Protokolümüz, hem istirahat altında hem de agonist veya inhibitör tedavisi sonrası gerçek zamanlı olarak hava yolu yüzey sıvısının veya ASL pH'ın dinamik ölçümüne olanak sağlayan ilk protokoldür. Bu yöntem, hücre dışı pH düzenlemesiile ilgili iyon kanallarının ve ışınlayıcıların belirlenmesine yardımcı olur ve bunun kanser gibi önemli olduğu diğer hücre sistemlerine uygulanabilir. Şimdi daha önce yayınlanmış yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yeni tekniği gerçekleştirmek için nispeten basittir.
Özel ekipman gerektirmez. Ve hava sıvı arayüzü altında birden fazla kültürde aynı anda ASL pH ölçümleri yapabilir, ya da ince film koşulları. Daha da önemlisi, bu yeni teknik sadece kistik fibrozis için değil, aynı zamanda astım ve KOAH gibi diğer kronik hava yolu hastalıkları için de yeni tedavi etkilerini değerlendirme potansiyeline sahiptir.
Kültür en az 28 gün sonra, hücre kültürü kuluçka 20 dakika boyunca Krebs tampon çözeltisi içeren bikarbonat 150 mikrolitre ile bir insan hava yolu epitel hücre kültürünün apikal yüzeyi yıkayın. Kuluçka sonunda, epitel bozmadan yıkama dikkatlice aspire etmek için, bir aspirasyon pompasına bağlı steril P200 pipet ucu ile steril bir cam pipet kullanın. Hava sıvı arabirimini geri yüklemek için apikal yüzeyde mümkün olduğunca az sıvı kalmalıdır.
Sonra hücreleri 30 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin. Arka plan ölçümü yapmak için plaka okuyucuyu ve bilgisayarı açın. Panoyu açtıktan sonra Spark 10M'yi tıklatın ve sıcaklık kontrolünü 37 dereceye ayarlayın.
Daha sonra gaz kontrolünü açın ve karbondioksiti %5'e ayarlayın Sıcaklık ve gaz hedeflerine ulaştığında plaka okuyucu çekmecesini açın ve her iki tarafa damıtılmış su altı mililitre dolu bir nem kaseti yerleştirin. Hücre kültür plakasının kapağının ve alt kapağının temiz olduğunu onaylayın ve plakayı nem kasetine yerleştirin, kapağı tekrar takın ve çekmeceyi kapatın. Kıvılcım Yöntemi düzenleyicisini açın, uygun plaka şablonunu seçin ve deneme sırasında izlenecek kuyuları seçin.
Bir sıcaklık ve karbondioksit kontrol paneli ekleyin ve sırasıyla 37 derece santigrat ve% 5 panelleri ayarlayın. Sonra sıcaklık / gaz kutuları için bekleyin işaretleyin. Kinetik döngü paneli ekleyin ve döngü türü olarak süreyi seçin.
Süreyi beş dakikaya ayarlayın ve sürekli okuma elde etmek için denemenin aralık türünü tanımlanmamış olarak ayarlayın. Kinetik döngü içinde, pH duyarlı ve pH duyarsız floresan boyalar için ayrı ayrı ayarlanacak iki floresan yoğunluk panelleri eklemek için sürükle ve bırak işlevini kullanın. PH'a duyarlı boya için uyarma ve emisyon dalga boyunu sırasıyla 560 ve 590 nanometreye ayarlayın.
Ve pH duyarsız boya için sırasıyla 495 ve 520 nanometre. Yanıp söner sayısını 30'a, z konumunu da her florofor için 33, 200'e ayarlayın. 4, 750 mikrometre lik kenarlıklı daire başına üçer üç olarak tanımlanan kullanıcıya göre birden çok okuma ayarlayın.
Arka plan ölçüm okumasını başlatmak için başlat'ı tıklatın ve nem kasetinin kapağının yerinde olduğunu doğrulamak için tamam'ı tıklatın. Ölçüm sonunda, plakayı plaka okuyucudan doku kültürü güvenlik kabinesine aktarın ve hücrelerin apikal yüzeyine taze hazırlanmış üç mikrolitre dekstran-çiftfloresan boya çözeltisi ekleyin. Sonra gece hücre kültürü kuluçka için plaka dönün.
Kinetik ölçümü için arka plan ölçümleri için kullanılan yöntem dosyasını açın. Tüm parametreler ayarlandığında, plaka okuyucu çekmecesini açın ve nem kasetini takın. Temiz plakayı kapağıyla nem kasetine yerleştirin ve floresan okumalarını başlatmak için start'a tıklayın.
Daha sonra tamam'a tıklayın, nem kasetinin kapağının yerinde olduğunu onaylayın. En az 12 döngüden sonra, denemeyi bölmek için duraklatma'yı tıklatın ve uygun numunelere herhangi bir ilaç veya agonistleri uygulayacak şekilde plakayı çıkarın. Plakayı tepsideki nem kasetine geri verin ve devam etmeden önce nem kasetkapağını yeniden konumlandırın, ASL pH'ı daha fazla kaydedin ve tedavinin etkisini izleyin.
Yerinde pH kalibrasyonu için plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve basolateral çözeltiyi aspire edin. Bazolateral bölmeye 750 mikrolitre yüksek tamponlu standart eğri çözeltisi ve apikal yüzeye bir mikrolitre çözelti ekleyin. Plaka okuyucudaki karbondioksiti kapatın ve plakayı nem kasetine geri döndürün.
Sonra gösterildiği gibi aynı parametreleri ile plaka okuyucu ayarlayın, ama hiçbir karbondioksit ile, ve floresan okumaları her beş dakikada bir ila bir buçuk saat için başlatın. Veri analizi için, her örnek için ortalama verilerin tümünü seçin ve arka plan dosyasındaki her iki dalga boyu için koşul ve verileri kopyalayıp yeni bir dosyaya yapıştırın. Sonra her kuyu ve her dalga boyu için ortalama arka plan hesaplayın.
Kalibrasyon ve kinetik verileri aynı şekilde kopyalayıp yapıştırdıktan sonra, her dalga boyu için her veri noktasından arka planı çıkarın. Her zaman noktası ve her örnek için, pH duyarlı ve pH duyarsız floresan arasındaki oranı hesaplayın. Her zaman noktası için, oranlardan standart bir eğri oluşturun ve x ekseninde bilinen pH değerlerini ve y eksenindeki oranları çizin.
Oranların kararlı olduğu zaman noktasını belirleyin, doğrusal bir regresyon çizgisine sığın ve bu çizgi için denklemi edinin. Daha sonra, her zaman noktası için pH'ı hesaplayın ve pH'ı y ekseninde ve x ekseninde zaman üzerinde çizin. Aynı pH ve aynı konsantrasyonda hücresi olmayan bu temsili ön deneyde, boyanın hacmine bağlı olarak pH duyarlı ve pH duyarsız emisyon oranları farklıydı.
Ayrıca, aynı pH ve aynı hacimde, farklı boya konsantrasyonları farklı oran değerleri sağlamış, hacim veya boya konsantrasyonundaki değişikliklerin emisyon oranından hesaplanan pH'ın mutlak değerini etkilediğini gösterir. Buna ek olarak, sıcaklık dengesi için gereken süre, boya hacmi veya konsantrasyonu ne olursa olsun yaklaşık 15-20 dakikadır. Tek bir global standart eğriden elde edilen ASL pH değerleri kistik olmayan fibrozis ile kistik fibrozis kültürleri arasında anlamlı bir fark göstermektedir.
Oysa, ASL pH kistik fibrozis ve non-kistik fibrozis insan hava yolu epitel hücreleri arasında anlamlı olarak farklı değildir pH bağımsız standart eğrileri hesaplanır. Bu nedenle, her deney için ve her deney içinde, her donör numune için bağımsız kalibrasyon eğrileri oluşturmak önemlidir, kalibrasyon eğrileri birlikte ortalamalandığında, daha yüksek pH duyarlı, pH duyarsız oran değerleri daha asidik pH gösteren kistik fibrozis kültürlerde bulunur. Beklendiği gibi, basolateral forskolin eklenmesi önemli ölçüde olmayan kistik fibrozis kültürlerde ASL pH artar.
Bu hücreler steril durumda tutulduğundan, yıkanabilir, yeniden beslenebilir ve birkaç gün sonra gelecekteki deneyler için kullanılabilir. Tüm biyolojik insan örnekleri potansiyel olarak tehlikeli olarak kabul edilmelidir. Bu yüzden numunelerinize bağlı olarak uygun düzeyde hapsedilme ve kişisel koruyucu ekipman kullandığınızdan emin olun.
Donörler arası değişkenliği azaltmak ve doğruluğu artırmak için her numune seti için arka plan ölçümlerini ve pH kalibrasyonlarını gerçekleştirmek önemlidir.
