Bu yöntem, RNA içermeyen N proteinleri elde etmek için başka bir viral protein N'için refakatçi olarak bir viral protein P'kullanarak rekombinant viral protein ifade zorluklarıyla başa çıkmanın çeşitli yolunu kullanır. RNA içermeyen RSV N proteini, virüse özgü RNA'yı nükleapsid in vitro içine monte etmeden önce elde edilir. Yöntem diğer segmentsiz negatif duyu RNA virüsleri ile de kullanılabilir.
Ligasyon bağımsız klonlama yöntemi, birlikte ifade yapıları elde etmek için hızlı bir tekniktir. Neden veya seçmeli leke elektron mikroskobu ham hücrede büyük montajı kontrol etmek için hızlı bir yöntemdir. Size iki ipucu vermek istiyoruz.
İlk olarak, bir sonraki adıma geçmeden önce her adım için yüksek verim ve sağlam sonuçlar alın. İkincisi, kromatografi için uygun programlar kurun ve forsepsli ızgaraları toplama alıştırması yapın. N ve P ortak ekspresyonunun çift cistronic yapısı için, LB ortamında 37 santigrat derecede dört bir litrelik E coli BL21DE3 gerinim hücresi kültürü yetiştirin.
600 nanometredeki optik yoğunluk 0,6'ya ulaştığında, sıcaklığı 16 santigrat dereceye düşürin. Bir saat sonra, bir gecede 0,5 milimolar IPTG ile tedavi ile protein ekspresyonunda indüklenir. Ertesi sabah, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri 200 mililitre lizis tamponunda yeniden biriktirin.
Hücreleri sonication ile 15 dakika boyunca 3 saniye açık, 3 saniye nabız yoklayalım. Ve santrifüjleme ile lysates toplamak. Süpernatantı yaklaşık 10 mililitre boncuklu 2,5 ila 10 santimetre kobalt yerçekimi sütununa yükleyin.
5 ila 10 sütun hacmi lizis arabelleği ile önceden dengelenmiştir. Ve sütunu beş sütun B tamponu ve beş birim tampon C ile yıkayın.Proteini boncuklardan çıkarmak için iki birim tampon D kullanın. Ve Q sütununu beş bir mililitre hacimli QA tamponu ile dengele.
Seyreltilmiş numuneyi sütuna yüklemek için peristaltik bir pompa kullanın. Yüklenen Q sütununu taze QA ve QB tamponlarıyla birlikte HPLC makinesine eritin. Makineyi bir ila iki hacimli QB ve QA tamponlarıyla başarılı bir şekilde yıkamak için pompa yıkamayı çalıştırın.
Son yıkamadan sonra, akış hızını dakikada bir mililitreye ayarlayın ve fraksiyonları toplamak için 96 derin kuyu plakası kullanarak UV1'i 280 nanometreye ve UV2'yi 260 nanometreye ayarlayın. Daha sonra proteinleri elute etmek için her bir elüasyon maddesi konsantrasyonunun üç ila dört cildinden oluşan adım adım bir gradyan uygulaması kullanın, % 0 QB konsantrasyondan başlayarak ve yüzdeyi her seferinde% 5 artırın. N-0 P protein kompleksi %15 QB tampon konsantrasyonunda elüte olacaktır.
Proteini jel filtrasyonu ile izole edin, bire 30 santimetre küçük ölçekli arıtma kolonunda, E tamponu ile dengelenmiş.Daha sonra kesirleri içeren proteini SDS sayfası ile analiz edin. Virüse özgü nükleopapsit montajı için, saflaştırılmış N-0 P kompleksini bir saat boyunca oda sıcaklığında 1:1,5 moleküler oranda RNA oligo ile karıştırın ve kuluçkaya yatırın. Küçük ölçekli bir arıtma jeli filtrasyon kolonunu E. tamponu ile önceden dengele ve santrifüjleme ile herhangi bir yağışı ortadan kaldırın.
Üstnatant,boyut dışlama kromatografi sütununa yükleyin. Ve proteinin boyut dışlama kromatografi görüntülerini RNA montajı ile karşılaştırın ve hangi tepelerin birleştirilmiş N RNA, N-0 P ve serbest RNA olduğunu belirlemek için nükleik asit saflık oranlarını birleştiren protein tek başına kontrol örneklerini kontrol edin. Bir N RNA kompleksini birleştirmek için, tüm N RNA tepe kesirlerini toplayın, bir RNA ayıklama gerçekleştirin ve belirli RNA'nın uzunluğunu iki kez kontrol etmek için bir üre sayfası jeli çalıştırın.
Negatif leke elektron mikroskopisi için negatif bir leke ızgarası hazırlamak için, kaynatmak için 5 mL çift damıtılmış suyu ısıtmak için bir ısı plakası kullanın ve% 0.75 uranil formatlı boyama çözeltisi elde etmek için suya 37.5 miligram uranil formatında ekleyin. Çözeltiyi alüminyum folyo kaplı bir behere aktarın. Ve 10 molar sodyum hidroksit dört mikrolitre ekleyin.
Işıktan korunan 15 dakikalık karıştırmadan sonra, çözeltiyi 0,22 mikron filtreden bir test tüpüne filtreleyin. Sürekli karbon kaplı elektron mikroskopi ızgaralarını hidrofilik hale getirmek için, ızgaraları bir güç kaynağına bağlı bir odaya yerleştirin ve ızgaralara negatif yüklü iyonlar uygulayın. İkiye iki parafilm şeridini kesin ve katlayın.
Şeridin bir ucuna iki adet 40 mikroliter damıtılmış su damlası ekleyin. Ve diğer uca %0.75 uranil formatlı boyama çözeltisi iki adet 40 mikroliter damlası. Her ızgaraya üç mikrolitre protein örneği ekleyin.
Bir dakika sonra, ızgaraları şişirme kağıdına karşı engelleyin ve ızgaraları damıtılmış su damlacıklarına iki kez batırın. Ve ilk boyama çözeltisi damlacıkta bir kez. Daha sonra ızgaraları, fazla leke çözeltisini çıkarmak için ızgaraları şişkin kağıda karşı şişirmeden ve görüntülemeden önce ızgaraların havayla kurumasını izin vermeden önce, ızgarayı 30 saniye boyunca ikinci boyama çözeltisi damlacığına batırın.
Bu protokol kullanılarak, büyük ölçekli çözünür bir hetero dimerik solunum yolu senksiyal virüs N0 P kompleksi elde edilebilir. E coli'de, P proteinlerinin N ve N-terminal bölümlerinin tam uzunluğu, N proteini üzerindeki 10 X His etiketi ile birlikte ifade edilir. UV absorbansı nükleik asit saflık oranına dayanarak, N0 P hem tam uzunlukta N hem de N-terminal P içeriyordu, ancak hücresel RNA içermİyordu.
Saflaştırılmış N0 P daha sonra uyarılabilir ve gösterildiği gibi belirli RNA oligos ile inkübasyon yoluyla elektron mikroskopi ızgaralarındaki parçacıklar gibi nükleapsid içine monte edilebilir. Proteini arındırırken, kolon saflaştırması sırasında hava kabarcıklarından kaçının ve numuneyi sütuna yüklemeden önce pH ve tuz konsantrasyonunu ayarlamak için QA tamponu ile seyreltin. Izgaraların kirlenmesini önlemek için elektron mikroskopi ızgaralarını dış kenarda tutmaya özen göster.
Bu, ister solak ister sağ el sarmal yapı olsun, pozitif olmayan RSV genom paketleme sorularını belirlememize yardımcı olacaktır. Bu prosedürlerin ardından ve RSV polimeraz aktivitesi için bir RNA şablonu gerçekleştirilmesi gerçekleştirilebilir. Ve bu RSV viral spesifik nükleocapsid yüksek çözünürlüklü kriyo EM analizi için kullanılabilir.
