.
Kontrol grubunda ve stimülasyon grubunda nöron, astrosit ve oligodendrositlerin yüzdeleri burada gösterilmiştir. DC nabız tedavisinden sonra, MNPC'ler DIV yedide önemli sayıda nöron, DIV üç'te astrositler ve DIV yedi ve DIV 14'te oligodendrositler stimülasyon gruplarında kontrol grubuna göre nispeten daha yüksek seviyelerde mevcuttu. MNPC farklılaşması başlatmak için 30 ila 40 hücrenin oluşturduğu nörosferler tercih edilir.
MNPC'lerin aşırı büyümesi, farklılaşma sürecinde hücre sağkalımını bozacaktır.
