Bu yeni metodoloji bize üç boyutlu derlemeler inşa sağlar, istenilen bireysel hücrelerden uyarlanmış, nonspesifik hidrofilik polimer içeren sulu bir tampon çözeltisi, kararlı hücre-hücre teması kurarak. Bu videoda, istenilen tek hücreleri nasıl manipüle ettiğimizi ve yapay iskele olmadan 3Boyutlu hücresel derlemeler nasıl inşa ettiğimizi göstereceğiz. Burada bir örnek olarak Dextran ile bizim orta deneysel prosedür gösterecektir.
Başlamak için, 25 kübik bir şişe de, 25 santimetreküp lük bir şişe de, DMEM beş mililitre ile NAMRU fare meme bezi epitel hücreleri korumak, 10% FBS ve 1% Penisilin-Streptomisin içeren, iki ila üç gün boyunca bir 25 santimetreküplük şişe. Devam etmeye hazır olduğunuzda, ek DMEM kaldırmak için bir aspiratör kullanın ve PBS üç ila beş mililitre ekleyin, bu hücreleri yıkamak için önceden ısıtılır 37 santigrat derece. Bir aspiratör kullanarak, tüm PBS'yi şişeden çıkarın.
37 santigrat derecede önceden ısıtılmış trypsin 1.5 mililitre ekleyin. En az bir ila iki dakika boyunca 37 santigrat derecede bir CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yat. Bundan sonra, % 10 FBS ve% 1 Penisilin-Streptomisin içeren DMEM 3.5 mililitre ekleyin.
Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika 417 kez G'de santrifüj edin. Sonra, orta aspire.
%10 FBS ve %1 Penisilin-Streptomisin içeren beş milimetre taze DMEM ekleyin. Ve gerekirse, üreticinin talimatları ile belirtildiği gibi hücreleri kriyokoruma için bir kriyopreservation çözüm kullanın. İlk karışımı 10 mililitre DMEM 10% FBS ve 1% Penisilin-Streptomisin ile 0.8 Gram Dextran ile takviye, mililitre Dextran çözeltisi başına 80 miligram hazırlamak için.
Bu Dextran çözeltisinin 200 mikrolitresini daha önce hazırlanmış hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresiyle karıştırın ve mililitre Dekstran orta sıyrık başına 40 miligram içeren bir hücre süspansiyonu oluşturun. Başlamak için lazeri açın, kırmızıdan kızılötesi bölgeye doğru dalga boyuna sahip bir lazer ışınının kullanımının en etkili olduğunu unutmayın. Daha sonra yazılım simgesini çift tıklayarak yazılımı açın.
Kamera simgesini çift tıklatın ve ilgili ekranın ortaya çıkar olacağını unutmayın. Ardından ışık yayan diyot, odak ayarlaması ve ekranlarını da açmak için hareketli sahne için simgelere çift tıklayın. İlk alt kapak cam slayt üzerine iki cam boşluk lar yerleştirin.
Transfer 20 mikrolitre, daha önce hazırlanmış Dextran alt kapak cam slayt üzerine hücre süspansiyon takviye. Daha sonra üst kapaklı cam kaydırağı hücre süspansiyonuna kaplayan boşluklara yerleştirin. Su daldırma mikroskopisi için 10 mikrolitre distile su ile örnek hücreyi alt objektif merceğe yerleştirin.
10 mikrolitre distile su kullanarak örnek hücrenin üst kısmındaki üst objektif merceği takın. Ardından, LED'i açmak için mikroskop aydınlatma penceresindeki açma-kapama düğmesini tıklatın. Hedef konumlandırma penceresindeki yön düğmelerine tıklayarak, odak noktası olana kadar örnek le alt objektif lens arasındaki mesafeyi ayarlayın.
Sinyal zayıflama penceresinde her lazer ışınının yoğunluğunu 1500 miliwatt'a ayarlayın. Daha sonra, lazer ışınlarını birinci ve ikinci konumdaki lazer ışınlarını ışınlamak için iki lazer simgesini tıklatın. Örnek konumlandırma penceresindeki yön düğmelerine tıklayarak örnek aşamasını bir hücre birinci konumda sıkışıp kalana kadar hareket ettirin.
Başka bir hücre ikinci konumda sıkışıp kalana kadar ikinci konumu gösteren imleci tıklatın ve sürükleyin. Başlamak için, tek bir hücreyi manipüle edin, böylece başka bir hücreyle temas halinde olur. Bu durumu 300 saniye boyunca koruyun, böylece hücre 300 saniye boyunca bir lazere maruz kalır.
X-y eksenini kaydedin. Başka bir hücreyi bindirme ve rasgele bir 2B hücre derlemesi oluşturmak için ilk iki hücreye taşıyın. Sonra bir 3D hücresel montaj oluşturmak için sahne yukarı ve aşağı taşıyın.
Lazer kapatıldıktan sonra bile montajın hala kararlı olduğunu doğrulayın. Bu çalışmada çözünür polimerler 3D tek hücreli montajların yapımında kullanılmaktadır. Çift ışınlı optik cımbız kullanılarak oluşturulan örnek bir yapı burada gösterilmiştir.
Deneme başarılı olursa, bu hücresel derlemeler lazer kapatıldıktan sonra bile sabit kalır. Bu yeni metodoloji doğal hidrofilik polimer ile sulu bir ortamda 3D hücresel montajları inşaat içindir. Bu son derece rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanında güçlü araçlar dan bazıları ile yeni nesil hücresel meclisleri bu tür inşaat başlaması bekleniyor.
