The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.

Glikoz ve Ksiloz Verimi 1. Yüksek verim tayini enzimatik sakarifikasyon 9,29 takiben <ol><li> Numune Hazırlama (De-Tutkal, Taşlama, Ekstraksiyon, Ön İşlem) <ol><li> Wiley değirmen, bu parçacıklar, bir 20 ağ üzerinden geçmesi (850 um) elek kullanılarak her bir biyokütle, örneğin, en az 300 mg öğütün. Anti-statik fermuarlı üst torba transfer (tipik bar kodlu) ve barkod veritabanına kayıt örneği bilgileri. </li><li> Dikkatle, çay-bag (mürekkep veya işaretleyici kullanmayın, kalemle) önlemek için biyokütle üzerinde uçlarını katlamak için emin olmak, Sallama çaylar sıvayıp bir numaralı yaklaşık 250 mg ya da anti-statik torbasından zemin biyokütle daha ekleyin de-starching ve ekstraksiyon sırasında kayıp. </li><li> Kalay kaplı bakır tel kullanılarak kapalı teabag sarın. Her barkodlu numune için teabag numarasını kaydedin. </li><li> Ticari enzimlerin (tipik haliyle,% 0.25 (v / v) glukoamilazını (~ 1600 AGU / L) &#39;den de-kolalama enzim çözeltisi hazırlayın% 1.5 (v / v) alfa-amilaz, 0.1 M sodyum asetat (~ 2900 KNU-S / L) (pH 5,0)). Toplu biyokütle gramı başına 16 ml veya 120 çay poşeti örnekleri başına 500 ml hazırlayın. Not: Zemin biyokütleden nişasta çıkarma yeteneğine sahip bir enzim yüklemeler yüklemeleri ve oranlar bir dizi ile sindirmeden sonra nişasta için test ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. </li><li> Plastik bir kap içinde, dökme zemin biyokütle 1 gramı başına de-kolalama enzim çözeltisi 16 ml ekleyin. Bir parti de-Tutkal protokolü için, tampon, enzim çözeltisi, 500 ml 120 teabags ekleyin. </li><li> Mümkün olan nişastayı atmak üzere 120 rpm&#39;de, 24 (± 4) saat 55 ° C&#39;de bir çalkalayıcı içinde inkübe edin. </li><li> De-kolalama inkübasyondan sonra, durulama ve 30 dakika için deiyonize su birkaç litre biyokütle ıslatın. Kaskad Sıcak sıvı etanol neden çözelti seviyesinde bir ani ve şiddetli bir artışa neden olabilir çözelti içinde gaz kabarcıklarının darbeleme (oluşumuna neden olabilir buffer tuzlarını yok etmek bu işlemi iki kez daha tekrarlayınekstraksiyon sırasında reaksiyona damar) üzerinden. </li><li> De-kolalı biyokütle ayrıntılı durulama ardından, çıkarılması için Soxhlet sütuna teabags yerleştirin. Resim yüksük Bu aşama için gereklidir. </li><li> % 95 etanol kullanılarak, Soxhlet reflü kurmak ve 24 saat için örnekler ayıklayın. </li><li> Soxhlet reaktörden Sallama çaylar çıkarın ve düz tepsi üzerinde tek kat olarak yayılır. </li><li> Numuneler, bir çeker ocak içinde, bir gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Sallama çaylar önüne sermek ve orijinal barkodlu anti-statik poşetler kurutulmuş biyokütle dönün. Not: anti-statik poşetler kullanım özellikleri, biyokütle statik elektriği azaltarak geliştirmeyi etkilidir. Diğer depolama seçeneği kullanıldığı, ek biyokütle nedeniyle depolama kabı kenarına biyokütle yapışan için gerekli olabilir. </li><li> Barkodlu hazneye kurutulmuş biyokütle en az 50 mg aktarın (daha fazla malzeme kullanarak doğru karışması için iyidir). Santi-statik çanta ve alıcı huninin barkod doğru örnek izleme sağlamak için olabilir. </li><li> Katı rafları örneklerin sipariş yakından ilgilenerek, robot tartı üzerine yük hazneleri. Kullanılan plakaların sayısına dayalı dağıtım protokolü, tüm örnekleri içeren ve seçmek için yeterli reaktör plakaları yükleyin. </li><li> Robotik aside dayanıklı paslanmaz çelik 96 oyuklu plakalar içerisine (± 0.3 mg) kurutulmuş örneklerin 5 mg ağırlığında. Herhangi bir yerelleştirilmiş varyasyonları en aza indirmek için plaka etrafında dağıtılan her numunenin 3 çoğaltır tartın. </li><li> Tahlil performansını izlemek için iyi karakterize biyokütle standart malzeme 8 kontrol biyokütle örnekleri ekleyin. Birden plakalar için, birden fazla standart biyokütle silosu kullanılması tekrarlanan dağıtım döngüleri boyunca haznede eleme kaynaklanan partikül büyüklüğü kayması en aza indirecektir. Not: her bir plaka olarak, 3 kez tekrarlanmış, iyonu giderilmiş su ve enzim içeren 4 boşlukları ve 8 contro 24 numune olmalıdırls, daha önce karakterize standart biyokütle kullanarak. Plaka 4 köşe, her 3 köşe kuyuları şeker standartları için ayrılmıştır. </li><li> Serseri biyokütle parçacıkları için boş ve şeker standart kuyu kontrol edin ve varsa çıkartın. </li><li> Her bir oyuğa iyonu giderilmiş su, 250 ul ekleyin ve silikon yapışkan sırtlı, politetrafloroetilen (PTFE) bant ile plakaları mühür. </li><li> 1/8 &quot;havya ucu kullanarak, her plaka için her buhar portu (117 toplam) PTFE bandı delmek. Bir kılavuz olarak kapalı reaktör plaka üzerinde yığılmış boş bir levha kullanın ve PTFE filmi hareketini kısıtlamak için. </li><li> Sıkıca üst ve yığının altındaki plaka ve boş levha arasına 0.031 &quot;kalınlığında cam takviyeli PTFE contaları (buhar portlar için delikli önceden delinmiş) ile plakaları Kelepçe. 17.5 dakikada, veya arzu edilen şiddetine bağlı olarak diğer sıcaklık / zaman kombinasyonları için 180 ° C olarak ayarlandı buhar reaktörü kullanılarak numuneleri önceden işleme. </li><li> 50 ° &#39;ye serin reaktör plakalarıC deiyonize su ile sel. </li></ol></li><li> Enzimatik Saccharification <ol><li> 1.0 M sodyum sitrat, pH 5.0,% 8 (h / h) bir enzim çözeltisi içeren bir enzimatik sakarifikasyon çözelti hazırlayın. Reaktör plaka başına 5 ml hazırlayın. Not: belirli bir stok enzim çözeltisinin etkinliği ve protein içeriğine göre belirlenmelidir gerekli seyreltme. </li><li> Plakalar serin olduğunda, 20 dakika boyunca 1500 xg sallanan bir kova rotor onları santrifüj. Filmi sızdırmazlık çıkarın. Not: Bu plakalar ağır ve santrifüj özellikleri uyumluluk için kontrol edilmelidir. </li><li> Her bir oyuğa (g biyokütle başına 70 mg enzim)% 8 enzim stok çözeltisi, 40 ul ekle. </li><li> Yeni PTFE bandı ile kapatın. Manyetik plaka kelepçe içine kapalı plaka koyun. </li><li> Yavaşça ters çevirerek örnekleri (en az 15 kez) karıştırın ve 70 saat süre ile 50 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Sakarifikasyon sonucuna zaman çevirerek karıştırın ve 1500 x plakaları santrifüj20 dakika boyunca örn. </li></ol></li><li> Şeker Deneyi <ol><li> 6 glikoz ve 0,014 M sitrat tampon maddesi içinde ksiloz Birleştirilen kalibrasyon standartları 0 ila 0,750 mg / ml arasında değişen (pH 5.0) &#39;in bir dizi hazırlanması (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65 ve 0.75 mg / ml tavsiye edilir) ve 0-0,600 mg / ml (0, 0.1, 0.2, 0.35, mi önerilen 0,45 ve 0,6 mg /), sırasıyla glukoz ve ksiloz için. </li><li> Kit talimatlara göre glikoz oksidaz / peroksidaz (Gopod) ve ksiloz dehidrogenaz (XDH) reaktifler hazırlayın. </li><li> Bir pipet kullanarak, reaktör levhanın köşe oyuklara (12, toplam kuyu) bitişik 4 köşe kuyuları ve kenar kuyulardan sıvının 200 ul çıkarın. </li><li> Bir pipet kullanarak, 96 çukurlu bir polistiren düz tabanlı seyreltme plakası, her sıra için deiyonize su, 180 ul dağıtmak. 12 şeker standart ve köşe kuyu suyu katmayın (96 kanal kafasını kullanıyorsanız bu ipuçlarını kaldırın). </li><li> Bir pipet kullanarak, pl glükoz tahlil her oyuğuna 180 ul Gopod reaktif dağıtımyedi. </li><li> Bir pipet kullanarak, ksiloz deney plakasının her oyuğuna 180 ul XDH reaktif dağıtın. </li><li> Bir pipet kullanarak, seyreltme plaka 96 oyuklu plaka reaktörü 20 ul alikotları hidrolizat aktarın. Kuyular üst bölümünden Pipet biyokütle katı ve köşe kuyularda kalan sıvıyı önlemek için. En az 10 döngü ezilerek karıştırılır. </li><li> Bir pipet kullanarak, Seyreltme levhası köşe gözlere, iki kopya halinde, şeker standartları 110 ul transfer. </li><li> Bir pipet kullanarak, glikoz ve iksiloz gibi deney plakası seyreltme plakasından 20 ul alikotları aktarın. Ezilerek karıştırılır. </li><li> 30 dakika için oda sıcaklığında glukoz ve ksiloz deney inkübe edin. Dikkatle okumadan önce herhangi bir yüzey kabarcıkları kırmak. Kısaca plaka yüzeyinden devamlı olarak geçirilmesi bir ısı tabancası ile iyi çalışır. </li><li> Bir morötesi / görünen 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak, 510 nm&#39;lik dalga boyunda ölçülen ayarlamak ve reaktif boşluğa karşı absorbans kaydedin.Bu ölçüm, glükoz konsantrasyonuna orantılıdır quinonimine oluşumunu takip eder. Glukoz konsantrasyonu 1.3.1 hazırlanan kalibrasyon standartları göre kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır. </li><li> Bir morötesi / görünen 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak, 340 nm&#39;lik bir dalga boyuna ayarlanır ölçülen absorbansı kaydedin. Bu ölçüm, ksiloz konsantrasyonu ile orantılıdır NADH NAD + &#39;azalma izler. Ksiloz konsantrasyonu, 1.3.1 hazırlanan kalibrasyon standartları göre kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır. </li></ol></li></ol> PyMBMS 28 Kullanma Toplam Lignin ve Lignin Monomerik İçeriğin 2. Yüksek verim tayini <ol><li> Örnek hazırlama <ol><li> Öğütün ve adımları 1.1.1 ve 1.1.6-1.1.8 tarif edilen metotlar kullanılarak biyokütle ekstrakte edin. Bu taşlama ve deney denetimlerini kullanmak için standartların bir dizi ayıklanan içerir. Not: pyMBMS kuvEMENTS olmayan partikül boyutu bağlıdır, bu yüzden sadece pyMBMS protokolü kullanılarak, eğer, biyokütle hazırlama örneği &lt;, numune tutucuya 4 mm uyacak izin vermek üzere yürütülmelidir. </li><li> Yaklaşık 4 mg, küçük bir spatula bir dağıtıcı kullanılarak otomatik numune için tasarlanmış bir 80 ul paslanmaz çelik kabına hazırlanmış biyokütle (3 ila 5 mg tercih). </li><li> Analiz edilen örneklerin en az% 10 gibi Standartlar ve Teknoloji Ulusal Enstitüsü edinilebilir gibi kontrol standartları olduğundan emin olun (şeker kamışı küspe-8491; kavak-8492; çam-8493; ya buğday samanı-8494). Standart, daha önce, standart yöntemler kullanılarak karakterize edilmiştir Analiz edilecek numuneler benzer olan herhangi bir tür olabilir. </li><li> Rasgele nedeniyle zamanla olası spektrometre sürüklenme önyargıyı engellemek için cımbız kullanarak otomatik numune bardak içine numuneleri yükleyin. Not: Örneklerin Tipik randomizasyon yeniden rasgele ardından bir kez tüm örneklerde ölçümünü içerirYinelenen bir ölçüm için numune düzenin. Randomizasyon programları online olarak mevcuttur. </li><li> Standart bir delik yumruk kullanarak, el hiçbir bağlayıcı, Tip A / D cam elyaf levhalar cam filtre diskleri üretirler. , Cımbız ile yuvarlak cam elyaf filtre tutun numune kabının üzerine ortalamak ve deney süresince her fincan malzemeyi sınırlandırmak için 3,5 mm&#39;lik Allen anahtarı kullanarak numune içine itin. </li></ol></li><li> Enstrümantal Protokol <ol><li> Deney örnekleri için mevcut olabilir bileşiklerin bütün aralığı boyunca en yüksek yoğunluklarına sahip bilinen bir standart kullanılarak kütle spektrometresi kalibre edin. Tipik biyokütle örnekleri için, perflorotirbütilamin (PptBA) kullanın. </li><li> Bir gaz akış ölçer kullanılarak 0.9 L / dk helyum taşıyıcı gaz akış hızını ayarlayın. </li><li> 500 ° C&#39;lik bir piroliz sıcaklığı ve oto-ömekleyici yazılımı kullanılarak 350 ° C&#39;ye kadar bir arayüz sıcaklığına kadar otomatik numune fırın ayarlayın. Not: Bir 1/8 &quot;paslanmaz çelik ısıtmalıkütle spektrometresi otomatik örnekleyiciyi bağlayan ısı bant sarılmış transfer hattı 250 ° C&#39;de ısı kontrolörü kullanarak kontrol edilir. </li><li> Kütle spektrometresi veri toplama başlayın ve arka plan spektrumları koleksiyonu için yeterli veri elde etmek en az 60 saniye bekleyin. </li><li> 2.2.2 özellikleri ile otomatik otomatik örnekleyici yöntemini başlatın. Not: Otomatik örnekleyici otomatik örnekleyici fırına tek tek her bir örnek düşer. Toplam veri toplama süresi yaklaşık 1.5 dakika olduğu; Bununla birlikte, tipik bir 4 mg numunenin piroliz 30 saniye sonra tamamlanır. </li><li> 0,5 sn tarama hızında kütle spektrometresi yazılımı kullanarak her numunenin Tutanak toplam iyon içeriği (TIC). M / z 30 ile 450 arasındaki Kayıt yoğunlukları. Not: Tipik biyokütle bileşikleri 17 eV yumuşak iyonizasyon kullanın. Alet 1.000 m / z 1 büyük aralıklarla kaydedebilirsiniz; Ancak, tarama hızı bilgisayar CPU gücü ile sınırlı olacaktır. </li><li> Ma kullanarak spektrumları arka planı kaldırmaknual yazılımında özelliğini geliştirmek. Not: Veri toplama başında bazal 60 tarama kısmı ortalama bir arka plan değerini hesaplamak için kullanılır. Bu ortalama arka plan spektrumu kütle spektrometresi yazılım otomatik deney numune spektrumdan çıkarılır. </li><li> Bir veritabanı programı içine her bir numune için spektral verileri içeren kütle spektrometresi yazılımı tarafından oluşturulan tek sütun metin dosyası, ithalat ve tek bir veritabanında tüm örnekleri birleştirir. E-tabloya herhangi bir geçerli meta veriler ekleyin. Istatistiksel yazılım paketi içine biçimlendirilmiş verileri (tablo / CSV dosyası) İthalat ve pirolize örnek kitleler varyasyon için hesap spektrumları normalleştirmek anlamına gelir. </li><li> Ölçümlerde kullanılan çoğaltılmış standart numunelerin gruplandırma analiz etmek spektral verileri kullanarak bir ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirmek için bir istatistiksel yazılım paketi kullanımı yanı sıra, kimyasal sınıflandırılması ayrılmaz hangi doruklarına değerlendirmekyüklemelerinde bileşikler 28 arsa. PCA gruplar spektrumları benzerliği dayalı örnekler ve standartlar bir çek nedeniyle çalışma sırasında enstrüman sürüklenme deneysel hatayı ölçmek için izin verir: Not. </li><li> Lignin syringly (S) / guaiasil (G) oranının hesaplanması için, S maksimum alanları toplamı (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 ve 210) G doruklarının toplamı ile ve bölme 124, 137, 138, 150, 164, ve 178 de. </li><li> Toplam linyin içeriğini hesaplamak, m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 ve 210 ile birlikte lignin zirveleri Özetle. </li><li> Örneğin Klason lignin gibi toplam lignin tahmin edilmesi için standart bir yönteme pyMBMS ölçüm ölçekleme için, bir düzeltme faktörü hesaplanır. PyMBMS kullanarak standart numune için ölçülen toplam lignin içeriği ile bireysel standardın Klason lignin değerini bölün. </li><li> Veri kümesinde gibi tüm türler bu düzeltme faktörü uygulayın. Analiz biyokütle her türü için tekrarlayın. NOT: düzeltme faktörü önemli ölçüde analiz biyokütle S / G göre değişebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Perlack, R. D., Stokes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).</li><li>Henry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+5.">Ch. 5.</a> Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).</li><li>Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+plant+biomass+resources+available+for+replacement+of+fossil+oil.">Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil.</a> Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).</li><li>Furtado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+plants+for+biofuel+and+biomaterial+production.">Modifying plants for biofuel and biomaterial production.</a> Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Lignocellulosic+Biomass+Using+Analytical+Spectroscopy:+an+Evolution+to+High-Throughput+Techniques.">Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques.</a> Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).</li><li>Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioacidolysis+of+lignin:+comparison+with+acidolysis.">Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis.</a> J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).</li><li>DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+and+automatable+high-throughput+compositional+analysis+of+biomass.">Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).</li><li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+determination+of+glucan+and+xylan+fractions+in+lignocelluloses.">High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses.</a> Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).</li><li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignocellulose+recalcitrance+screening+by+integrated+high-throughput+hydrothermal+pretreatment+and+enzymatic+saccharification.">Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification.</a> Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).</li><li>Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+high-throughput+screening+system+to+identify+cellulosic+biomass,+pretreatments,+and+enzyme+formulations+that+enhance+sugar+release.">Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).</li><li>Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+sugar+content+in+biomass+hydrolysates+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).</li><li>Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+corn+stover+composition+and+sources+of+variability+via+NIRS.">Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).</li><li>Tucker, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourier+transform+infrared+quantification+of+sugars+in+pretreated+biomass+liquors.">Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).</li><li>Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multivariate+calibration+models+for+corn+stover+feedstock+and+dilute-acid+pretreated+corn+stover.">Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).</li><li>Ona, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+determination+of+wood+constituents+by+Fourier-transform+Raman+spectroscopy.">Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy.</a> J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).</li><li>Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+quantitative+method+to+assess+eucalyptus+wood+properties+for+kraft+pulp+production+by+FT-Raman+spectroscopy.">A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy.</a> J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).</li><li>Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+biomass+analysis.+New+tools+for+compositional+analysis+of+corn+stover+feedstocks+and+process+intermediates+from+ethanol+production.">Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, M., Zhao, J., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+different+chemical+pretreatments+of+corn+stover+for+enhancing+enzymatic+digestibility.">Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility.</a> Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).</li><li>Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+S/G+ratio+and+lignin+content+in+a+Populus.+family+influences+the+release+of+xylose+by+dilute+acid+hydrolysis.">Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+multivariate+analysis:+a+comparison+between+mid-infrared,+near-infrared,+and+Raman+spectroscopies+for+model+development.">High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).</li><li>Lupoi, J. S., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+woody+and+herbaceous+biomasses+lignin+composition+with+1064+nm+dispersive+multichannel+Raman+spectroscopy.">Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy.</a> Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+syringyl:guaiacyl+ratios+using+FT-Raman+spectroscopy.">Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling.">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li><li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus.">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li><li>Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy.">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).</li><li>Decker, S., Himmel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+17.+Reducing+the+effect+of+variable+starch+levels+in+biomass+recalcitrance+screening).">Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening).</a> Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).</li><li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass.">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aşağıdaki gibi yüksek verimli tarama deneyleri yaparken doğru ve tekrarlanabilir verilerini elde etmek için temel örnek hazırlama adımları şunlardır: Şeker Salma Deneyi: Genel olarak numuneler, birkaç düzine bir kerede birkaç bin arasında değişen sayıda hazırlanır. Her önemli bir adım, tipik olarak örnekler arasında hazırlanmasında değişimleri en aza indirmek için ileri doğru hareket önce, bütün numuneler için gerçekleştirilm...

Olmayan yenilenebilir yakıtlar ve bunlarla ilgili ürünlerin düşüşler küresel kaynağı olarak, bilim adamları bitki kökenli kaynaklardan 1 benzer yakıtlar ve kimyasallar oluşturmak için meydan oylandı. Bu çalışmanın önemli bir yönü, bitki türleri biyoyakıt ve biyomalzeme 2,3 üretilmesi için uygun olabilecek belirlemektir. Tipik olarak, bu besleme stokları lignin, selüloz ve hemiselüloz içeriği için değerlendirilir; ile de veya sonradan enzim sakarifikasyon olmadan, termal, mekanik ve / veya kimyasal ön yoluyla yapısızlaştırma (rekalsitrantların) kendi duyarlılık olarak. Daha detaylı bir analizi gerekiyordu lignin ve yarı selüloz parçacığına spesifik bileşim olarak uygun enzim aktivitelerini belirlemek için kullanılır. Özünde istenilen emtia biyokimyasal veya termokimyasal dönüşüm için ideal özelliklere sahip olmayan bitkilerin transgenik değişiklikler pot bir ölçüde genişletilmiş kaynağı ile araştırmacıların sağladıential hammaddeler 4. Küçük bir numune kümesi için oldukça yararlı ise, bir bitkinin kimyasal özelliklerini ölçülmesi için standart analitik metotlar, örnekler 5-7 yüzlerce ya da binlerce süratle taranması için uygun değildir. Burada tarif edilen yöntemler, HTP hızlı ve verimli bir termokimyasal ve / veya enzimatik degradasyona hücre duvarı rekalsitrantların değişiklikler için biyokütle varyantlarının çok sayıda değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu HTP tarama deneyleri burada tarif edilen dönüşüm ya da verim en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmış değil anlamak için önemlidir. Amaç, ilgili biyokütle örneklerinin içsel rekalsitrantların nispi farklılıkları belirlemektir. Bunun bir sonucu olarak, analiz adımları birçok amacı, maksimum dönüşüm hızını veya derecesini elde etmek için bir &quot;tipik&quot; biyokütle dönüşüm deneylerinde, farklıdır. Örneğin, daha düşük ön-muamele şiddeti ve daha kısa enzim hidrolizinden kat farklılık en üst düzeye çıkarmak için kullanılırörnekler arasında daha olgun. Pek çok durumda, nispeten yüksek enzim yükler önemli ölçüde sonuçlan saptıracaktır olabilir enzim etkinliği deneysel varyasyon, bağlı farkları azaltmak için kullanılır. Bitki hücre duvarlarına ve monomerik şekerlerin bileşimin belirlenmesi için hızlı teknikler enzimatik sakarifikasyon kızıl ötesi gibi titreşim spektroskopisi gibi robotik, özel, termo kimyasal uyumludur, 96 gözlü levhalar, ve standart laboratuar yöntemleri 8-11 arasında modifikasyon ve enstrümantal protokolleri (şunlardır açığa çıkan (IR), yakın kızıl ötesi (NIR) ya da Raman) ve nükleer manyetik rezonans (NMR), 12-17. Bu metodolojiler, deneysel azalmalara neden yüksek selüloz veya düşük lignin içeriğinin, ya da en yüksek glikoz, ksiloz, etanol vermesi beklenen olanlar, vb Bu yöntemler biyokütle ve sarf küçük miktarlarda istihdam downscaled analizler sağlamıştır ile hammaddeleri izole anahtarıdır Gider 18 </s&gt; yedekleyin. Bu yöntem yaklaşımın diğer bir özelliği, çeşitli deneysel koşullar hızlı olabilir ve aynı zamanda bazı durumlarda değerlendirilmiştir. Örneğin, ön-muamele stratejileri veya enzim kokteyl, farklı çeşitli en uygun deney parametreleri hızla tespit kullanılabilir sağlayan test edilebilir. Örneğin, mısır koçanından 9, kavak 8,10, şeker kamışı küspe 8 ve switchgrass 8 gibi popüler besleme stokları, başarılı bir şekilde, bu HTP yöntemler kullanılarak değerlendirilmiştir. Toplam lignin ve lignin monomerik kompozisyon da yaygın biyokütle özellikleri ölçülür. Lignin içeriğindeki azalmalar polisakkaritler 19,20 enzimatik sindirilme artırmak için gösterilmiştir. Lignin monomerik oranı (genellikle syringly / guaiacyl (S / G) içerik olarak rapor) bu rolü soruşturma altında hala bitki hücre duvarının yıkılmasında oynar. Bazı raporlar belirttiler S / G azalmalardiğer çalışmalar zıt eğilim 19,22 açıklayacak ederken oranı hidroliz 21 aşağıdaki artan glikoz verimi yol açtı. Lignin ve monomerleri değerlendirmek için yüksek kapasiteli yöntemleri titreşim çok değişkenli analiz ile birleştiğinde spektroskopisi (IR, NIR ve Raman 23-26) ve piroliz moleküler ışın kütle spektrometresi (pyMBMS) 27,28 sayılabilir. Biyokütle taranması için HTP yöntemleri geliştirirken, birkaç ayrılmaz hususlar göz önünde tutulması gerekir. Bir önemli yönü yönteminin karmaşıklığı olduğunu. Teknik için gerekli beceri düzeyi nedir? Kemometrik analizler, örneğin, inşa değerlendirilmesi ve tahmini modeller korumak için özel beceriler gerektirir. Standart yöntemler istenmeyen hazırlayıcı veya veri analiz adımları sergilemek veya zehirli reaktifler kullanır. Modellerin geliştirilmesi, yeni veri modelin sağlamlığı artırmak için zamanla modele dahil edilmiştir devam eden bir süreçtir. Başka bir consideration maliyet tasarrufu ve önerilen yüksek verimlilik yöntemlerinin deneysel analiz sürelerini azalmıştır. Yöntem oldukça hızlı, ancak oldukça maliyetli ise, çok sayıda laboratuar kabul etmek için uygulanabilir bir teknik olabilir. Bu yazıda gösterildiği yöntemler verim özelliklerini güçlendirmek için modifiye standart teknikler türevleridir. Bu protokoller nicel öngörü modellerinin geliştirilmesi gerektirmeden ilgi biyokütle özelliklerini ölçmek. Standart modelleri geliştirmek için kullanılan analizleri ile güçlü bir korelasyon sergilerken Bu öngörü yöntemleri beri bu tekniklerin önemli bir nitelik olduğunu, aslında numunelerde ilgi miktarını ölçmek gibi doğru değildir. Esasen standart tezgah ölçekli analitik yöntemlerin sürümleri küçülttüm Kullanılan yöntemler ise doğruluk ve hassasiyet hız ve performans için işlem görmektedir. Çoğunlukla, bu sonucun küçük hacimli pipetleme ve tartı yüksek hatalar nedeniyle; ve artan sörneklem büyüklüğü olarak geniş heterojenite azalır. Büyük örnek setleri ekranlı ve mukayese edilebilir olsa ayrı kampanyalar arasında ve tezgah ölçekli sonuçlarına karşılaştırmalar yaparken, büyük bir özenle olunmalıdır. En zaman alıcı adımlar biyokütle fiziksel manipülasyon içerir. Taşlama örnekler örnekler arasındaki değirmen temizleme dahil numune başına birkaç dakika sürebilir. Elle, boşaltma ve temizleme bunker yükleme ve doldurma ve çay poşetleri ve örnek çanta boşaltma da çok emek yoğundur. Her adım bir dakika veya daha fazla sürebilir iken, numunelerin yapıyor binlerce birçok saatler hatta günler sürebilir. Robotlar yaklaşık 3 ila 4 saat veya 6 -1 tabak gün 8 robot biyokütle ile tipik bir reaktör plakasını yükleyebilirsiniz -1. Bu durum, aynı zamanda, test edilecek Çeşidi ve biyokütle miktarı olarak kullanılan hassas parametrelere bağlıdır. Reaktörü su plakaları Benzin, seyreltik asit veya enzim hızlı bir sıvı kotarma robotu kullanılarak yapılır. PBir plaka yığıtı (1 20 reaktör plakalar) için yeniden tedavi tertibatı, soğuma sırasında 1 ila 3 saat sürer, ve demontaj dahildir. Enzim hidroliz 3 gün sürer ve şeker analiz sonuçları tahlil tamamlamak ve okumak için hazırlık süresi yaklaşık 1 saat artı reaktör plaka başına 10 dakika gerektirir. Set Tedavi öncesi ve analiz gün bir haftalık program sürekli olarak haftada ~ 800 1000 örnekleri tahlil insan bileşeni için tek saat ve hafta sonu çabalarını en aza indirerek, makul bir çalışma programı barındırır ve işlenmesi için izin verir. Maksimum verim çok donanım (robotlar, reaktörler tabak, vb) ve ne kadar &quot;yazılım&quot; (yani, personel) el işi yapmak için kullanılabilir başta nasıl birçok faktöre bağlıdır. Pratik üst sınır 2500 3.000 örnekleri / hafta; Ancak, çıkış 7 gün-bir hafta çalışma ve çok sayıda öğrenci stajyerleri ve teknisyenleri gerektirir. Buna karşılık, HPLC ile 3000 örnekleri sam yaklaşık 125 gün gerektirecektirple analizi artı elle analizden önce reaktörler ve filtreleme numuneleri içine örnekleri tartı ek emek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wiley mill</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-static bags</td>
			<td>Minigrip*</td>
			<td>MGST4P02503</td>
			<td>2.5x3&#34;, multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tin-coated copper wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8871K84</td>
			<td>0.016&#34; diameter, bend-and-stay wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tea-bags</td>
			<td>Herbco</td>
			<td>press n&#39; brew teabags</td>
			<td>3.5x5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gluco-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Spirizyme Fuel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Liquozyme SC DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">
			<table cellpadding="0" cellspacing="0">
				<tbody>
					<tr>
						<td>sodium acetate trihydrate</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof (95%) ethanol</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hoppers</td>
			<td>Freeslate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well C-276 Hastelloy plates</td>
			<td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td>
			<td>N/A (custom built)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; soldering iron tip</td>
			<td>Sears</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone-adhesive backed Teflon tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>5180</td>
			<td>3&#34; wide (36-yard rolls)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme solution</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td></td>
			<td>Cellic CTec2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable, polystyrene 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>or equivalent; multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase/peroxidase&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose dehydrogenase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel sample cups</td>
			<td>Frontier Laboratories</td>
			<td>PY1-EC80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass fiber sheets</td>
			<td>Pall</td>
			<td>66227</td>
			<td>8x10&#34; sheets--circles punched with standard hole punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monterey Pine Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Straw Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8494</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Kimyasal ve termal ön ve daha sonra enzim sakarifikasyon birleşik etkisi, deney sonunda serbest glukoz ve ksiloz kütlesinin bir fonksiyonu olarak ölçülür. Sonuçlar biyokütle gramı başına serbest glukoz ve ksiloz miligram cinsinden rapor edilir. Bu genellikle, başlangıç ​​malzemesinin kompozisyon analizi dayanan yüzde teorik verimin olarak rapor edilir laboratuvar ölçekli deneyler, bildirilen verilerin taban tabana zıttır. Henüz haftada örneklerin binlerce kompozisyon analizi yürütmek için pr...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release at JoVE.com

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

9.9K Görüntüleme.  National Renewable Energy Laboratory. Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Video: High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Çevre

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

Potansiyel Toprak Ekstrasellüler Enzim Aktivitelerinin Yüksek verim Florimetrik Ölçme

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Marul Potansiyel Kuraklığa tolerans Yarı-Yüksek Verim Tarama (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) Germplazm Koleksiyonlar

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of a variety of lignocellulosic feedstocks. Here we demonstrate the use of these low-cost protic ILs in the deconstruction of lignocellulosic biomass (Ionosolv pretreatment), yielding cellulose and a purified lignin. In the most generic process, the protic ionic liquid is synthesized by accurate combination of aqueous acid and amine base. The water content is adjusted subsequently. For the delignification, the biomass is placed into a vessel with IL solution at elevated temperatures to dissolve the lignin and hemicellulose, leaving a cellulose-rich pulp ready for saccharification (hydrolysis to fermentable sugars). The lignin is later precipitated from the IL by the addition of water and recovered as a solid. The removal of the added water regenerates the ionic liquid, which can be reused multiple times. This protocol is useful to investigate the significant potential of protic ILs for use in commercial biomass pretreatment/lignin fractionation for producing biofuels or renewable chemicals and materials.

The pretreatment of lignocellulosic biomass with protic low-cost ionic liquids is shown, resulting in a delignified cellulose-rich pulp and a purified lignin. The pulp gives rise to high glucose yields after enzymatic saccharification.

Düşük maliyetli İyonik Sıvılar ile Lignoselülozik Biyokütle tedavi öncesi

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown energy crops (e.g., miscanthus, and switchgrass) that are available in large quantities to produce biofuels, biochemicals, and animal feed. Plant polysaccharides (i.e., cellulose, hemicellulose, and pectin) embedded within cell walls are highly recalcitrant towards conversion into useful products. Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment that increases accessibility of polysaccharides to enzymes for hydrolysis into fermentable sugars. These released sugars can be converted into fuels and chemicals in a biorefinery. Here, we describe a laboratory-scale batch AFEX process to produce pretreated biomass on the gram-scale without any ammonia recycling. The laboratory-scale process can be used to identify optimal pretreatment conditions (e.g., ammonia loading, water loading, biomass loading, temperature, pressure, residence time, etc.) and generates sufficient quantities of pretreated samples for detailed physicochemical characterization and enzymatic/microbial analysis. The yield of fermentable sugars from enzymatic hydrolysis of corn stover pretreated using the laboratory-scale AFEX process is comparable to pilot-scale AFEX process under similar pretreatment conditions. This paper is intended to provide a detailed standard operating procedure for the safe and consistent operation of laboratory-scale reactors for performing AFEX pretreatment of lignocellulosic biomass.

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment technology that can convert lignocellulosic biomass (e.g., corn stover, rice straw, and sugarcane bagasse) into a highly digestible feedstock for both biofuels and animal feed applications. Here, we describe a laboratory-scale method for conducting AFEX pretreatment on lignocellulosic biomass.

Amonyya Lif Genleşme (AFEX) Lignoselülozik Biyokütle Ön Arıtma

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

Pentosan analizi için yeni bir yöntem mevcut Jüt biyokütle ve şeker monomerleri asidik iyonik sıvı kullanarak içine onun dönüşüm

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Yüksek işlem hacmi, analiz işleme parametrelerini ve Mısır (Zea mays L.) beslenme nitelikleri için Microscale Protokolü

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Bir yüksek-den geçerek tahlil tarafından otomatik fenotipik profil oluşturma Caenorhabditis elegans ve kimyasal toksisitesi tahmin için

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

Yüksek işlem hacmi Siderophore filtreleme dışında çevre örnekleri: bitki doku, toplu topraklar ve rizosferde topraklar

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...