Bu protokol, bir anti-paralel çapraz bağlayıcı olan MAP65 kullanılarak mikrotübül taktoidlerinin kendiliğinden kendi kendine organizasyonunu sağlar. Bu sistem mikrotübül organizasyonunu ve mitotik iğler gibi biyolojik sistemleri anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikrotübüller için yüksek oranda tekrarlanabilir ve birçok laboratuvar tarafından erişilebilen iğ benzeri şekilleri yeniden oluşturabilen minimalist bir sistem olmasıdır.
Bu yöntem sadece hücresel sistemler için geçerli değildir, aynı zamanda mezo ölçekli sıvı kristal çalışmaları için bir model olarak da hizmet edebilir. Tübülin hazırlamak için, önce eksi 80 santigrat derece dondurucudan bir miligram liyofilize tübülin içeren etiketsiz bir tübülin alikotunu çıkarın ve buz üzerinde tutun. Ardından, 200 mikrolitre soğuk PEM-80 ekleyin.
Tüm liyofilatı çözmek için, tüpü 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Daha sonra, eksi 80 santigrat derece dondurucudan 20 mikrogram liyofilize tübülin tozu içeren rodamin etiketli bir tübülin tübülin tüpü çıkarın ve buz üzerinde tutun. Daha sonra, dört mikrolitre soğuk PEM-80 ekleyin ve tüm liyofilatı çözmek için tüpü 10 dakika buz üzerinde tutun.
Liyofilize tübülinler çözündükten sonra, dört mikrolitrelik rodamin etiketli tübülin çözeltisine 100 mikrolitre yeniden askıya alınmış etiketsiz tübülin çözeltisi ekleyin. Ardından, çözeltileri altı ila yedi kez çok yavaş bir şekilde borulayarak karıştırın. Kalan 100 mikrolitre etiketsiz tübülin çözeltisini saklamak için, önce çözeltiyi dondurmak için tüpü sıvı azot içine yerleştirin, ardından tüpü ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede tutun.
Daha sonra, tübülin karışımını her birine 15 mikrolitre ekleyerek yedi yeni tüpe dağıtın. Tüpleri daha önce gösterildiği gibi sıvı azotta dondurun ve ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. Deneyleri gerçekleştirmek üzere akış odalarını monte etmek için, önce bir cam slaytı çift damıtılmış suyla temizleyin ve tüy bırakmayan bir laboratuvar mendili ile kurulayın.
Ardından, slaytı önce etanol ile temizleyin, ardından çift damıtılmış su ile temizleyin. Bir akış yolu oluşturmak için, 40 ila 50 milimetre uzunluğunda çift taraflı bir bant parçası kesin. Ardından, iki ince bant şeridi oluşturmak için aralarında bölün ve iki şeridi slayta beş ila sekiz milimetre aralıklarla yerleştirin.
Ardından, silanize kapak fişlerini akış yolunun üzerine yerleştirin. Ardından, sürgüyü kapatın ve kapak, bir kalemin arkasıyla bant bölgesine hafifçe bastırarak çift taraflı bant şeritlerini kaydırdı. Conta iyi yapılmışsa, bant yarı saydamdan berraklığa dönmelidir.
Kenarlardaki ekstra bandı çıkarmak için, bandı bir tıraş bıçağı ile kesin ve akış odası girişinden sadece bir milimetre uzakta bırakın. Ardından, odayı uygun deneysel parametrelerle etiketleyin Dokunaç deneylerini gerçekleştirmek için, önce gerekli tüm reaktifleri buz üzerinde çözün ve çalışma sırasında buz üzerinde saklayın. Daha sonra, akış odasını, içinde hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için PEM-80'de çözünmüş 20 mikrolitre% 5 iyonik olmayan blok kopolimer yüzey aktif madde ile haznenin her iki ucunda küçük damlalarla kaplayın.
Ardından, akış odasını Petri kabından yapılmış nemli bir odada ıslak, tüy bırakmayan bir laboratuvar mendili ile en az beş ila yedi dakika boyunca saklayın. Daha sonra, PEM-80, GMPPCPP, Pluronik F-127, ditiyotreitol, glikoz, polietilen glikol, daha önce yapılan tübülin karışımı ve MAP65'i GFP MAP65 ile karıştırarak beş ila altı kez pipetleyerek steril bir tüpte görselleştirmek için karıştırın. Daha sonra, tübülin-MAP karışımı tüpüne önceden karıştırılmış bir glikoz oksidaz ve katalaz çözeltisinin bir mikrolitresini ekleyin ve yedi ila sekiz kez boru çekerek tekrar karıştırın.
Çözeltinin toplam hacmini ayrı odalarda kullanılmak üzere iki bölüme bölün. Bu arada, akış odasına daha önce eklenen sıvı, haznenin diğer ucunda tüy bırakmayan bir laboratuvar mendili kullanılarak kılcal hareketle uzaklaştırılmalı ve akış odasına tübülin-MAP karışımının eklenmesi sağlanmalıdır. Numune odanın içine tamamen girdikten sonra, odanın iki ucunu beş dakikalık epoksi kullanarak kapatın ve mikrotübül taktoidlerini çekirdeklendirmek ve büyütmek için yaklaşık 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede tutun.
Taktoidleri floresan mikroskobu ile görüntülemek için, floresanda yeterli ışık toplamak için 60X veya daha yüksek büyütmede 1.2 veya daha fazla sayısal açıklığa sahip hedefleri kullanın. Görüntüleri ücretsiz bir metal oksit yarı iletken veya şarj bağlantılı bir cihaz kamerasıyla kaydedin. Numuneyi korumak için, 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir çevre odasında saklayın.
Alternatif olarak, sıcak hava kademe ısıtıcıları ve dolaşımdaki ılık suya sahip objektif sıcaklık kontrollü yakalar da dahil olmak üzere diğer kademe ısıtıcıları bu amaçla kullanılabilir. Rodamin tübülin için doğru floresan için uygun uyarma kaynakları gerekli olduğundan, kaliteli görüntüler için numunede en az bir miliwatt güce sahip 561 nanometrelik bir lazer kullanın. Bununla birlikte, GFP MAP65 için, uyarma kaynağını 488 nanometrelik bir lazerle değiştirin.
Geniş alan epifloresan mikroskobu kullanıyorsanız, 540 12.5 nanometre uyarım, 545 nanometre 12.5 nanometre kesim dikroik ve 575 nanometre uzun geçişli emisyonlu bir rodamin filtre küpü kullanın. GFP MAP için, 480 15 nanometre uyarımlı, 505 nanometre dikroik 15 nanometre kesilmiş ve 515 nanometre uzun geçişli emisyonlu bir GFP filtre küpü kullanın. Aydınlatma gücünün ve pozlama sürelerinin kameranın yoğunluk ölçeğinin doygun olmayacağı şekilde olmasını sağladıktan sonra, hem kırmızı hem de yeşil kanallarda 100'den fazla taktoid görüntülemek için farklı alanların en az 10 görüntüsünü alın ve bunları analiz için 16 bit TIFF görüntüleri olarak kaydedin.
Bu protokolü kullanarak, oluşumu 30 dakika içinde tamamlanan mikrotübül taktoidleri mikroskop altında doğrudan görselleştirilebilir. Taktoidler hem tübülin kanalında 561 nanometrelik bir lazer hem de MAP65 kanalında 488 nanometrelik bir lazerle görülebilir. Görüntüler aynı zamanda birbirleriyle mükemmel bir şekilde örtüşüyor.
Bu yöntemde, taktoidlerin uzunluğu ve genişliği de ölçülebilir. Bir taktoidin yoğunluk profilinin genişliğine göre değiştiği bulunmuştur. Dahası, mikrotübül taktoidlerinin hareketsiz doğası, foto-ağartmadan sonra floresan geri kazanımı veya foto-ağartmadan sonra herhangi bir floresan iyileşmesi göstermeyen FRAP deneyleri ile gösterilmiştir.
Öte yandan, FRAP deneyleri, foto-ağartmadan sonra kademeli bir iyileşme ve floresan gözlenebilen MAP65'in hareketli bir doğasını ortaya çıkardı. MAP65 tarafından yapılan bu floresan geri kazanımı, genliği ve geri kazanımın zaman ölçeğini bulmak için yükselen üstel bozunmaya uygun olabilir. Dokuntoid deney kısmı 10 ila 12 dakika içinde tamamlanmalıdır, çünkü tübülin buz üzerinde hızlı bir şekilde kötüleşebilir, bu da taktoidlerin çekirdeklenmesine zarar verebilir.
Farklı mikrotübül çapraz bağlama proteinleri ve çapraz bağlanan motor proteinleri, mikrotübülleri hareket ettirebilen enzimler ile gelecekteki çalışmalar, mitotik iğin kendi kendine organizasyonu hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarmaya devam edecektir.
