Bu protokol, adacık engraftasyonunun beyaz yağ dokusuna mekanizmasını değerlendirmeyi mümkün kılar. Bu yağ kaplı adacık nakli yönteminin en büyük avantajı, teknik olarak çoğaltılmasının kolay olmasıdır. Yöntem diğer hastalık modellerine uygulanabilir.
Örneğin, bir fare kanser modeli oluşturmak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren, Fukuoka Üniversitesi'nde Doçent olan Naoaki Sakata olacak. Diseksiyon mikroskobu altında, asinar ve fibröz dokular da dahil olmak üzere pankreas sindirimlerinden ekstra adacık bileşenlerini çıkarmak için bir P 200 mikro pipet kullanın.
Ardından, tek asinar hücreleri filtrelemek için bir hücre süzgeci kullanın. Filtrelenmiş adacıkları, sığır serumu veya albümin ile desteklenmiş uygun kültür ortamı veya tampon çözeltisi içeren yeni bir kültür kabına aktarın ve adacıkları merkeze yerleştirmek için çanağı döndürün. Bir P 200 mikro pipet kullanarak, tek tek adacıkları uygun bir toplama tüpüne seçin.
50 mililitrelik plastik tüpün üzerine yeni bir 40 mikrometre hücre süzgeci yerleştirin. Adacıkları ve tek asinar hücreleri ayırmak üzere adacıkları süzgecin içine eklemek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Süzgeci, kültür ortamı veya sığır serumu veya albümin ile desteklenmiş uygun bir tampon çözeltisi içeren yeni bir 60 veya 100 mililitre boyutunda işlenmemiş kültür kabı üzerinde ters çevirmek için forseps kullanın.
Adacıkları yeni bir kültür kabına yıkamak için taze ortam veya tampon kullanın, ardından kültür kabına yaklaşık 20 mililitrelik toplam hacme ulaşmak için yeterli ortam veya tampon ekleyin. Adacıkları mikroskop altında sayın ve adacık sayısını, donör hayvanların sayısına göre bireysel 1,5 mililitrelik plastik santrifüj tüpleri arasında eşit olarak bölün. Adacıkları oda sıcaklığında bir dakika boyunca 2, 100 G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Yaklaşık 20 ila 30 mikrolitre artık çözelti tipik olarak tüpte kalacaktır. Enfeksiyonu önlemek için saçları karından çıkardıktan sonra fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Karın ve kasık bölgesi dezenfekte edildikten sonra alt medyan bölgede cildi keserek yaklaşık iki santimetre uzunluğunda bir cilt kesisi oluşturur.
Sol karın duvarını forseps veya retraktörlerle sıkıştırın ve cerrahi alanı sabitlemek için dokuyu farenin sol tarafına çekin. İnce ve kalın bağırsağı farenin sağ tarafına hareket ettirmek için pamuklu çubuk kullanın. Karın boşluğundaki sol epidermal beyaz yağ dokusu sol kasık bölgesinde bulunur.
Epidermal beyaz yağ dokusunu ve sol testisi karın dışına doğru harekete geçirin ve dokuyu gerin. Tüm adacık hacmini 1,5 mililitrelik bir tüpten toplamak için bir P 200 mikro pipet kullanın ve toplandıktan sonra tüpte adacık kalmamasına dikkat edin. Toplanan adacıkların pipetin ucuna yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
Mikro pipet ucunu şişmiş yağ dokusunun üzerine hafifçe yerleştirin ve uçtaki ortamın veya tamponun aşırı yıkanmasını önlemeye özen gösterin. Adacıkları dikkatlice doku üzerine tohumlayın. Tohumlamadan sonra, adacıkların diseksiyon mikroskobu altında doğru yerleştirildiğini onaylayın.
Adacıkları epidermal beyaz yağ dokusu ile örtün, ardından sol testisi epizomal beyaz yağ dokusunun altına yerleştirin ve dokuları intraperitoneal boşluğa geri döndürün. 4-o dikiş kullanarak cildi iki kat halinde kapatın. İşiniz bittiğinde, fareyi bir ısı lambasının altına yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar izleyin.
Yağ kaplı adacık transplantasyonunun transplantasyon etkinliğini, intraperitoneal adacık transplantasyonundan sonrakiyle karşılaştırmak için, kontrol alıcısı diyabetik hayvanların sol parakolik boşluğundaki periton üzerine aynı sayıda adacık implante edildi. Yağ kaplı adacık nakli yapılan farelerin kan şekeri düzeylerinin, intraperitoneal adacık nakli yapılan farelere kıyasla kademeli ve anlamlı olarak azaldığı gözlenmiştir. İntraperitoneal glukoz tolerans testi transplantasyondan bir ay sonra yapıldı.
Yağ kaplı adacık transplantasyonu olan farelerde kan şekeri, intraperitoneal adacık nakli yapılan farelerde gözlenenden daha düşük seviyelerde tutulmuştur. Histolojik inceleme, epidermal beyaz yağ dokusuna adacık engraftmanını değerlendirmek için kullanıldı. Yağ kaplı adacık nakli alan hayvanlarda, hematoksilin eosen boyaması, epidermal beyaz yağ dokusu içinde adacıkların varlığını ortaya koymuştur.
Ek olarak, insülin pozitif adacıkların floresan konjuge antikor boyaması, tüm alıcı farelerin epidermal beyaz yağ dokusu içinde von Willebrand faktör pozitif mikro damarların saptanmasını kolaylaştırmıştır. Bu prosedürde başarılı olmak için, adacıkların pipetin ucuna tamamen yerleşmesine izin verdiğinizden emin olun ve dökülmeden yağ dokusuna tohumlayın.
