Yazarlar Vanessa Meldener-Harrell'e makalenin eleştirel okuması için teşekkür eder.

Farelerin kum sineği beslemesi için kan kaynağı olarak kullanılması, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol, NIAID, NIH Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası LPD 68E) tarafından onaylandı. Omurgasızlar NIH yönergeleri kapsamında değildir.
1. İğne hazırlama (Şekil 1)
<ol><li>Meuti ve Harrell19'daaçıklandığı gibi iğneleri ve eğimi çekin. Kısaca, borosilikat cam kılcal damarları kullanarak çift aşamalı bir cam mikropipette çekme üzerine iğneler çekin.</li>
	<li>Ekstra ince bir taş kullanarak mikropipette eğimli ıslak eğimli iğneleri keskinleştirin.</li>
</ol>2. Embriyo toplanması ve mikromanipülasyonu (Şekil 2)
<ol><li>Enjeksiyon gününden beş gün önce, koloni bakımı için rutin olarak gerçekleştirilen kan besleme kumu dişileri siner. Kum sineği kolonilerinin yetiştirme prosedürleri ve gerekli malzeme hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen Avukat ve ark.1 Böcekleri tüm gelişimleri sırasında% 70 nemde ve 26 ° C'de inkübatörlerde saklayın.<ol>
<li>Bir gün kan besleme sonrası, kanla beslenen dişileri yan portlu alçı kaplarda 100-150 kişilik gruplar halinde yakalayın. Dişileri, koloni bakımı için olağan olan şeker çözeltisi (% 30 sakkaroz - küçük bir pamuk toplarını ıslatmak için yeterli hacim) ile besleyerek koruyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kan besleme sonrası 2-3 gün, alçı kapları nemlendirmeyin. Dişileri kuru bir substrat üzerinde tutmak erken yumurtlamayı önleyecektir, çünkü dişiler nemli bir ortama yumurta bırakmayı tercih eder.</li>
	<li>Kan besleme sonrası 5. günde embriyo toplama, mikromanipülasyon ve mikroenjeksiyonu gerçekleştirin. Yumurtlama odasına nemli bir filtre kağıdı sokun. Yeni döşenmiş embriyolar tam olarak gelişmiş bir korona sahip değildir ve beyaz görünür. Beyaz embriyoların görselleştirilmesini kolaylaştırmak için işlem sırasında siyah filtre kağıdı kullanın.</li>
	<li>Küçük bir grup dişiyi alçı tencereden bir ağız aspiratörü kullanarak yan bağlantı noktalarından yumurtlama odasına aktarın. Nemli bir substratın (filtre kağıdı) varlığı dişileri oviposit'e teşvik eder.</li>
	<li>30-60 dakika sonra, filtre kağıdını odadan yeni döşenen embriyolarla dikkatlice alın. Filtre kağıdını ve embriyoları petri kabında 3 saate kadar saklayın. Bu süre zarfında, nemli kalmasını sağlamak için filtre kağıdının nem seviyesini düzenli olarak değerlendirin. Bu süre zarfında, yeni kadın gruplarıyla 2.4 ila 2.6 adımlarını tekrarlayın ve mümkün olduğunca çok embriyo toplayın.</li>
	<li>Enjeksiyon için mikroskop slaytları hazırlayın: yumurtaları çok ince bir boya fırçasıyla tek tek manuel olarak toplayın ve cam kapaklı bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirilmiş başka bir nemli siyah filtre kağıdına dikkatlice aktarın.<ol>
<li>Filtre kağıdına su ekleyin, embriyoları nemli tutmaya yetecek kadar, ancak kapak kapağından uzaklaşmalarına veya örtünün altına çekilmelerine neden olmaz. Embriyoları kapak çizgisine göre hizala. Kapak, enjeksiyon sırasında yumurtaların yuvarlanmasını önleyen bir backstop görevi görür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Embriyo Enjeksiyonları (Şekil 3)
<ol><li>Enjeksiyonları yumurta toplamanın başlamasından 2,5 ila 3 saat sonra başlatın. Enjeksiyonları oda sıcaklığında ve ortam laboratuvarı nemsinde gerçekleştirin.</li>
	<li>Hizalanmış embriyoların yeterli suya sahip olduğundan emin olun, böylece nemli tutulurlar. NOT: Enjeksiyonlar sırasında embriyoların nemli tutulması kritik öneme sahiptir. Enjeksiyon işlemi sırasında nemli değillerse, iğne embriyoyu delmede sorun yaşadığı için enjeksiyonlar zorlaşır. Doğru miktarda su, embriyoların etraflarında bir menisküs su olduğu noktadır, ancak kapak kapağı suyun üzerinde yüzerek embriyoların örtünün altına itmesine neden olmaz. Enjeksiyonlar sırasında embriyoların etrafındaki su miktarını izlemek önemlidir. Embriyoları nemli tutmak için gerektiği kadar su ekleyin.</li>
	<li>Bir fırçayı suyla ıslatarak ve suyu filtre kağıdının arka ucuna aktararak dikkatlice su ekleyin. Bu şekilde su eklemek, suyun yavaş ve kontrollü bir şekilde eklenmesini sağlar, böylece embriyoları nemli tutacak kadar eklenir. Çok fazla su embriyoların hizadan çıkmasına neden olabilir ve bu da embriyoların enjekte edilmesine neden olabilir.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon iğnesine geri yük enjeksiyonu karışımı. Elle çizilmiş bir borosilikat iğne dolgusu kullanarak iğneye yaklaşık 0,5 ila 1 μL enjeksiyon karışımı ekleyin, jel yükleme pipet uçları da kullanılabilir. Enjeksiyon karışımı, ticari rekombinant Cas9 proteini (300 ng/μL) ile karıştırılmış belirli bir lokusu hedeflemek için tasarlanmış bir veya birkaç kılavuz RNA'dan (her biri 80 ng/μL) oluşur.</li>
	<li>30 psi'deki enjeksiyon basıncından başlayarak, iğnenin ucundaki havayı dışarı çıkarmak için enjeksiyon tetiğine basın. Bu, enjeksiyon karışımını iğnenin ucuna zorlayacak ve enjeksiyon karışımının akmasını sağlayacaktır. Bu noktada, enjeksiyon malzemesi akmaya başlayana kadar tutma/sabit basıncı yavaşça artırın, ardından iğneden akan enjeksiyon karışımının noktasının hemen altında olacak şekilde tutma/sabit basıncı geri çekilin. Kapılı ayar, embriyoya girmek için az miktarda malzeme görülebilmesi için yeterli enjeksiyon malzemesi sağlamalıdır. NOT: Drosophila ve sivrisinekler için kullanılan diğer protokollere benzer şekilde halokarbon yağı altında kum sineği embriyolarının enjeksiyonu başlangıçta test edildi, ancak bu enjeksiyonların hayatta kalma yüzdesi çok düşüktü. Sağkalım, yukarıda açıklandığı gibi nemli filtre kağıdına enjeksiyonlara geçilerek iyileştirildi.</li>
	<li>İğneyi embriyonun yanına yerleştirin. Embriyonun arkasındaki kapak kapağını, iğnenin embriyoyu delmesine yardımcı olacak bir backstop olarak kullanın. İğneyi hafifçe çıkarmadan önce embriyoya az miktarda enjeksiyon karışımı sunun.</li>
	<li>İğne çıkarıldıktan hemen sonra, iğne ucundan doldurulan herhangi bir malzemeyi çıkarmak için enjektöre basın. Bu, iğnenin tıkanmasını önlemeye yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Bir sonraki embriyoya geçin. Her enjeksiyon arasında filtre kağıdının nemli olduğundan ve iğnenin tıkanmamasını sağlayın.</li>
	<li>Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, bir çetele tutmak için enjekte edilen embriyo sayısını sayın.</li>
	<li>Kapak kapağının yüzmesi için filtre kağıdına su ekleyerek kapak kapağını çıkarın. Bu noktada, kapak sapını enjekte edilen embriyolardan uzaklaştırmak için bir parmak kullanılırken filtre kağıdını yerinde tutmak için bir prob (ucuna yapışmış böcek pimli ahşap aplikatör çubuğu) kullanın.</li>
	<li>Kapak kapağı çıkarıldıktan sonra fazla suyu filtre kağıdından silin.</li>
</ol>4. Enjeksiyon sonrası yetiştirme (G0) (Şekil 4)
<ol><li>Filtre kağıdını, nemi korumak için bir Petri kabına yerleştirilmiş birkaç nemli filtre kağıdı katmanının üzerine embriyolarla birlikte aktarın. Diğer embriyoları enjekte etmek için gereken süre boyunca embriyoları burada tutun. Embriyolar bunun gibi en fazla 3 saat tutulabilir. Enjeksiyondan sonra yavaşça kahverengiye dönerler.</li>
	<li>Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, manuel olarak daha önce nemlendirilmiş küçük boyutlu alçı kaplara aktarın. Bireyler arasında olası mantar kirlenmesini önlemek için her tencereye çok fazla embriyo koymayın ve aralarındaki mesafeyi koruyun. Saksıları bir ekranla örtün ve tüm gelişimleri sırasında% 70 nemde ve 26 ° C'de inkübatörlerde tutulan kum sineği koloni yumurtaları için tipik olarak yapılacağı gibi saklayın.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonraki 1. günde, tüm hasarlı ve ölü embriyoları bir boya fırçasıyla çıkarın. Mantar kontaminasyonunu sınırlamak için enjekte edilen embriyoları içeren alçı kaplara damla damla 100 μL% 0,5 propiyonik asit ekleyin. Enjeksiyon işlemi sırasında hasar gören embriyolardan sitoplazm salınımı özellikle mantar büyümesi için elverişlidir.</li>
	<li>Alçı kapları her gün kontrol edin ve kötü veya ölü embriyoları çıkarın. Mantar varsa, tüm enfekte embriyoları çıkarın ve birkaç damla% 0.5 propiyonik asit ekleyin.</li>
	<li>Larvalar enjeksiyon sonrası 8 ila 12 gün arasında yumurtadan çıkar. Günde iki kez, yeni ortaya çıkan larvaları maksimum 5-10 kişilik gruplar halinde yeni alçı kaplara aktarın. Az miktarda yiyecek ekleyin ve yiyecekleri haftada 2-3 kez kontrol edin.<ol>
<li>Mantar kontaminasyonu riskini çok fazla artırdığı için larva yiyeceklerinin miktarını dikkatlice izleyin. Kum sineği larvaları gruplar halinde daha iyi hayatta kalırlar, ancak yeterli yiyecek yoksa yamyam olabilirler.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larvalar yavruladığında, dişileri bakire olarak korumak için onları cinsiyete göre ayırın. Hayatta kalan çok kişi varsa, erkekleri atın ve sadece dişileri tutun. NOT: Hem erkekler hem de dişiler mutasyon taşıyabilir ve iletebilir. Bununla birlikte, dişiler geçilmeden önce bakire tutulmaları gerektiği için, wt böceklerini cinsiyete göre ayırmak zorunda kalmamak için sadece G0 enjekte edilen kadınları kullanmak daha kolaydır. G0 erkekleri, yetişkin hayatta kalanların sayısı düşükse yedek olarak tutulabilir ve bu durumda sıralanmış wt bakire dişilerle çiftleştirilecektir.</li>
</ol>5. Mutant alellerin seçimi ve taranır (Şekil 5)
<ol><li>G0 dişilerini bir kafeste wt erkeklerle topluca geçin. Normal koloni bakımı için yapılacağı gibi onları tamamen kanla besleyin.</li>
	<li>Kan beslemeden bir gün sonra,2-3 wt erkekli her G 0 dişisini bir ağız aspiratörü kullanarak ayrı alçı tüplere aktarın. Sinekleri her gün değiştirilen küçük bir pamuk topu üzerinde şekerle besleyin ve alçı neminin yumurtlama için uygun olduğundan emin olmak için bir şırınna su kullanın.</li>
	<li>G0 dişileri yumurta bıraktıktan sonra (G1'ekarşılık gelen), vücutlarını daha sonra genotipleme için bireysel, açıklamalı Eppendorf tüplerinde toplayın. Embriyoları genellikle wt kolonileri için yapıldığı gibi koruyun.</li>
	<li>DNA'yı G0 dişilerinden seçim yöntemiyle çıkarın.</li>
	<li>Dna'yı mutasyonların varlığı için tarayın, örneğin beklenen CRISPR kesimlerinin bölgesini çevreleyen astarları kullanarak bir PCR testi tasarlayarak.</li>
	<li>Sadece G0 dişileri tarafından serilen G1 embriyolarını dönüşüm kanıtı göstererek saklayın. Bu G1 embriyoları pupa haline geldiğinde, onları cinsiyete göre ayırın ve sadece dişileri tutun. G1 dişilerini aynı G0 dişiden wt erkeklere geçin, kanla besleyin, ardından 2-3 kadın ve 4-5 erkekten oluşan küçük gruplar halinde küçük boyutlu kaplara aktarın. NOT: Tüm G1 bireyleri benzersiz bir mutasyon taşıma şansına sahiptir, bu nedenle hayatta kalan bireylerin sayısı çok yüksek değilse, G1 dişilerini wt erkeklerle ayrı ayrı geçmek daha iyidir. Aynı tüpte bulunan farklı bir mutasyon taşıyan birkaç dişinin durumu nadirdir, ancak ortaya çıkabilir. Genotiplemeden sonra böyle bir durum görülürse, G2 soy dişileri daha sonra erkeklere ayrı ayrı çiftilmelidir. Bu çiftleşme şeması, soyda birden fazla mutasyon olasılığını önler.</li>
	<li>Yumurtlamadan sonra, G1 kadın vücutlarını toplayın ve mutasyonlar için tarayın. Sadece en az bir dişinin mutasyon kanıtı gösterdiği tüpleri saklayın.</li>
	<li>Sonraki nesiller için tek çift çapraz yapar. Yumurtlamadan sonra, ebeveynleri mutasyon varlığı için tarayın. Her iki ebeveyn de aynı mutasyon için homozigous olana kadar her nesilde tekrarlayın. Tespit edildikten sonra, homozigous mutant stoğunun kurucuları olacak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae).">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42 (2017).</li><li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9:+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells.">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li><li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival.">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li><li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi:+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major.">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li><li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection.">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).</li><li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes.">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans.">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites.">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li><li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis.">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li><li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies:+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections.">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li><li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania.">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).</li><li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality.">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering.">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li><li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR/Cas9.">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).</li><li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR/Cas9.">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651 (2020).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control.">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li></ol>

Burada Phlebotomus papatasi kum sineklerinde CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen mutajensis için yakın zamanda geliştirilmiş bir embriyo mikroenjeksiyon yöntemini sunuyoruz. Böcek genetik modifikasyonu için embriyo mikroenjeksiyon 1980'lerin ortalarında Drosophila'da geliştirilmiştir21 ve şimdi rutin olarak çok çeşitli böceklerde kullanılmaktadır. ReMOT 20 , 21 , 22,23 ve elektroporasyon23<...

Vektör kaynaklı hastalıklar sürekli evrimde önemli bir halk sağlığı tehdididir. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, çok farklı filojenik ailelere yayılmış yüzlerce vektör türü (örneğin sivrisinekler, keneler, pireler) yılda 700.000'den fazla insan ölümüyle sonuçlanan çok sayıda mikrobiyal patojenin bulaşmasından sorumludur. Vektör böcekler arasında, fenbotomik kum sinekleri (Diptera, Psychodidae), farklı coğrafi bölgelerde bulunan farklı fenotipik özellikler ve vektörel kapasiteler sergileyen kanıtlanmış 80 vektör türü ile geniş bir grup oluşturur. Leishmaniacinsinin protozoan parazitleri için vektörlerdir Yaklaşık 1.3 milyon yeni Leishmaniases vakasına ve yılda 20.000 ila 30.000 ölüme neden olan. Leishmaniases klinik sonuçları, kendi kendini sınırlayan keseli lezyonlardan tedavinin yokluğunda ölümcül olan viseral yayılıma kadar çeşitli semptomlarla çeşitlidir.
Kum sinekleri kesinlikle karasal böceklerdir. Diğer Diptera'lara kıyasla nispeten uzun olan yaşam döngüleri, sıcaklık, nem ve beslenme gibi farklı parametrelere bağlı olarak üç aya kadar sürer. Bir embriyonik evre (6 ila 11 gün), dört larva evresi (toplam 23 ila 25 gün sürer) ve bir pupal evreden (9 ila 10 gün) ve ardından metamorfoz ve daha sonra yetişkinlikten oluşur. Kum sinekleri yetiştirme için nemli ve sıcak bir ortam gerektirir. Hem erkekler hem de dişiler, çiçek nektarlarından vahşi doğada elde edilen şekerlerle beslenir. Sadece dişiler kan besleyicidir, çünkü yumurta üretimi için kan yemeğinden elde edilen proteinlere ihtiyaç duyarlar1.
Araştırmanın önemli bir odağı, aktarılabilir enfeksiyonların gelişmesine yol açan vektör / parazit etkileşimlerinin doğasını belirlemektir. Diğer vektör böceklerde olduğu gibi, kum sineklerine içsel parametrelerin, patojenleri konaklarına taşıma ve iletme yetenekleri olarak tanımlanan vektör yeterliliklerini etkilediği gösterilmiştir. Örneğin, parazit yüzey bileşenlerini tanıyan reseptörler olarak hareket eden Phlebotomus papatasi kum sineği midgut hücreleri tarafından galektinlerin ifadesi, Leishmania majör2,3için vektör yetkinliklerini doğrudan etkileyebilir. Böcek immün yanıt yolu, İmmün Yetmeme (IMD), Leishmania major4için Phlebotomus papatasi kum sineği vektör yeterliliği için de çok önemlidir. Vektör böcek immün yanıt yolları için enfeksiyöz patojenlerin iletimini kontrol etmede kritik bir rol benzer şekilde Aedes aegypti sivrisineklerinde5,6,7, tsetse fly Glossina morsitans8ve Anopheles gambiya sivrisineklerinde 9,10.
Kum sineği/Leishmania etkileşimleri çalışmaları, bu böceklerde kullanılmak üzere uyarlanmış gen ekspresyon modifikasyon yöntemlerinin eksikliği ile sınırlı olmuştur. Yakın zamana kadar sadece küçük müdahale RNA'sı (siRNA) ile gen küçültme11,12,13,14 olarak gerçekleşmiştir. Yetişkin kadınların mikroenjeksiyonu ile ilişkili mortalite ile sınırlı olan teknik, sadece nesilden nesile bulaşamayan kısmi bir işlev kaybına yol açar.
CRISPR/Cas9 teknolojisi, kum sinekleri gibi model olmayan organizmalarda fonksiyonel genomik araştırmalarda devrim yaratmamıştır. Bakteriyofajlara karşı savunma için prokaryotlardaki adaptif bağışıklık sisteminden modifiye edilmiş15,16, CRISPR Cas9 sistemi, böcekler de dahil olmak üzere üstün ökaryotik organizmalar için bir genom düzenleme aracı olarak hızla uyarlanmıştır. CRISPR/Cas9 hedefli genom düzenleme prensibi, tek bir kılavuz RNA'nın (sgRNA) belirli bir genomik lokusa tamamlayıcılığına dayanmaktadır. Cas9 çekirdeği sgRNA'ya bağlanır ve sgRNA'nın tamamlayıcı dizisiyle ilişkilendirildiği genomik DNA'da çift iplikli DNA (dsDNA) kırılması oluşturur. Cas9-sgRNA kompleksi, sgRNA'daki 17 ila 20 tamamlayıcı taban tarafından seçilen çekirgeye yönlendirilir, dsDNA kırılması daha sonra iki bağımsız yol ile onarılabilir: nonhomologous end joining (NHEJ) veya homology-directed repair (HDR)17. NHEJ onarımı, kesmenin basit bir şekilde kapatılmasını içerir, ancak genellikle küçük ekleme/silme olaylarına yol açar. HDR aracılığıyla DNA onarımı, onarım için bir şablon olarak hedef DNA ile homolojiyi paylaşan bir donör DNA molekülü kullanır. Böcekler her iki makineye de sahiptir.
CRISPR/Cas9 teknolojisi, NHEJ onarım yolundan seçilen bir çekirgede mutasyonlar oluşturabilir; veya uygun bir donör şablonuna sahip HDR yolundan darbeler veya ifade muhabirleri gibi daha karmaşık genom düzenleme stratejileri için. Kum sineklerinde, phlebotomus papatasi4'teNHEJ aracılı CRISPR aracılığıyla immün yanıt faktörü Relish'in boş mutant alelleri üretildi. Kum sineği embriyoları da başka bir çalışmada Sarı kodlayan geni hedefleyen crispr/cas9 karışımı ile enjekte edildi. Yine de, mutasyonu taşıyan hiçbir yetişkin üretilmedi18. Burada, protokolün kritik bir adımı olan embriyo mikroenjeksiyonuna odaklanarak NHEJ aracılı CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen ayrıntılı bir kum sineği hedefli mutagenezi yöntemini açıklıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Kum sinekleri, leishmania türleri için doğal vektörlerdir, protozoan parazitler, fetüs lezyonlarından viseral patolojiye kadar geniş bir semptom spektrumu üretir. Vektör / parazit etkileşimlerinin doğasının deşifre edilmesi, leishmania iletiminin konaklarına daha iyi anlaşılması için birincil öneme sahiptir. Kum sineği vektör yeterliliğini kontrol eden parametreler arasında (yani patojenleri taşıma ve iletme yetenekleri), bu böceklere içsel parametrelerin kilit rol oynadığı gösterilmiştir. Örneğin, böcek immün yanıtı, Leishmania'yakum sineği vektör yeterliliğini etkiler. Bu tür parametrelerin incelenmesi, bu model olmayan organizmalarda kullanılmak üzere uyarlanmış gen ekspresyon modifikasyon yöntemlerinin eksikliği ile sınırlanmıştır. Küçük müdahale RNA 'sı (siRNA) ile gen küçültme mümkündür, ancak teknik olarak zorlayıcı olmasının yanı sıra, susturma, nesilden nesile bulaşamayan sadece kısmi bir işlev kaybına yol açar. CRISPR/Cas9 teknolojisi ile hedeflenen mutagenesis yakın zamanda Phlebotomus papatasi kum sineğine uyarlandı. Bu teknik, özellikle seçilmiş bir lokusta aktarılabilir mutasyonların üretilmesine yol açarak ilgi genlerinin incelenmesine izin verir. CRISPR/Cas9 sistemi, daha sonra Homolog Olmayan Sonlandırma Birleştirme (NHEJ) veya Homology Driven Repair (HDR) tarafından onarılan hedeflenen çift iplikli DNA molalarının indüksiyonuna dayanır. NHEJ, kesmenin basit bir şekilde kapatılmasından oluşur ve sık sık küçük ekleme/silme olaylarına yol açar. Buna karşılık HDR, homolojiyi hedef DNA ile paylaşan bir donör DNA molekülünün varlığını onarım için bir şablon olarak kullanır. Burada, bugüne kadar kum sineği vektörlerine uyarlanmış tek genom modifikasyon tekniği olan NHEJ kullanılarak CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen mutajensis için bir kum sineği embriyo mikroenjeksiyon yöntemi sunuyoruz.

Kum sineği mutantları üretmek için burada açıklanan CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon protokolü önceki bir yayında oluşturulmuştur4. Bu yaklaşım, 540 kişiden 11'i prosedürden sağ çıktığı ve 9'unun mutant olduğu için yüksek verimli mutajensis üretti. CRISPR/Cas9 mutasyonu için kılavuzlar tasarlarken, kritik bir ilk adım, hedeflenecek alanın etrafındaki bölgeyi sıralamaktır. Sıralama şablonu, enjeksiyon için embriyo kaynağı olarak kullanılacak suştan olmalıdır. K?...

Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Bu protokol, CRISPR/Cas9 hedefli mutajenizin kum sineklerindeki adımlarını detaylandırıyor: embriyo toplama, enjeksiyon, böcek yetiştirme ve tanımlamanın yanı sıra ilgi çekici mutasyonların seçimi.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

sand-fly-phlebotomus-papatasi-embryo-microinjection-for-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.0K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Bu protokol, CRISPR/Cas9 hedefli mutajenizin kum sineklerindeki adımlarını detaylandırıyor: embriyo toplama, enjeksiyon, böcek yetiştirme ve tanımlamanın yanı sıra ilgi çekici mutasyonların seçimi.

Video: Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Genetik

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...