Bu eser bir cömert University of California, Riverside (UCR) laboratuvar start-up fon O.S.A, USDA Ulusal Enstitüsü gıda ve Tarım (NIFA) kapak projesine O.S.A. (1009509) tarafından desteklenmiştir

1. N. Vitripennis koloni yetiştirme
<ol>
	<li>Sömürgeler ayarla (~ 3-5) 200-500 i. vitripennis yetişkin (ile kadın: erkek 3:1 oranında) hata yurt kafeslerde yerleştirerek. Not: hata Yurtlar, arı kullanmanın alternatifi de birden çok, küçük cam test tüpleri ile yaklaşık 15-20 eşekarısı/flakon ile pamuk tıkalı içinde yayılamaz.<ol>
		<li>Eşekarısı, 25 ± 1 ° C ile %30 bağıl nem ve 1212: ışık karanlık döngüsü günlük 1:10 (v/v) küçük damlacıklar ile besleme onları korumak Sükroz/su solüsyonu. Not: Yayma yaban arısı kolonileri ve koleksiyonu da, oda sıcaklığında kontrollü nem olmadan yapılabilir; Ancak, düşük sıcaklığı 25 ° C hafif embriyoların gelişim zamanlaması düşürür daha.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>En az 4 gün önce enjeksiyonları çiftleşmeye eşekarısı izin.<ol>
		<li>İlk iki gün için taze beslemek şeklindeki kadın izin S. bullata pupa yanı sıra küçük damlacıklar bir 1:10 (v/v) Sükroz/su solüsyonu.</li>
		<li>Aşağıdaki iki gün için yapım onları çok gravid bir oviposition sitesinin dişi arıların mahrum etmek sineği pupa kaldırın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. toplama ve N. Vitripennis öncesi blastoderm sahne embriyo hizalamasını
<ol>
	<li>Dişi arıların parasitize izin (embriyo Hayır) genç ana bilgisayarlar (S. bullata pupa) içine. Ana bilgisayarlar taze tutmak için ana bilgisayarlar hemen onları elde ettikten sonra 4 ° C'de depolayın ve yalnızca gerektiğinde kaldırmak. Not: Genç ana bilgisayarlar büyük ana bilgisayarlar daha koyu renkli puparium (şekil 1A) var ise kırmızı renkli puparium sahip olarak belirlenebilir.<ol>
		<li>Bireysel taze S. bullata yer pupa pupa büyüklüğünde bir delik olan bir köpük tıpa içine kesilmiş merkezine. Sadece açığa ~ 0.2 cm parasitization ve daha kolay embriyo koleksiyonu maksimum konsantrasyon konağını ön sonu (tercih edilen oviposition sitesi). Not: arka uç kalındır ve 'krater benzeri' açılış (şekil 1B) içeren ön uç yuvarlanır.</li>
		<li>Ana bilgisayar pupa (kabaca 5 ana bilgisayar pupa 100 arı başına) bu düzenleme kafesin içine yerleştirin ve eşekarısı onları (Şekil 2- II) parasitize izin vermek için yaklaşık 45 dakika bekleyin. Not: Bu embriyoların ideal öncesi blastoderm aşamasında olduklarından emin olmak için oviposited ilk saat içinde mümkün olduğunca genç çok önemlidir. Eski embriyo (&#62; 1,5 saat) değil enjekte.</li>
		<li>Parasitized ana bilgisayarlar alarak onları el ile ve yavaşça fırça / herhangi bir ikamet eşekarısı havaya kaldırın. Sonra taze ev sahibi bunların yerine her ~ enjeksiyonlar sırasında yumurta sahnelenen erken toplama devam etmek için 15 dak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Taze parasitized ana bilgisayarları kafesinden el ile kaldırma. Forseps, kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında dikkatle peel away i. vitripennis yumurta (Şekil 2- III) ortaya çıkarmak için dış puparium (pupa kabuk) posterior sonu (0.4 cm). Not: Pupa cilt delme önlemek için bakım alınmalıdır; Bu durumda, hemolymph mikroenjeksiyon için kaldırmak çok zor olacak wasp embriyo nemlendirin.</li>
	<li>Bir coverslip bir embriyo hizalama slayt (şekil 3) hazırlamak için temiz cam slayt üzerine yapıştırmak için sıvı yapışkan destek kullanın. Not: Yüksek performanslı anlık yapıştırıcı bond gücünü artırmak üzere kullanılan ve hızlı kurutma, ancak coverslip slaytta hareket tutabilir herhangi bir yapıştırıcı kabul edilebilir.</li>
	<li>Basamaktan embriyo dikkatle ıslak bir ince uçlu fırça ile bilgisayardan ana yumuşak pupa deri zarar vermeyeceğine emin olmak istedim. Not:: "embriyo çekme,' aslında bir buçuk süper ince forseps, bir çift olan bir fırça yerine kullanılabilir.</li>
	<li>Aktarım ~ 20 embriyolar tek tek bir slayda, hemen ıslak bir boya fırçası ile coverslip tarafına bitişik. Ön kapak slaytın kenar karşı embriyo sonuna embriyoların arka uç aynı yönde (Şekil 2- IV) işaret gelecek şekilde yönlendirin. Bu tüm embriyolar arasında aynı konum içine enjekte ederek daha yüksek hassasiyet için izin verir. Not: Bu gelişmiş teknik embriyo21,22daha önce açıklandığı gibi slayda düzeltmek için çift taraflı yapışkan bant gerektirmez. Ayrıca, işe embriyo yazılıolduğu veya kapak yumurta halocarbon yağı ile i. vitripennis embriyo mikroenjeksiyon22için daha önce açıklandığı gibi enjeksiyon sırasında.</li>
</ol>
3. iğne hazırlık Microinjections için
<ol>
	<li>Bir aluminosilicate kılcal cam bir iğne çektirmenin yerleştirin. Not: İyi bir iğne başarılı i. vitripennis için önemlidir embriyo enjeksiyonları. Enjeksiyon iğneler keskin ve koryon aracılığıyla kolay nüfuz izin vermek için ince uçlu olmalıdır. Kuvars ve borosilikat kapiller iğneler de olabilir (şekil 4) kullanılır.</li>
	<li>70 ve basınç 500 605 ısı , hız 130 için 80 gecikme , çekin bir iğne çektirmenin ayarlayın. Not: ek iğne çektirme ayarları kuvars ve borosilikat iğneler çekerek için Tablo 1' de görülebilir; Parametreler farklı Elcikler ve filamentler için farklı olabilir.</li>
	<li>İğne çektirme doğru iğne oluşturmak için aktif hale getirin. Birden fazla iğne üretimi için gerektiği kadar yineleyin. Not: Bir Petri kabına ticari modeler'ın topraktan birkaç paralel rulo içeren içine yerleştirerek çekti iğneler depolanabilir.</li>
	<li>İğne ucu ucuna elmas aşındırıcı plaka 10 civarında kadar hafifçe dokunarak eğim s 25 ° c (Şekil 2- III). Not: Aynı anda iğne ile vekiller akışının geliştirilmesi sırasında en az hasarla embriyo içine giriş teşvik ederek eğim enjeksiyon iğneler yarar.</li>
</ol>
4. embriyo mikroenjeksiyon
<ol>
	<li>Genom değişiklik reaktifler (Örneğin, transposon + yardımcı transposase, veya CRIPSR reaktifler, vb) oluşan enjeksiyon karışım hazırlamak ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Enjeksiyon karışımı 2 µL enjeksiyon iğnesiyle microloader ipuçlarını kullanarak yükleyin. Not: tek-Kılavuzu RNA (sgRNA) (s) ve H2' O. karışık rekombinant Cas9 protein iletişim kuralında gösterdi enjeksiyon karışım oluşur</li>
	<li>Sahne Alanı'na bir bileşik mikroskop çizgili embriyo ile cam slayt yerleştirin.</li>
	<li>Dikkatle arka sonunda embriyo ile dikey açı 25-35 ° lik iğne takın.</li></ol>1-5 pL enjeksiyon karışım (yaklaşık embriyo'nın hacminin 2-%10) enjekte ve embriyo karışımı bu (Şekil 2- IV) enjekte edilir gibi biraz şişmeye göründüğünden emin olun. Not: çok fazla enjeksiyon karışım embriyo enjekte edilir eğer embriyo sitoplazma dağıttılar patlamış. Ayrıca, uygun olmayan şekilde eğimli ya da kırık iğne ile çok büyük bir açılış da embriyo yırtılması neden olabilir.<ol>
		<li>Tıkanma oluşursa yeniden beveling iğneler deneyin. İ. vitripennis embriyo sitoplazma alışılmadık viskoz ve yapışkan, hangi sık iğne (1/25 enjeksiyonları) tıkanma olur mu. Not: De-iyonize su fırça kullanarak düzenli olarak ekleyerek embriyo enjeksiyon döneminde nemli tutmak önemlidir. Fırça su miktarına embriyo hareket etme ve kolaylığı ile hizalamak için anahtardır. Çok fazla su kayan ve çok az su onları hareket etmek zor embriyo sonuçlanır.</li>
		<li>Enjekte ~ 20-40 yumurta (yaklaşık 10 dk almalı) bir anda o zaman bırak. Islak bir boya fırçası ile enjekte yumurta enjekte yumurta hafifçe dokunarak aktarmak ve bir ev sahibi koyun. Sonra yeni bir taze kullanarak yeniden enjekte toplu yumurta koydu devam edin (&#62; 1 h eski). Not: başka bir kişi genom değişiklik bileşenleri enjekte ve ana bilgisayar pupa için enjekte embriyo nakli iken ideal bir konuma sahip bu iletişim kuralı bir kişi sürekli toplama ve yumurta astar, en etkilidir.</li>
	</ol>
	

5. Injected G0 Pre-stung ana bilgisayar üzerine i. vitripennis embriyo nakli
<ol>
	<li>Dikkatle enjekte G0 embriyolar daha önce stung S. bullata üzerine yer pupa (Şekil 2- VI) mikroenjeksiyon sonra ıslak bir fırça ile. Not: Bu amaçla mikroenjeksiyon için embriyo toplamak için kullanılan ana bilgisayar pupa çalışacaktır. Ayrıca, önemli çaba rağmen yoktur şu anda kullanılan22-ebilmek var olmak elde edilebilir hiçbir yapay diyet.<ol>
		<li>40 enjekte embriyo bir vakit doluluk ve larva rekabet önlemek için tek bir önceden stung ana üzerine yerleştirin. Not: Enjeksiyon embriyoya zarar; ana bilgisayar pupa için enjekte embriyo dikkatsiz nakli eklenen bileşen veya sarısı dışarı sıkmak ve embriyoların ölüme yol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ana bilgisayar pupa nemli filtre kağıdı ve pamuk topları ile bir Petri çanak içine yerleştirin ve (yaklaşık 1-2 gün) enjekte embriyo yumurtadan kadar onları yaklaşık %70 nem ile 25 ° C'de kuluçkaya (Şekil 2- VII). Not: Önemlisi, ana bilgisayarlar bırakılabilir bir soyulmuş ile onlar kuruma önlemek oksijen Odası (Petri kabına nemli filtre kağıdı ve pamuk topları ile) içinde inkübe sürece puparium ve N. vitripennis kapalı yumurta normalde gelişecektir. Nem kontrol edilemez diye oda sıcaklığında ve nem üzerinden nemlendirilmiş pamuk topları ile kuluçka yeterli olur.</li>
	<li>Ana bilgisayar pupa içine yeni bir petri %70 nem ve 25°C G0 embriyo kapağı sonra transfer.<ol>
		<li>Ana bilgisayar pupa ve enjekte G0 larva her gün izlemek. Ana bilgisayar pupa iğrenç bir koku varsa, eklenen larva yeni sağlıklı ana bilgisayar pupa aktarın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. tarama genom değişiklikler için
<ol>
	<li>Her i. vitripennis pupa iyi boya fırçası veya embriyo çekme kullanarak ana bilgisayardan kaldırın. Enjekte G0 larvaları yaklaşık 8 gün sonrası enjeksiyon YavruIar.</li>
	<li>Kaldırılan her pupa bir yalıtılmış cam şişe içine pamuk ile takılı ve taranmış kadın bakire olacak sağlanması G0 yetişkin hangi ortaya izin yer aşağı akım genetik haç ile yardımcı olacaktır. Not: Kadın erkek kanat uzunluğa göre sıralayabilirsiniz: kadın olması geçmiş zaman üstünde belgili tanımlık yan döndü vücut profil genişletmek daha uzun kanatları. Tüm microinjected kadın pupa birlikte takılı bir şişe yerleştirilebilir ve aynı erkek pupa için geçerlidir.</li>
	<li>Eclosion, her iki PCR veya görsel olarak sonra ekran G0 bireyler (engellemeden fenotipik bir gen varsa). Örneğin, CRISPR silme işlemleri belirli bir gen oluşturmak için kullanılan ve kesintiye gen görünür bir fenotip veriyor, sonra sıralayın ve bireylerin etkilenen fenotip (Şekil 2- VIII) mutant bir sürümü ile devam21. Ancak, temel bir gen, bir mutant gibi görünür olmayan bir fenotip için etkilenen gen kodlar, yeniden elde etmek ve için ekran için bir geçiş düzeni (çapraz G0 olan vahşi türü dişi erkek veya çapraz G0 vahşi türü erkek ile kadın) gerçekleştirin ölümcül ya da kısırlık raporlaması ile kalıtsal mutantlar. Not: D. melanogaster, i. vitripennis yetişkin benzer CO2 basit manipülasyon için sağlayan maruz immobilize. Ayrıca, eşleşmemiş kadın % 100 haploit erkek broods için bu nedenle bir mutant eşleşmemiş erkek daha sonraki analiz için kullanılan mutant erkek sayıda çıkmasına neden olabilir çıkmasına neden. Not: Temel genlerdeki mutasyonlar hayatta kalan G enjekte0 kadın (muhtemelen bir mutasyon için heterozigoz) vahşi türü erkek çiftleşme tarafından tutulması gerekir; G1 kadın döl yarısı nakliyeci-in ölümcül olacak iken bu özel durumda, G1 erkek döl yarısı öldürücü mutasyon devralınması nedeniyle ölmemeli.</li>
	<li>G0 yetişkin ve ekran G1 döl Eğer amaç transgenesis transgenesis işaretçileri kullanarak transgene eklemeleri için outcross. Şu anda transgenesis i. vitripennisiçinde göstermiş kalır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivers, D. B., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fate+of+the+flesh+fly,+Sarcophaga+bullata,+envenomated+by+the+pupal+ectoparasitoid,+Nasonia+vitripennis.">Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis.</a> J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).</li><li>Whiting, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+the+Parasitic+Wasp+Mormoniella+vitripennis+[=Nasonia+brevicornis]+(Walker).">The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker).</a> Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).</li><li>Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterium+targets+maternally+inherited+centrosomes+to+kill+males+in+Nasonia.">A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia.</a> Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).</li><li>Hurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-Killing+Bacteria+in+Insects:+Mechanisms,+Incidence,+and+Implications.">Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications.</a> Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).</li><li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausi&#972;, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selfish&amp;#34;+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis.">A &amp;#34;selfish&amp;#34; B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Sci Rep. 7, 42551 (2017).</li><li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li><li>Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selfish&amp;#34;+B+chromosome+that+enhances+its+transmission+by+eliminating+the+paternal+genome.">A &amp;#34;selfish&amp;#34; B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome.</a> Science. 240 (4851), 512-514 (1988).</li><li>Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+Proteins+of+the+Parasitoid+Wasp+Nasonia+vitripennis:+Recent+Discovery+of+an+Untapped+Pharmacopee.">Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee.</a> Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).</li><li>de Graaf, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+venom+composition+of+the+ectoparasitoid+wasp+Nasonia+vitripennis+from+bioinformatic+and+proteomic+studies.">Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies.</a> Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).</li><li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia.">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li><li>Grillenberger, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+structure+of+natural+Nasonia+vitripennis+populations:+validating+assumptions+of+sex-ratio+theory.">Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory.</a> Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).</li><li>Pultz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+zygotic+hunchback+in+patterning+the+Nasonia+embryo.">A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo.</a> Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).</li><li>Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+maternal+orthodenticle+patterns+anterior+and+posterior+in+the+long+germ+wasp+Nasonia.">Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia.</a> Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).</li><li>Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+tailless+in+the+long+germ+wasp+Nasonia+vitripennis.">Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis.</a> Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).</li><li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species.">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li><li>Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Genes+Uniquely+Expressed+in+the+Germ-Line+Tissues+of+the+Jewel+Wasp+Nasonia+vitripennis.">Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis.</a> G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).</li><li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome,+paternal+sex+ratio.">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li><li>Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+infection-induced+transcriptome+of+Nasonia+vitripennis+reveals+a+preponderance+of+taxonomically-restricted+immune+genes.">Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes.</a> PloS one. 8 (12), e83984 (2013).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Nasonia+(parasitoid+wasp).">Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp).</a> Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).</li><li>Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microinjection+protocol+for+the+parasitoid+Nasonia+vitripennis.">Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis.</a> Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).</li><li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species.">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İ. vitripennis genom son sıralama işlevsel olarak bu tür23bilinmeyen genlerde karakterize etmek moleküler araçlar için önemli bir ihtiyaç unleashed vardır. CRISPR-Cas9 sistemi ve birçok diğer gen düzenleme araçları, gen fonksiyonları bir dizi organizmalar24için soruşturma değerli olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, kalıtsal mutasyonları üretmek için bu araçlar embriyo microinjections performans gerektirir. Bu nedenle, burada izin vermek için verimli yenilikleri bir dizi içeren bir tekniktir detaylı görsel gösterdi i. vitripennis embriyo microinjections.
Genel olarak, bu ayrıntılı teknik sunar mevcut yöntemleri23, ile ilgili önemli yenilikler bir dizi izin veren için verimli i. vitripennis embriyo microinjections. Örneğin, embriyo hızlı toplama kolaylaştırmak için bir oviposition aracı (köpük tıpa) oluşturulur ve büyük ölçüde kolaylaştıran çok sayıda embriyo içinde topluluğu olan ana bilgisayarı (şekil 1), arka sonuna tamamen döşeme yumurta sınırlandırmak için kullanılır kısa bir süre. Yaban arısı kolonileri daha fazla sayıda yumurta toplamak için büyük sayılarla yetiştirme teknikleri de tanımlanan ve geliştirilmiş. Ayrıca, embriyo hizalama hızlandırmak için etkili bir şekilde hizalanmış ve embriyo yerde (şekil 3) güvenlik altına almak için çift taraflı yapışkan bant kullanmak zorunda kalmadan enjekte embriyolar için izin veren bir embriyo hizalama cihazı geliştirdi.
Ayrıca, bu embriyolar su ile nemli enjeksiyon ve embriyoların kurutulan ya da onları yağla kapsayan sırasında tutarak sağkalım oranları gelişmiş bulunur. Ayrıca, kapiller cam çeşitli test ve mükemmel iğneler i. vitripennis mikroenjeksiyon (Tablo 1, şekil 4) için oluşturmak için parametreleri belirlenir. Ayrıca, aşağıdaki mikroenjeksiyon, embriyo hayatta kalma oranları önemli ölçüde önceden stung ana enjekte yumurta kuluçka nedeniyle artış edebiliyoruz yüksek oranda nem içeren (% 70) odasında yerleştirilir. Bu yenilikler için bir daha akıcı ve başarılı mikroenjeksiyon yordam i. vitripennisiçin izin.
Enjeksiyon aparatı ve yordamlar yetiştirme açısından küçük değişiklikler bu iletişim kuralı, kullanıcı tercihlerine bağlı olarak yapılabilir. Ancak, bir dizi kritik adım mutantlar i. vitripennisiçinde başarıyla oluşturmak için gerekli olacak. Enjekte embriyo vardır örneğin, hızlı bir şekilde çalışmaya &#62; 1 s eski ve enjeksiyon iğneler embriyo zarar en aza indirmek keskin sağlanması hem de olacak gerekli. Bu iletişim kuralı (hepsi değilse de) birçok genlerinde mutasyon için etkili gerekirken, bir büyük hedef sıra dikte edecek bir PAM (NGG) sürecini hedef için CRIPSR/Cas9 gereksinimi kısıtlamadır.
Sonuç olarak, bu gelişmiş teknik birçok türde mutasyonlar, silme gibi genom değişiklikleri oluşturmak ve transgenik oluşturmak için CRIPSR/Cas9 teknolojileri21veya hatta transgene eklemeleri kullanarak eklemeler hatta için kullanılabilir Hangi büyük ölçüde bu organizmanın fonksiyonel araştırma hızlandırmak i. vitripennis.

Mücevher eşek arısı, N. vitripennis, cins Nasonia içinde ectoparasitoids Sarcophaga bullata1gibi sinekler yeme et olan dört türlerinden biridir. Hızlı kuşak dönemleri, laboratuvar ve biyolojik özellikleri, benzersiz ve önemli bir dizi yetiştirme kolaylığı nedeniyle i. vitripennis geleneksel canlılar arasında bulunan birden çok deneysel araçları geliştirilmesi için bir odak noktası olmuştur . Örneğin, bazı benzersiz biyolojik öznitelikler haplo-diploid üreme sistemi2, mikrobiyal ve genetik parazitler3,4ile bir ilişki ve bir supernumary (B) kromozom5,6 içerir ,7. Birlikte ele alındığında, bu zehir üretim8, dahil olmak üzere ek olarak bu işlemlerin moleküler ve hücresel yönlerini elucidating amaçlayan deneyler için önemli bir deneysel sistem i. vitripennis olun 9, cinsiyet belirlenmesi10,11ve evrim ve gelişme ekseni Desen oluşumu12,13,14. Ayrıca, NBiyoloji çalışmaya genetik araç seti. vitripennis son on yıl içinde önemli ölçüde artmıştır ya da çok, bir yüksek çözünürlüklü genom15sıralama ile çeşitli gen ekspresyonu16,17,18, çalışmalar ve yetenek işlevsel RNA müdahale (RNAi)19,20, hangi birlikte tractability ve ters genetik bu organizmada performans yetenekleri gelişmiş güvenerek gen ekspresyonu bozmaya.
Birçok önemli bilimsel gelişmeler ve bu canlı genişletilmiş araci rağmen mevcut bilgi aynı derecede-in tek bir grup başarıyla embriyonik microinjections kalıtsal genom değişiklikler21oluşturmak için sahne aldı. Onlar oldukça kırılgan ve küçük, Drosophila melanogaster embriyolar, onları işlemek genellikle zor hale boyutunu ~2/3 varlık olarak i. vitripennis embriyo ile çalışmanın zorlukları nedeniyle öncelikle bu. Ayrıca, i. vitripennis dişiler yumurtalarını embriyogenez, larva, Pupa geliştirme tamamı içinde oluştuğu önceden stung sineği pupa Kasası. Bu nedenle, başarılı microinjections, ön blastoderm sahne, embriyo ana bilgisayar pupa, hızlı bir şekilde microinjected ve hemen geri onların ana bilgisayarlar için geliştirme içine nakledilen üzerinden verimli bir şekilde toplanması gerekir. Aşağıdaki adımları hassas ve microinjected embriyo veya son derece zorlu tekniği yapım pupa ana zarar görmesini önlemek için el becerisi gerektirir. Rağmen i. vitripennis embriyo mikroenjeksiyon22açıklayan bir on yıl kadar önce yayınlanan bir kısa protokol vardır. Ancak, bu yordam için taze koydu embriyo kurumuş gerekir, yumurtaların mikroenjeksiyon için çapa için yapışkan bant kullanır ve bir görsel gösteri tekniği içermez. Bu nedenle, burada açıklanan geliştirilmiş adım adım iletişim kuralı kalıtsal genom oluşturmak için temel herhangi bir laboratuar tarafından takip edilebilir i. vitripennis embriyo microinjections için ayrıntılı bir görsel yordam da dahil olmak üzere bir güncelleştirilmiş ve gözden geçirilmiş protokoldür Bu önemli model böcek olarak değişiklikleri.

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>41515</td><td>Insect Rearing Cage</td></tr><tr><td>Glass Test Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>Flesh fly pupae, &lt;em&gt;Sarcophaga bullata&lt;/em&gt;</td><td>Carolina Insects</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td><td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>Kite R</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Express programmable microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 or P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Leica DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Can also use Borosilicate or Quartz</td></tr><tr><td>Identi-Plugs</td><td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>Foam plugs</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover glass</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive</td><td>Aron Alpha</td><td>AA471</td><td>For glueing coverslip onto microscope slide</td></tr><tr><td>Fine-tip paintbrush</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-fine tip forcep</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

embryo microinjection and transplantation technique for nasonia vitripennis genome manipulation

Mücevher wasp Nasonia vitripennis seks belirlenmesi, haplo-diploid seks belirlenmesi, zehir sentezi ve ana bilgisayar-konukçunun etkileşimleri, diğerleri arasında gibi işlemlerin incelenmesi için bir etkili model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Bu organizma ile çalışmanın önemli bir sınırlama yönlendirilmiş genom değişiklikler gerçekleştirmek için etkili iletişim kurallarının olmaması. Reaktifler, CRISPR/Cas9 molekülleri, embriyo mikroenjeksiyon aracılığıyla da dahil düzenleme teslimat genom değişiklik önemli bir parçası olur. Mikroenjeksiyon birçok canlılar arasında iyi kurulmuş olsa da, bu teknik i. vitripennis içinde öncelikle küçük embriyo boyutuna ve embriyonik gelişme tamamen içinde oluşur gerçeği nedeniyle gerçekleştirmek için özellikle zor bir parasitized sineği pupa. Aşağıdaki yordamı bu önemli sorunlar süre etkili wasp embriyo kaldırmak için akıcı, görsel bir yordam gösteren parasitized ana bilgisayar pupa, onları, microinjecting ve dikkatle onları Dikim geri ev sahibi üstesinden gelir Devamı ve geliştirme tamamlanması için. Bu iletişim kuralı güçlü gelişmiş genom değişiklikler bu organizma olarak gerçekleştirmek için araştırma grupları yeteneğini artıracaktır.

Bu iletişim kuralı koloni yetiştirme, ön blastoderm embriyo koleksiyonu, hizalama, mikroenjeksiyon ve enjeksiyon sonra sonraki nakli için ayrıntılı yönergeler sağlar ve i. vitripennisverimli genom mühendisliği için kullanılabilir. Şekil 2' de gösterildiği gibi genel i. vitripennis içine başarılı mikroenjeksiyon için adımlar dizisini içerir: (i) çiftleşmek için erkek ve kadın yetişkinden erişimine izin verme (~ 4 gün), (ii) temin taze ana bilgisayar sinek pupa (S. bullata) yerleştirilen bir değiştirilmiş köpük tak şeklindeki kadın ve oviposition için izin (~ 45 dk), (III) dikkatle uzakta ortaya çıkarmak ve ön blastoderm sahne wasp embriyo toplamak için parasitized ana bilgisayar pupa manikür peeling (~ 15 dk), (IV) hizalama toplanan embriyo (~ 15 dk), (v) embriyo microinjecting genom değişiklik bileşenlerine (~ 15 dk), (vi) dikkatli bir şekilde sipariş enjekte embriyo geri içine doğru gelişimi için izin vermek için önceden stung ana bilgisayarlar (~ 15 dk), ve (vii) önlenmesi enjekte embriyo/konak susuzluktan aktararak Onları yaklaşık %70 bağıl nem ile oksijen odasına (~ 15 dk). Parasitized dan sonra tam i. vitripennis embriyo gelişimi için izin vermek kabaca 14 gün boyunca inkübe. Enjekte sonra yetişkin (VIII) ana bilgisayardan ortaya, ayırma, dostum ve onları tek tek beklenen mutasyonlar varlığı için ekran.
Etkili iğne penetrasyon ve mikroenjeksiyon i. vitripennis embriyo içine, kuvars, aluminosilicate ve borosilikat türleri de dahil olmak üzere filaman kapiller cam iğne çeşitli test edilmektedir. Bu iğne kalitesi kritik kırılma/tıkanma enjeksiyon sırasında önlemek için ve her iki embriyo hayatta kalma ve dönüşüm verimliliği yüksek oranda elde etmek için bulunur. Her cam türü için istenen şırınga benzeri uzun ipucu kullanarak farklı micropipette Elcikler (P-1000 ve P-2000) i. vitripennis embriyo mikroenjeksiyon için etkili olması için iğne çekmek için etkili bir iletişim kuralı geliştirilmiştir (Tablo 1 Şekil 4).
Yordamı en iyi duruma getirmek için sağkalım oranları değişen miktarlarda genom değişiklik bileşenleri enjeksiyon takip ölçülür. Burada kullanılan genom değişiklik bileşenler karışık Kılavuzu RNA'ların ve Cas9 protein CRISPR-aracılı genom düzenleme, daha önce de i. vitripennis21' çalışmak gösterilmiştir vardı. Daha önce neydi benzer bildirdi, burada bir sgRNA zinober gen tasarlanmış ve sentezlenmiş hedefleme. Hedefleme ve bu gen engellemeden, kolayca tanımlanabilen bir fenotipik değişiklik organizma19,21göz rengi görülür. SgRNA konsantrasyonları çeşitli birleştiren bir enjeksiyon karışım (0, 20, 40, 80, 160 ve 320 ng/µL) Cas9 protein (0, 20, 40, 80, 160 ve 320 ng/µL) oluşturulur ve vahşi türü i. vitripennisembriyo enjekte. Sağkalım oranı enjekte embriyo doz bağımlı (Tablo 2)21olduğu bulunmuştur. SgRNA ve Cas9 protein düşük sağkalım oranları (Tablo 2), belki de katkı hedef kapalı etkileri nedeniyle Müşteri adayına artan konsantrasyon. Yüksek nem (~ % 70) zamanda embriyo düşük nem olarak ekimi ana, sonra hayatta kalmak için önemli olduğu tespit (~ % 10) % 100 ölüm tüm enjekte embriyolar için sonuçlandı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg"> 
Resim 1 . Ana bilgisayar pupa hazırlanması (S. bullata) için i. vitripennis embriyo oviposition. (A) Genç ve yaşlı S. bullata pupa. Genç pupa onların manikür için daha kırmızımsı bir renk tonu var ise büyük pupa daha koyu bir manikür var. Genç pupa oviposition maksimize etmek için tercih edilir. "Ön sonunda yuvarlak bir noktasına gelir, ancak bir krater benzeri arka ucunda, açarak. pupa arka ve ön ucu da ayrılır (B) i. vitripennis embriyo oviposition. için ana bilgisayar (S. bullata) pupa hazırlık Ana bilgisayar pupa bir pupa olmuştur bir köpük fiş ekleme oyulmasıyla delik ölçekli. Oviposition ön alana, maksimum konsantrasyon için izin vermek için ön ucunun 0.2 cm maruz iken ana bilgisayar pupa yüz fiş içinde arka tarafında var. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg"> 
Resim 2 . Zaman çizelgesi oluşturmak için i. vitripennis mikroenjeksiyon gitmesini... mutantlardan. İ. vitripennis embriyo koleksiyonu, CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon ve sonrası enjeksiyon yordamlar zaman çizelgesi. İ. vitripennis yetişkin 4 gün için (Ben) bir oviposition sitesi yokluğunda çiftleşmek için izin verildi. Aşağıdaki, bir taze, eti sinek ana bilgisayar pupa, S. bullata, sadece arka sonu, 0,5 cm açığa olarak köpük tıpa yerleştirilen tanıtıldı (II) parasitization için izin vermek için gravid kadın için 45 dk için. Aynı anda mikroenjeksiyon iğneler ve CRISPR/Cas9 bileşenleri de dahil olmak üzere enjeksiyon materyalleri (III) hazırlanmıştır. Embriyo, (v) uyumlu, (IV) ana bilgisayardan toplanmış ve CRISPR/Cas9 bileşenleri (VI) ile enjekte. Enjekte embriyo dikkatle önceden sokulan bir ana (VII) geri transfer ve tam olarak gelişmiş (14 gün kadar) (VIII) inkübe edildi. Ne zaman yetişkin ortaya çıktı, mutantlar için hedef gen (IX) beklenen CRISPR/Cas9 indüklenen mutasyonların fenotipleri gösterildi. Bütün prosedür genellikle 19 gün tamamlamak için alır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg"> 
Şekil 3 . Embriyo astar için değiştirilmiş mikroskop slayt. (A) A coverslip. (B) A mikroskop slayt. (C) bir embriyo hizalama cihazı.Bir coverslip satır embriyolar için enjeksiyon için kullanılmak üzere bir mikroskop slayt üzerine yapıştırılmış olabilir. Coverslip amacı kolayca idare ve astar embriyolar için izin vermek için bir avantaj olarak hareket etmektir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg"> 
Şekil 4 . Enjeksiyon iğne hazırlık. İyi ve kötü aluminosilicate cam iğne(a)örnekler. (B) bir yuvarlatılmamış, doğru eğimli ve kötü eğimli iğne ipuçları. Aluminosilicate cam kılcal tüpler bir micropipette çektirmenin kullanarak çekildik. Üretilen iğne ipuçları vardı sonra yavaşça açıldı ve bir beveler kullanarak rafine. Çok keskin bir ucu iyi Pahlı iğne vardır ve kötü Pahlı iğne künt bir ucu vardır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kapiller cam türü</td>
			<td>Sutter iğne çektirme modeli</td>
			<td>Isı</td>
			<td>Filaman</td>
			<td>Hız</td>
			<td>Gecikme</td>
			<td>Çekme</td>
			<td>Basınç</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kuvars</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilikat</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. İğne çektirme ayarları. Not: İğne çektirme ayarı farklı makine makine her laboratuar kendi iğne çektirme ayarlarını optimize etmek gerekir. Bu tablo Li ve ark. değiştirildi 21
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA-1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">Toplam embriyolar</td>
			<td>Transplantasyonu (%10 nem)</td>
			<td colspan="4">Transplantasyonu (%70 nem)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larva ölüm</td>
			<td>Larva ölüm</td>
			<td colspan="3">Yetişkin hayatta kalanlar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam (%)</td>
			<td>Toplam (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Toplam (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hiçbir enjeksiyon</td>
			<td>Hiçbir enjeksiyon</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su</td>
			<td>Su</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/µL</td>
			<td>20 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng/µL</td>
			<td>40 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng/µL</td>
			<td>80 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng/µL</td>
			<td>160 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng/µL</td>
			<td>320 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2. Enjeksiyon ve nakli yaşayanlar ve mutagenesis gore sgRNA ve Cas9 farklı konsantrasyonları enjeksiyonlari üzerinde dayalı. Bu tablo Li ve ark. değiştirildi 21

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation at JoVE.com

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

embryo-microinjection-transplantation-technique-for-nasonia

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

12.2K Görüntüleme.  University of California, Riverside. Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Video: Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Gelişim Biyolojisi

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Drosophila'da phiC31 İntegraz Aracılı Embriyo Transgenezi

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Yazar Spotlight: Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonunun Optimize Edilmesi

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Biyomühendislik

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

Mısır Planthopper Mikroenjeksiyonu, Peregrinus maidis, CRISPR / Cas9 Genom Düzenleme için Embriyolar