Актин является основным компонентом цитоскелета и критически регулирует несколько аспектов клеточной морфологии и физиологии, в том числе в нейронах. Актин встречается в равновесии между двумя его формами, мономерным глобулярным G-актином или полимерным нитевидным F-актином. Статус полимеризации актина жестко регулируется на нескольких уровнях как актин-связывающими белками, так и собственной постпереводной регуляцией.
В межнейрональных синаптических контактах динамические изменения в уровнях F-актина являются ключевым регуляторным событием, контролирующим передачу сигналов и пластичность как на пре-, так и на постсинаптических терминалах. Неудивительно, что актиновая дисфункция связана с несколькими нейропатологическими состояниями. Последние достижения привели к богатству знаний об актине в физиологии нейронов и патофизиологии.
Однако многое еще неизвестно и должно быть сосредоточено на этом. В связи с этим флуоресцентные аналоги фаллоидина зарекомендовали себя как основной инструмент в исследованиях актина. Этот фаллотоксин специфически связывается с нитевидным актином и, следовательно, может быть использован в качестве прямой меры количеств F-актина и его изменения в патофизиологических состояниях.
В этом исследовании представлен быстрый и эффективный флуорометрический анализ для оценки статуса полимеризации актина в биологических образцах ex-vivo, таких как оптовые гомогенаты и биохимически изолированные синаптические терминали из тканей мозга. Следует отметить, что анализ может быть применен к другим типам клеток и тканей и связанным с ними физиологическим явлениям. Рецепты буферов, используемых в этом исследовании, см. в подробном тексте.
Образцы мозговой ткани крыс или людей гомогенизировали в стеклянной трубке Potter-Elvehjem и пестик на льду в 10 объемах буфера гомогенизации. Для получения синаптосом гомогенат вращали сначала с медленной скоростью, а затем с более высокой скоростью для получения сырой синаптосомальной митохондриальной фракции. Обогащенные синаптосомы из этой сырой фракции получали по прерывистому градиенту сахарозы.
Для синаптоневросомного препарата гомогенаты последовательно пропускали через два 100-микронного и один 5-микронный фильтр. Оценка белка проводилась с использованием реагента Брэдфорда, а образцы разбавляли в буфере Кребса при концентрации от двух до трех миллиграммов на мл белка в конечном объеме 50 микролитров. Стимуляция изолированных синаптических терминалей, либо синаптосом, либо синаптоневросом, проводилась путем кратковременного 30-секундного увеличения внеклеточного калия на 37 градусов.
Для этого в образцы добавляли один молярный хлорид калия до конечной концентрации 15 миллимоляров. Гомогенаты нестимулировали и деполяризованные синаптические фрагменты фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом, путем добавления необходимого объема 25%-го раствора глутарового альдегида. Образцы инкубировали в течение двух, трех минут при комнатной температуре.
Фиксатор удаляли центрифугированием при 20 000 Г в течение пяти минут. Затем образцы перерабатывали для пермеабилизации путем ресуспенсии в буфере Кребса, содержащем 0,1% тритона X-100 и 1 мг на мл боргидрида натрия в течение двух-трех минут при комнатной температуре. Буфер пермеабилизации снова удаляли центрифугированием, а гранулу поверхностно промывали буфером Кребса и повторно суспендировали в буфере Кребса, содержащем 1X фаллоидин Alexa Fluor 647, соответствующий 500 микроединицам фаллоидина.
Связыванию разрешалось продолжать в течение 10 минут при комнатной температуре в темное время суток. Избыток несвязанного фаллоидина удаляли из образцов центрифугированием при 20 000 Г в течение пяти минут, а гранулы поверхностно промывали буфером Кребса и повторно суспендировали в буфере Кребса, содержащем 0,32 молярной сахарозы для поддержания плавучести синаптосом или синаптоневросом. Флуоресцентные образцы, связанные с фаллоидином, дозировали в 96-хорошую черную пластину для флуорометрического считывания в пластинчатом считывателе.
Длины волн возбуждения и излучения были установлены на уровне 645 нанометров и 670 нанометров соответственно. Для каждой области экспериментов мы включали различные количества фаллоидина Alexa Fluor 647 в буфер Кребса, содержащий 0,32 молярной сахарозы. Чтобы учесть любые потери образцов на этапах промывки, образцы были перенесены с черной на прозрачную 96-ю пластину скважины.
Захват образцов затем исследовался на 440 нанометрах. Удержание флуоресцентного фаллоидина прямо пропорционально количеству актиновых нитей или уровням F-актина в образцах. Линейность связывания фаллоидина наблюдалась в диапазоне от 50 до 200 мкг белков.
В качестве принципиального доказательства мы также проверили эффективность нашего анализа в моделях деполимеризации F-актина с использованием фармакологического нарушения актиновых нитей латрункулином А, а также стимуляции образования F-актина опосредованием KCl стимуляции изолированных синаптических терминалей. Флуоресцентное излучение связанного фаллоидина может быть выражено в виде либо единиц связанного фаллоидина, полученных из стандартной линейной кривой и относящихся к контрольным образцам. На рисунке 4 уровни F-актина выражаются в виде микроуниг связанного фаллоидина.
С другой стороны, для Фиг.5 уровни F-актина в деполяризованных синаптических фрагментах выражены относительно контрольных неполяризованных образцов. Мы описываем надежный, эффективный по времени и высокопроизводительный анализ для анализа актиновых нитей, или F-актина, и его изменений в физиологических и патофизиологических состояниях, подходящих для формата пластины 96 скважин. Анализ намного быстрее, чем существующие альтернативные протоколы, и может служить важным инструментом в исследованиях, связанных с актинами, либо отдельно, либо в сочетании с существующей иммуногистохимией и вестерн-блоттингом.
