Actin sitoskeletonun ana bileşenidir ve nöronlar da dahil olmak üzere hücresel morfoloji ve fizyolojinin çeşitli yönlerini kritik olarak düzenler. Aktin, monomerik globüler G-actin veya polimerik filamentli F-actin olmak üzere iki formu arasındaki dengede meydana gelir. Akinin polimerizasyon durumu, hem aksin bağlayıcı proteinler hem de kendi çeviri sonrası düzenlemesi ile birden fazla düzeyde sıkı bir şekilde düzenlenir.
Internöronal sinaptik temaslarda, F-actin seviyelerindeki dinamik değişiklikler, hem pre hem de post sinaptik terminallerde sinyalizasyon ve plastisiteyi kontrol eden önemli bir düzenleyici olaydır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, aktüer disfonksiyon birkaç nöropatolojik durumla bağlantılıdır. Son gelişmeler nöronal fizyoloji ve patofizyolojide aksin bilgi zenginliğine yol açmıştır.
Ancak çok şey hala bilinmiyor ve odaklanılması gerekiyor. Bu bağlamda, phalloidin floresan analogları akrin araştırmalarında önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Bu phallotoxin özellikle filamentli akine bağlanır ve bu nedenle F-aktilin miktarlarının ve patofizyolojik durumlardaki değişiminin doğrudan bir ölçüsü olarak kullanılabilir.
Bu çalışma, toptan homojenatlar ve beyin dokularından biyokimyasal olarak izole edilmiş sinaptik terminaller gibi ex-vivo biyolojik örneklerde aktin polimerizasyon durumunun değerlendirilmesi için hızlı ve verimli bir florometrik test sunun sunun. Not olarak, test diğer hücre ve doku tiplerine ve ilişkili fizyolojik fenomenlerine uygulanabilir. Bu çalışmada kullanılan tamponların tarifleri için lütfen ayrıntılı metne bakın.
Sıçanlardan veya insan deneklerden alınan beyin dokusu örnekleri Potter-Elvehjem cam tüpünde homojenize edildi ve 10 cilt homojenizasyon tamponunda buz üzerinde pestle edildi. Sinaptozom hazırlığı için homojenat önce yavaş bir hızda, daha sonra ham sinaptozomal mitokondriyal fraksiyon elde etmek için daha yüksek bir hızda döndürüldü. Bu ham fraksiyondan zenginleştirilmiş sinaptozomlar, süreksiz bir sakkaroz gradyanını takiben elde edildi.
Sinaptoneurosomal preparat için homojenatlar sırayla iki 100 mikron ve bir 5 mikron filtreden geçirildi. Protein tahmini Bradford reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi ve numuneler Krebs tamponunda mL protein başına iki ila üç miligram konsantrasyonda 50 mikrolitrelik son hacimde seyreltildi. Sinaptozomlar veya sinaptoneurozomlar olmak üzere izole sinaptik terminallerin uyarılması, 37 derecede hücre dışı potasyumda kısa bir 30 saniyelik bir artışla gerçekleştirildi.
Bunun için, numunelere 15 milimolar nihai konsantrasyona bir azı dişi potasyum klorür eklendi. Homojenatlar uyarılmamış ve depolarize sinaptik parçalar% 2.5 glutaraldehit ile sabitlenmiştir, gerekli hacim % 25 glutaraldehit stok çözeltisi ilavesi ile. Numuneler oda sıcaklığında iki, üç dakika kukübe edilmiş.
Fiksatif, 20.000 G'de santrifüjleme ile beş dakika boyunca çıkarıldı. Numuneler daha sonra oda sıcaklığında iki ila üç dakika boyunca mL sodyum borohidrit başına %0,1 Triton X-100 ve 1 mg içeren Krebs tamponunda resüspensyon ile permeabilizasyon için ilerlenmiştir. Permeabilizasyon tamponu santrifüjleme ile tekrar çıkarıldı ve pelet yüzeysel olarak Krebs tamponu ile yıkandı ve 500 mikro phalloidin birimine karşılık gelen 1X Alexa Fluor 647 phalloidin içeren Krebs tamponunda yeniden canlandı.
Bağlamanın karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika devam etmesine izin verildi. Aşırı ilişkisiz phalloidin, beş dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjleme ile numunelerden çıkarıldı ve peletler krebs tamponu ile yüzeysel olarak yıkandı ve sinaptozomların veya sinaptoneurozomların yüzdürücülüğünü korumak için 0.32 molar sakkaroz içeren Krebs tamponunda tekrar yeniden doğdu. Floresan falloidin bağlı numuneler, bir plaka okuyucuda florometrik okuma için 96 kuyu siyah plakasında dağıtıldı.
Ekscitasyon ve emisyon dalga boyları sırasıyla 645 nanometre ve 670 nanometre olarak belirlendi. Her deney seti için Krebs tamponunda 0.32 molar sakkaroz içeren farklı miktarlarda Alexa Fluor 647 phalloidin dahil ettik. Yıkama adımları sırasında numune kayıplarını hesaba katmak için, numuneler siyahtan şeffaf 96 kuyu plakasına aktarıldı.
Numunelerin yakalanması daha sonra 440 nanometrede incelendi. Floresan phalloidinin tutulması, numunelerdeki aktüan filamentlerin veya F-aktibant seviyelerinin miktarı ile doğru orantılıdır. 50 ila 200 mikrogram protein aralığında phalloidin bağlanmasının doğrusallığı gözlendi.
İlkenin bir kanıtı olarak, Latrunculin A tarafından aktilin filamentlerinin farmakolojik bozulmasının yanı sıra KCl aracılı izole sinaptik terminallerin uyarılması ile F-aktilin oluşumunun uyarılması kullanılarak F-aktilin depolimerizasyon modellerinde testimizin etkinliğini de test ettik. Bağlı phalloidinden kaynaklanan floresan emisyonu, standart doğrusal eğriden üretilen bağlı phalloidin birimleri olarak ifade edilebilir ve kontrol örneklerine göredir. Şekil 4 için F-actin düzeyleri bağlı phalloidin mikro birimleri olarak ifade edilir.
Öte yandan, Şekil 5 için depolarize sinaptik parçalardaki F-actin seviyeleri, bozulmamış örnekleri kontrole göre ifade edilir. Aktüen filamentlerin veya F-actin'in analizi için sağlam, zaman verimli ve yüksek verimli bir test ve 96 kuyu plakası formatına uygun fizyolojik ve patofizyolojik durumlardaki değişikliklerini açıklıyoruz. Test, mevcut alternatif protokollerden çok daha hızlıdır ve tek başına veya mevcut immünhistokimya ve Batı şişkinliği bazlı tahlillerle birlikte aktüen ile ilgili çalışmalarda önemli bir araç olarak hizmet edebilir.
