Burada, kristal selüloz içeriğinin tahmin edilmesi için dünyanın en yaygın kullanılan yöntemi olan Updegraff yöntemini gösteriyoruz. Selüloz temel olarak beta-1, 4 glikosidik bağlarla birbirine bağlı glikoz monomerlerinden oluşur. Bu protokolü beş aşamaya ayırdık.
İlk aşamada bitki biyokütle malzemesini hazırlıyoruz. İkinci aşamada, ham hücre duvarını çıkarıyoruz. Üçüncü aşamada, Updegraff'ın numunelerimizden hemiselüloz ve lignin çıkarılmasına yardımcı olan asetik asit ve nitrik asitten oluşan Updegraff tedavisini kullanıyoruz.
Dördüncü fazda glikoz monomerlerini üreten sülfürik asit yardımıyla asit hidrolizine tabi tutmaktadır. Son olarak, beşinci aşamada, kristal selüloz içeriğini tahmin etmek için anthrone testini kullanıyoruz. Bitki malzemesini seradan toplayın, suyla iyice yıkayın, iki gün boyunca hava kurutun, dokuyu ayırın ve dokuyu ayrı ayrı etiketlenmiş kaplara aktarın ve 10 gün boyunca 49 santigrat derecede inkübatörde kuluçkaya yatırın.
Son olarak makas veya bıçak kullanarak parçalara bölün. Dokuyu dondurun ve düzgün toz haline ince öğütmek için harç ve pestle içine yükleyin veya alternatif olarak Dondurucu / Değirmen kullanın. Burada, Dondurucu / Değirmen kullanarak gösteriyoruz, bu yüzden doku örneklerimizi bu taşlama şişelerine yüklüyoruz ve Dondurucu / Değirmen'e yerleştiriyoruz ve üç döngü boyunca 10 CP hızını çalıştırıyoruz.
Doku tozu burada gösterildiği gibi Falcon tüpünde toplanır. 20 mg doku tozunun ağırlığını ölçün ve önceden tartılmış iki mL tüpe aktarın. Proteinleri çıkarmak için bir mL protein çözünürlüğü tamponu ekleyin. girdap.
15,000 RPM'de 5 dakika santrifüj. Üstnatant atın. Bu adımı iki kez daha yineleyin.
Tutulan peletin içine bir mL steril su ekleyin. girdap. 15,000 RPM'de 5 dakika santrifüj. Bu adımı iki kez daha yineleyin.
Tutulan peletin içine bir ML%70 etanol ekleyin. girdap. Önceden ısıtılmış 70 derecelik bir bloğa bir saat boyunca aynı anda sallanarak aktarın. Bir saatlik inkübasyondan sonra, beş dakika boyunca 15.000 RPM'de santrifüj yapın.
Bu adımı bir kez daha yineleyin. Kaydedilen peletin için% 100 methylone bir mL ekleyin. girdap. 15,000 RPM'de 5 dakika santrifüj.
Bir mL kloroform metanol ekleyin. girdap. 15,000 RPM'de 5 dakika santrifüj. Süpernatant atın ve bir mL aseton ekleyin. girdap.
Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yaslanın. 15,000 RPM'de 5 dakika santrifüj. Süpernatant'ı yeniden atın ve bir gecede 37 santigrat derecede havayla kurutun veya vakumla kurutarak devam edin.
Numunelerinizi vakumlu kurutucuya yükleyin ve iki ila üç saat boyunca veya pelet tamamen kuruyana kadar kurulayın. Önceki adımdan elde edilen hücre duvarı ekstresinin beş mg'ını tartın. İki mL vidalı kapak tüpüne aktarın.
Ayrıca bu noktada pozitif kontrol ekleyin. Bu amaçla iki mg Whatman filtre kağıdı kullanın. İki mL vidalı kapak tüpüne aktarın.
Tartılan her hücre duvarı ekstresine 1,5 mL Updegraff reaktifi ekleyin. Girdap ve 30 dakika önceden ısıtılmış bir blokta 100 santigrat derecede kuluçkaya yaslanın. 30 dakika kuluçkadan sonra bir rafa aktarın.
10 dakika boyunca bankta soğumasını bekleyin. 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de santrifüj. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.
Bir mL steril su ekleyin. girdap. 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de santrifüj. Süpernatantın 500 mikrolitresini atın.
Bir mL aseton ekleyin. girdap. 15,000 RPM'de 5 dakika santrifüj. Üstndan birinin bir mL'sini atın.
Bir mL aseton ekleyin. girdap. 15,000 RPM'de 5 dakika santrifüj. Üsttant tamamen atın.
Bir mL aseton ekleyin. girdap. 15,000 RPM'de 5 dakika santrifüj. Üstnatant atın.
Bir gecede 37 santigrat derecede kurutun. Bir gecelik bir kuluçkadan sonra, bir rafa aktarın. %67 sülfürik asit bir mL ekleyin. girdap.
Aynı anda sallanarak bir saat boyunca 25 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Bir saatlik inkübasyondan sonra, peletin tamamen çözüldüğünden emin olun. Rafa aktarın.
Bu selüloz ekstraksiyonunun son adımıdır. Şimdi numuneler numune seyreltme için hazır. Numune seyreltme için, önceki adımdaki her numuneden 10 mikrolitre kullanın ve 490 mikrolitre steril su ekleyin.
Tüm deneysel örnekler için bunu tekrarlayın. Glikoz standart eğrisi hazırlığı için, mL glikoz başına bir mg taze stok hazırlayın ve 20 mikroliter artışlarla mL glikoz başına bir mg ekleyerek 200 mikrogram konsantrasyonlarına sıfır mikrogram hazırlayın ve son hacmi steril su ile bir mL'ye oluşturun. Bir vidalı kapak tüpüne hazırlanan her standarttan 500 mikroliter alın ve bir mL% 0.2 anthrone ekleyin.
Ve şimdi numuneler bir kron tahlil için hazır. Yeni hazırlanmış bir mL anthrone ekleyin. Girdapla hemen karıştırın ve buza aktarın.
Tüm standartlar ve numuneler için aynı şekilde tekrarlayın. Ardından 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış 100 derecelik bir bloğa aktarın. 10 dakika kuluçkadan sonra, buza aktarın ve buzda beş dakika kuluçkaya yatır.
Kuluçkadan sonra, her numuneden 200 mikrolitreyi üç kopya halinde alın. Hem standartlar hem de numuneler için aynı şekilde tekrarlayın. Ve dolu bir 96 kuyu plakası multimode dedektörüne yüklendi.
Smart Max Pro programını kullanarak filtre ayarını 620 nanometre olarak ayarladık. Plaka tipi 96 kuyu tipine. Tüm okuma alanını seçin.
Tamam'ı tıklatın. okumak. Tablayı oku. Selüloz içeriğinin daha fazla analizi ve tahmini için Excel sayfasında toplanacak olan hem standartların hem de örneklerin absorbans okumalarını elde edersiniz.
Glikoz standart eğrisi, x ekseninde mL başına mikrogram olarak glikoz konsantrasyonları ve y ekseninde 620 nanometrede ilgili konsantrasyonun normalleştirilmiş absorbans değerleri kullanılarak hazırlanır. Örnek kristal selüloz içeriğini tahmin etmek için kullandığımız çizilmiş dağılım grafiğinde m ve c değerlerine sahip regresyon çizgisini elde ediyoruz. İlk adımda, 620 nanometrede OD değerlerinin ortalamasını aldık.
Ve sonra boş değeri çıkararak verileri normalleştirdik. Standart eğrideki regresyon çizgisinin önceki adımından c ve m değerlerini taktığımız x formülünün OD eksi c/m'ye eşit olduğunu kullanarak glikoz konsantrasyonunu hesaplıyoruz. Anthrone test için kullanılan toplam hacim 500 mikrolitre olduğundan, seyreltme faktörü iki ile böleriz.
Kullanılan örnek hacmi sadece 10 mikrolitre olduğundan, mL konsantrasyonu başına mg'a eşit olan mikrolitre glikoz konsantrasyonu başına mikrogram elde etmek için 10'a daha fazla böleceğiz. Ve sonra işlemdeki nem kazancı olan nem faktörü 1.11'i kullandık. Ve son olarak, yüzde kristal selüloz içeriğini, beş mg'a yakın olan hücre duvarı ağırlığıyla bölerek hesaplıyoruz ve yüzdeyi elde etmek için 100 ile çarpıyoruz.
Daha sonra, üç biyolojik kopyanın kristal selüloz içeriğinin ortalamasını adlaarak bireysel örneklerin değerini elde ettik, bu da üç biyolojik kopyanın başka bir deneysel çizgi ortalamasıyla karşılaştırılacak. Ve t-testi, önem düzeylerini test etmek için kullanılabilir. Burada, A tablosunda, konsantrasyonun tablo değerlerini ve ilgili OD'yi 620 nanometrede gösteriyoruz, bu da iki deneysel çizgi arasındaki selüloz içerik farklılıklarını elde etmek için C'de kullanılan m ve c değerleriyle bir dağılım grafiği ve bir gerileme çizgisi çizmek için daha fazla kullanıldı.
Sonuç olarak, her iki örnek de selüloz farklılıklarını göstermektedir. İzlerken teşekkürler.
